CN113295682A - 一种基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的属于酚类检测技术领域，具体为一种基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法，其包括：(1)阵列传感器的制备；(2)不同酚类污染物的判别分析；(3)同种酚类物质不同浓度的判别分析；(4)两种酚类物质混合后的判别分析；(5)实际样品中酚类物质的判别分析。该基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法，基于纳米酶体系构建阵列传感器，检测灵敏度高、可扩展性强，实现了不同酚类污染物的区分以及分析，特异性强、准确度高，并且，本发明将比色阵列与化学计量学算法相结合，利用特征波长构建传感器，使得传感器的建立更具理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及酚类检测技术领域，具体为一种基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法。
背景技术
酚类化合物是工农业生产中的基本原料，具有较强毒性和不易降解性，且大多数酚类污染物在水中的溶解度较高，这增加了其在水体中的迁移能力，使其逐渐成为水体中的主要污染物之一，因此对于水中酚类污染物的检测具有至关重要的意义。目前，检测水中酚类物质的方法主要有色谱法、分光光度法、荧光分析法和电化学分析法等。但以上方法仪器设备庞大，检测成本高，耗时长，需要对样品进行萃取分离等复杂预处理过程，需要专业人员操作，需要大量的人力物力，检测时间长且仪器价格昂贵，需要专业技术人员维护，检测成本高，不适于现场检测，不能满足种类繁多的农产品检测需求。比色方法可以很好的填补其他方法样品前处理复杂、仪器昂贵以及操作复杂等不足，非常适合现场快速分析检测，且比色法兼具其他方法在检测过程中的准确性和灵敏性，已逐步成为当前的研究热点。
纳米酶，是兼具类酶催化活性和纳米特征的纳米材料，与天然酶相比，其克服了天然酶存在的诸多缺陷，具有高稳定性、低成本、易于大规模生产、可长期储存等优点。将纳米酶与比色传感器以及化学计量学算法相结合，构成阵列，不仅可以实现对酚类污染物的高灵敏性检测，还可以实现对具有相似结构的酚类污染物的快速区分，这为酚类污染物的检测提供了一个新思路。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
因此，本发明提供了一种低成本、灵敏度高的用于不同酚类污染物的检测方法，构建了基于纳米酶的阵列传感器检测体系，为不同种类酚类物质检测提供了新方法，传感器阵列是多维传感技术的一种，由多个传感单元组成，如同由多个功能组件构建的芯片一样，其中，单一传感单元对不同物质的响应程度会有所不同，而不同的传感单元对同一物质也会有不同程度的响应，因此通过不同传感单元对目标物响应产生的特征图谱以及相互之间的差异可实现对样品的特异性区分。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：
一种基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法，其包括：利用具有多酚氧化酶活性的纳米酶对不同酚类化合物的催化特性差异，结合特征波长选取和判别分析技术，进行酚类化合物的识别分析，具体步骤如下：
(1)阵列传感器的制备：以不同时间和不同时间下的特征光谱作为阵列传感器的各传感单元，制得具有多传感单元的传感器阵列；
(2)不同酚类污染物的判别分析：将酚类物质的水溶液加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液混合，产生显色反应，通过酶标仪读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件，运行化学计量学算法进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图；
(3)同种酚类物质不同浓度的判别分析：配置四种不同浓度的苯酚溶液，加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液混合，产生显色反应，通过仪器读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图；
(4)两种酚类物质混合后的判别分析：将两种酚类物质同比例混合，混合后的溶液加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液混合，产生显色反应，通过仪器读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图；
(5)实际样品中酚类物质的判别分析：将酚类物质的标品溶液加入到污水中得到实际样品的体系，溶液加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液混合，产生显色反应，通过仪器读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图。
作为本发明所述的基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法的一种优选方案，其中：多酚氧化酶是由5'－鸟苷酸二钠溶液10mM、氯化铜溶液50mM、Tris-HCL缓冲液100mM，pH＝8.5以及超纯水按照2:1:1:6的比例混合混合液用离心机在10,000rpm下离心5min合成的；产生的沉淀用超纯水洗3次。最终将沉淀均匀分散在超纯水中，得到合成好的纳米酶。
作为本发明所述的基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法的一种优选方案，其中：步骤(2)中所述酚类物质分别为对苯二酚、邻苯二酚、间苯二酚、苯酚、间苯三酚、对氯苯酚浓度为1mg/ml，2,4－二氯苯酚浓度为0.2mg/ml；步骤(3)所述苯酚在反应体系中的浓度分别为1、10、100、1000μg/mL；步骤(4)所述两种酚类物质同比例混合分别为苯酚+2,4-DP、间苯三酚+对氯苯/对苯二酚+间苯三酚、邻苯二酚+苯酚、对苯二酚+2,4-DP和间苯二酚+对氯苯酚。
作为本发明所述的基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法的一种优选方案，其中：步骤(2)中所述酚类物质分别为对苯二酚、邻苯二酚、间苯二酚、苯酚、间苯三酚、对氯苯酚浓度为1mg/ml，2,4－二氯苯酚浓度为0.2mg/ml；步骤(3)所述苯酚在反应体系中的浓度分别为1、10、100、1000μg/mL；步骤(4)所述两种酚类物质同比例混合分别为苯酚+2,4-DP、间苯三酚+对氯苯酚、对苯二酚+间苯三酚、邻苯二酚+苯酚、对苯二酚+2,4-DP和间苯二酚+对氯苯酚。
与现有技术相比：本发明基于纳米酶体系构建阵列传感器，检测灵敏度高、可扩展性强，实现了不同酚类污染物的区分以及分析，特异性强、准确度高，并且，本发明将比色阵列与化学计量学算法相结合，利用特征波长构建传感器，使得传感器的建立更具理论依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为遗传算法计算特征波长结果图，最终得到每个时间段下的排名前五的特征波点；
图2为本发明对相同浓度不同种类分类污染物与阵列传感器响应的偏最小二乘线性判别分析图谱；
图3为本发明不同浓度的苯酚与阵列传感器响应的偏最小二乘线性判别分析图谱；
图4为本发明对两种酚类物质同比例混合与阵列传感器响应的偏最小二乘线性判别分析图谱。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
一种基于纳米酶比色传感器的酚类污染物检测和区分方法，具体步骤如下：
(1)阵列传感器的制备：以核苷酸与铜配位结合纳米酶的漆酶性质构建比色阵列，各传感单元是由反应时间和最优波长组成。通过化学计量学算法——遗传算法计算得到反应体系在全波段的下最优反应波点5个，与反应时间构成波长×时间(5×3)的阵列传感器的各传感单元，从而制得具有多传感单元的传感器阵列。
(2)不同酚类污染物的判别分析：将酚类物质的水溶液加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液(酶底物，产生比色信号)混合，产生显色反应，通过仪器读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图。
(3)同种酚类物质不同浓度的判别分析：配置四种不同浓度的苯酚溶液，加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液(酶底物，产生比色信号)混合，产生显色反应，通过仪器读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图。
(4)两种酚类物质混合后的判别分析：将两种酚类物质同比例混合，混合后的溶液加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液(酶底物，产生比色信号)混合，产生显色反应，通过仪器读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图。
(5)实际样品中酚类物质的判别分析：将酚类物质的标品溶液加入到污水中得到实际样品的体系，溶液加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液(酶底物，产生比色信号)混合，产生显色反应，通过仪器读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图。
步骤(1)中所述的纳米酶液由5'－鸟苷酸二钠溶液(10mM)、氯化铜溶液(50mM)、Tris-HCL缓冲液(100m M，pH＝8.5)以及超纯水按照2:1:1:6的比例混合混合液用离心机在10,000rpm下离心5min。产生的沉淀用超纯水洗3次。最终将沉淀均匀分散在超纯水中，得到合成好的纳米酶(GMP-Cu)。
步骤(1)中所述的反应时间分别为30min、60min和120min，将三个时间下的吸光度值分别构成矩阵，利用MATLAB运行遗传算法，得到三个时间下的特征光谱数值，选择次数最多的五个光谱点构成阵列，其分别是30min：383、394、398、414、465nm；60min：360nm、366、390、495、498nm；120min：377、381、407、421、509nm。
步骤(2)所述酚类物质分别为对苯二酚、邻苯二酚、间苯二酚、苯酚、间苯三酚、对氯苯酚浓度为1mg/ml，2,4－二氯苯酚浓度为0.2mg/ml。
步骤(3)所述苯酚在反应体系中的浓度分别为1、10、100、1000μg/mL。
进一步地，步骤(4)所述两种酚类物质同比例混合分别为苯酚+2,4-DP，间苯三酚+对氯苯酚，对苯二酚+间苯三酚，邻苯二酚+苯酚，对苯二酚+2,4-DP间苯二酚+对氯苯酚。
在实施方案中，所述传感单元包括96孔板，所述的96孔板为全透明微孔板，但不限于此。
本发明的原理是：核苷酸与铜配位形成金属有机框架具有漆酶性质，可以氧化酚类物质，生成醌，加入显色剂后产生明显的颜色变化。基于以上性质，构建基于纳米酶的阵列传感器。
实施例1实现对多种酚类污染物的识别与区分
按照实施方式(1)制作反应体系，反应30min，60min，120min。
传感单元1：反应30min时特征光谱，分别为383、394、398、414、465nm。
传感单元2：反应60min时特征光谱，分别为360nm、366、390、495、498nm。
传感单元3：反应120min时特征光谱，分别为377、381、407、421、509nm。
将实施方式(1)中配置的反应体系取一定体积置入96孔板中，通过酶标仪读取所述用于检测酚类物质的阵列传感器的传感单元下的吸光度值，实验平行10次，得到的数据导入MATLAB软件进行偏最小二乘判别分析，得到不同酚类物质的主成分的得分图，不同种类的酚类物质可以被正确的识别和区分开来。
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
Claims (4)
1.一种基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法，其特征在于，利用具有多酚氧化酶活性的纳米酶对不同酚类化合物的催化特性差异，结合特征波长选取和判别分析技术，进行酚类化合物的识别分析，具体步骤如下：
(1)阵列传感器的制备：以不同时间和不同时间下的特征光谱作为阵列传感器的各传感单元，制得具有多传感单元的传感器阵列；
(2)不同酚类污染物的判别分析：将酚类物质的水溶液加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液混合，产生显色反应，通过酶标仪读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件，运行化学计量学算法进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图；
(3)同种酚类物质不同浓度的判别分析：配置四种不同浓度的苯酚溶液，加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液混合，产生显色反应，通过仪器读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图；
(4)两种酚类物质混合后的判别分析：将两种酚类物质同比例混合，混合后的溶液加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液混合，产生显色反应，通过仪器读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图；
(5)实际样品中酚类物质的判别分析：将酚类物质的标品溶液加入到污水中得到实际样品的体系，溶液加入步骤(1)所述的阵列传感器阵列中，并与其中的检测液混合，产生显色反应，通过仪器读取检测液的紫外吸收值，并将不同酚类物质在体系中的显色结果进行数字化处理，得到的数据导入Matlab软件进行判别分析，得到不同种类酚类物质判别结果的得分图。
2.根据权利要求1所述的一种基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法，其特征在于，多酚氧化酶是由5'－鸟苷酸二钠溶液10mM、氯化铜溶液50mM、Tris-HCL缓冲液100mM，pH＝8.5以及超纯水按照2:1:1:6的比例混合混合液用离心机在10,000rpm下离心5min合成的；产生的沉淀用超纯水洗3次。最终将沉淀均匀分散在超纯水中，得到合成好的纳米酶。
3.根据权利要求1所述的一种基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法，其特征在于，阵列传感器的制备：将纳米酶溶液，MES缓冲液100mM，pH＝7，4－氨基吡啶10mg/ml，超纯水以及酚类物质溶液构成体系；对于对苯二酚、邻苯二酚、间苯二酚、苯酚、间苯三酚、对氯苯酚，在1ml的体系中各溶液添加量分别为纳米酶100μL、MES缓冲液100μL、4－氨基吡啶100μL、超纯水100μL和酚溶液100μL；对于2,4－二氯苯酚，在1ml的体系中各溶液添加量分别为纳米酶100μL、MES缓冲液100μL、4－氨基吡啶100μL、超纯水200μL和酚溶液500μL。
4.根据权利要求1所述的一种基于多酚氧化酶活性纳米酶的酚类化合物分析方法，其特征在于，步骤(2)中所述酚类物质分别为对苯二酚、邻苯二酚、间苯二酚、苯酚、间苯三酚、对氯苯酚浓度为1mg/ml，2,4－二氯苯酚浓度为0.2mg/ml；步骤(3)所述苯酚在反应体系中的浓度分别为1、10、100、1000μg/mL；步骤(4)所述两种酚类物质同比例混合分别为苯酚+2,4-DP、间苯三酚+对氯苯酚、对苯二酚+间苯三酚、邻苯二酚+苯酚、对苯二酚+2,4-DP和间苯二酚+对氯苯酚。
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