CN113293218B - 一种用于选择斑点叉尾鮰增重性状的snp分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于选择斑点叉尾鮰增重性状的SNP分子标记及应用，通过全基因组关联分析（GWAS）技术方法，首次在斑点叉尾鮰基因组上筛选到位于20号染色体上的2个与增重性状相关联的SNP分子标记。该SNP位点的多态性与斑点叉尾鮰的增重性状显著关联，所述的SNP分子标记连锁遗传，具有增重优势的斑点叉尾鮰基因型为TG/TG型。
Description
技术领域
本发明属于鱼类生长性状的分子标记选择技术领域，涉及一种用于选择斑点叉尾鮰增重性状的SNP分子标记及应用，具体涉及2个与斑点叉尾鮰增重性状相关的SNPs分子标记及其应用。
背景技术
随着高通量测序技术的进步和成本的降低，基于基因组测序的GWAS研究逐渐应用于动植物各种性状遗传解析。GWAS在育种领域的应用最早在奶牛中开展，Daetwyler 等（2008）、Pryce 等（2010）先后在奶牛基因组中筛选出与奶牛泌奶和泌奶持续力等性状相关的SNPs位点。在水产动物基因组学领域，最近几年GWAS研究方法已发展成为最为热点的研究方向之一，为进一步解析控制水产动物复杂数量性状的遗传基础和挖掘育种潜在功能基因和分子标记提供了无限可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于选择斑点叉尾鮰增重性状的SNP分子标记及其应用，通过全基因组关联分析首次在斑点叉尾鮰第20号染色体上筛选到2个与增重性状相关联的SNP分子标记。
本发明主要利用BGISEQ-500平台对来自不同家系，但初始体质量相当的斑点叉尾鮰选育群体开展全基因组重测序，并将全基因组SNPs变异与增重性状进行关联分析，挖掘控制增重性状的重要SNP分子标记。为了减小环境因素对实验结果的影响，所有的家系子代在相同的环境中养殖，且投放的试验鱼具有相似的规格。本发明获得的SNP标记可以用于斑点叉尾鮰分子标记辅助育种，选择具有增重优势的个体作为苗种繁育的亲本。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：用于选择斑点叉尾鮰增重性状的SNP分子标记，其位于rrp44基因第9个内含子中。
优选的，第一个SNPs标记位于20号染色体的第14 657 971个碱基处，突变类型为
C/G，命名为g. 20.14657971 C>T，其核苷酸序列如序列SEQ ID NO .1所示；和/或，第二个
SNPs标记位于20号染色体的第14 658 012个碱基处，突变类型为C/T，命名为g.
20.14658012 C>G，其核苷酸序列如序列SEQ ID NO .2所示。
| 序号 | 序列 |
| SEQ ID NO .1 | TACTAACTAGSCTCTTTAAAA |
| SEQ ID NO .2 | GTTGAAAACTYTGATTTTTAC |
优选的，所述第一个SNPs标记的序列第11位碱基Y是C或T，所述第二个SNPs标记的序列第11位碱基S是C或G。
优选的，SNP位点的基因型为TG和/或CC型。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种用于选择斑点叉尾鮰增重性状的SNP分子标记的筛选方法，其包括以下步骤，1) 提取待测鱼样本的DNA，构建斑点叉尾鮰基因组重测序文库，在BGISEQ-500测序平台上对所有文库进行PE150双端测序；2) 获得待测鱼样本的每月增重量；3) 测序数据过滤与SNPs分型：测序的原始数据经过滤和质控后，与斑点叉尾鮰参考基因组比对，使用GATK软件检测SNPs，ANNOVAR软件注释捕获到的变异，VCFtools软件确定遗传变异的遗传位置；4) 生长性状全基因组关联分析：使用SNP&Variation Suitv8.5.0软件的单位点混合线性模型GWAS（EMMAX）进行增重性状的全基因组关联分析，获得目标SNP分子标记。
优选的，将获得的所述目标SNP分子标记使用SHEsis软件进行连锁分析。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种用于选择斑点叉尾鮰增重性状的SNP分子标记的应用。
优选的，用于斑点叉尾鮰分子标记辅助育种，选择具有增重优势的个体作为苗种繁育的亲本。
本发明的有益效果如下：
本发明运用全基因组关联分析（Genome wide association study，GWAS）技术方法在斑点叉尾鮰全基因组范围内筛选得到与其增重性状相关的SNPs分子标记，进一步采用基于Sanger测序的基因分型技术在另外一个选育群体中对2个SNPs分子标记与斑点叉尾鮰增重性状相关性进行验证。为斑点叉尾鮰增重性状分子标记辅助育种提供了2个新的SNP分子标记。
附图说明
图1为三种基因型斑点叉尾鮰的每月增重统计，注：**p<0.01; *p<0.05。
具体实施方式
实施例1与斑点叉尾鮰增重性状相关的SNP分子标记的筛选
1. 养殖实验
不同斑点叉尾鮰家系幼鱼独立养殖180日龄后，从各家系中选择规格相当的幼鱼50尾，记录其体重数据，并在每条鱼腹腔内注射一枚带有12位识别码的PIT电子标签。伤口完全愈合后，所有实验鱼投放至一口0.2 hm2大小的池塘内混合养殖，养殖过程中严格执行“定时、定点、定量”投喂原则，。
2. 实验样品采集
养殖一年后，捕获试验鱼，再次记录每条鱼的体重数据，同时采集试验斑点叉尾鮰尾鳍组织用于DNA提取。根据养殖前后体重数据，计算每条鱼的每月增重量。
3. 基因组DNA的提取与检测
从试验鱼的尾鳍中提取基因组DNA，制备斑点叉尾鮰全基因组DNA样品。分别使用Qubit和1%琼脂糖凝胶电泳对样品进行质控，合格的DNA（总量>3 µg；浓度>30 ng/µL；OD260/OD280=1.80 ~ 2.00）用于下一步测序文库构建。
1.文库构建与测序
使用Covaris E220（Covaris, Brighton, UK）超声波将每个样品基因组DNA打断成50 bp ∼ 800 bp的DNA片段。使用Agencourt AMPure XP beads磁珠试剂盒（Beckman,Krefeld, Germany）进一步钓取100 bp ~ 300 bp DNA片段。然后将钓取的DNA片段末端修复，并在3’端添加dATP以获得粘性末端。将带有dTTP尾的接头序列连接到每个样品DNA片段的两端，以区分各个样品。然后使用滚环扩增技术将单链环状DNA扩增8个循环。按照以下步骤进行单链环化处理：PCR产物与一个特殊分子一起热变性，该特殊分子与PCR产物的一条特殊链反向互补，并用DNA连接酶连接单链分子。剩余的线性分子用核酸外切酶消化，最终得到单链环状DNA，303个样品最终混合构建19个测序文库。在BGISEQ-500测序平台上对所有文库进行PE150双端测序。
2.测序数据过滤与SNPs分型
BGISEQ-500测序平台产生的原始数据下机后开始进行生物信息学分析。为了提高序列质量，使用Trimmomatic（version 0.36）软件对原始数据进行过滤。每个样本的正向和反向FASTQ序列作为输入文件，软件的参数为“LEADING:3 TRAILING:3SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:75”。获得的高质量reads用于后续分析。在303个样本的clean reads中鉴定全基因组SNPs变异。使用BWA软件（bwa mem -k 32）将高质量的clean reads与斑点叉尾鮰参考基因组序列进行比对。将SAM格式文件导入SAMtools 软件进行序列排序和合并，结合Picard软件删除重复reads。使用GATK软件（version 2.4-9）的“UnifiedGenotyper”模块在有效的BAM文件上检测SNPs。根据参考基因组的基因注释文件，使用ANNOVAR软件注释捕获到的变异。最后，使用VCFtools软件（version 0.1.10）确定所有变异的遗传位置。
3.生长性状全基因组关联分析
使用SNP&Variation Suit v8.5.0软件的单位点混合线性模型GWAS（EMMAX）进行生长性状的全基因组关联分析。EMMAX（Efficient Mixed Model Association expedited）统计检验方法在解释样本结构（分层和相关性）方面优于主成分分析。在本研究中，使用该项技术校正由于亚群结构和个体间的相关性而产生的混杂效应。在EMMAX中，根据基因型数据计算个体间n×n遗传关系矩阵。使用的模型为：y = X β + Z u + e，式中的y是表型值的n×1向量，X是包括SNPs和年龄（月）在内的固定效应的n×f矩阵，β是表示固定效应系数的q×1向量，Z是随机效应与表型值、β固定效应系数相关的n×t矩阵，u为随机动物效应，e为残差效应。
4.结果分析
测序共产生3.69Tb原始数据，平均每个样本12.18Gb。经对原始下机数据过滤统计，去除 测序接头barcode序列和低质量测序数据后，产生3.64Tb clean data，平均每个样本12.01 Gb(6.8～26.20Gb)，Q20和Q30平均值分别为97.81％和93.05％。将clean reads与斑 点叉尾鮰参考基因组进行比对，平均mapping率为94.85％，范围为90.05％～96.99％。原始 数据过滤成分统计、clean reads碱基质量分布、clean reads碱基含量分布结果说明本次基因 组重测序各项质量均较高，可以满足后续分析。将每个样品cleanreads与参考基因组序列比 对，总共获得12 045 859个原始SNPs，最终从中筛选5 641 711个所有样品共有SNPs。
使用EMMAX software将全基因组中5 641 711个SNPs标记与每月增重量进行GWAS分析。15个标记与每月体重增加量（MWG）性状相关（P≤1×10−6），其中位于20号染色***置14 657 971和14 658 012的两个SNPs与每月增重呈极显著相关（P≤1×10−8）（图1），两个SNP均位于rrp44基因第9个内含子中。第一个SNP突变类型为C/T，命名为g. 20.14657971 C>T；第二个SNPs，突变类型为C/G，命名为g. 20. 14658012 C>G，导致多态性。
表1 与斑点叉尾鮰增重性状相关的SNP分子标记
| SNP位置 | 染色体 | 参考碱基 | 变异碱基 | 最小等位基因频率 | P 值 |
| 14658012 | 20 | C | G | 0.20130 | 1.97E-09* |
| 14657971 | 20 | C | T | 0.19970 | 1.45E-08* |
注：*P<1 E-07
使用SHEsis软件进行两个SNPs位点的连锁分析，结果表明两个位点连锁遗传，存在两种单倍体基因型，即TG和CC，导致多态性。各基因型个体的增重数据统计结果表明TG/TG型个体的增重性状极显著性优于基因型为CC/CC型个体（p<0.01），显著性优于基因型为CC/GT的个体（p<0.05），结果如图1所示。
本实施例提供的SNP分子标记筛选方法包括：
1) 实验样品采集：采集试验斑点叉尾鮰尾鳍组织用于DNA提取；
2) 生长数据的测定：测定养殖前后斑点叉尾鮰体重数据，计算每条鱼的每月增重量；
3) 基因组DNA的提取与检测：从试验鱼的尾鳍中提取基因组DNA，制备斑点叉尾鮰全基因组DNA样品，并检测其相关质量值；
4) 文库构建与测序：使用合格的DNA样品构建斑点叉尾鮰基因组重测序文库，在BGISEQ-500测序平台上对所有文库进行PE150双端测序；
5) 测序数据过滤与SNPs分型：测序的原始数据经过滤和质控后，与斑点叉尾鮰参考基因组比对。使用GATK软件检测SNPs，ANNOVAR软件注释捕获到的变异，VCFtools软件确定遗传变异的遗传位置；
6) 生长性状全基因组关联分析：使用SNP&Variation Suit v8.5.0软件的单位点混合线性模型GWAS（EMMAX）进行增重性状的全基因组关联分析，从中选取极显著关联的SNP分子标记。
为了验证挖掘的2个SNP分子标记的可靠性，对另一个斑点叉尾鮰选育群体进行了增重测定和基于Sanger测序的SNP分型，进一步证实了上述2个SNP位点的多态性与斑点叉尾鮰增重性状极显著关联(p<0.01)，由于上述2个SNP标记连锁遗传，因此可以使用其中的1个SNP标记对斑点叉尾鮰增重性状进行选择和改良。
实施例2与斑点叉尾鮰增重性状相关的SNP分子标记的验证
1.养殖实验与样本采集
在斑点叉尾鮰鱼苗开口后，将来源于不同家系的斑点叉尾鮰鱼苗在大小为3亩的池塘中混合养殖18个月，养殖方式同实施例1。随机选择201尾称量其体重，并采集尾鳍组织。
2.基因组DNA的提取与检测
从试验鱼的尾鳍中提取基因组DNA，分别使用Qubit紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳对样品进行质控，合格的DNA（浓度>30 ng/µL；OD260/OD280=1.80 ~ 2.00）用于下一步SNP分型。
3.SNP分型
应用NCBI中Primer BLAST功能设计同时扩增两个SNP位点（g. 20.14657971 C>T和g. 20. 14658012 C>G）的引物（SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4）。PCR扩增使用2 × TaqPlus Master Mix（Dye Plus）试剂盒 (南京诺唯赞生物科技有限公司)，反应体系为：2×Taq Master Mix 10 μL；基因组DNA 1 μL；10 μM引物各0.5 μL；ddH2O 7 μL。
扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。
将上述PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。电泳结束后，将凝胶置于紫外凝胶检测仪上观察电泳结果，确定每个样品扩增条带数量及大小。合格的PCR扩增产物使用ABI3730测序仪进行双向Sanger测序，测序所用引物与PCR扩增引物相同。使用Chromas软件读取Sanger测序峰图，记录每个样本在两个SNP位点（g. 20.14657971 C>T和g. 20.14658012 C>G）的基因型。
4.体重性状与SNP关联分析
每个样本在两个SNP位点（g. 20.14657971 C>T和g. 20. 14658012 C>G）成功分型后，将体重性状与各样本基因型进行关联分析。结果如表2所示，表明TG/TG型个体的体重极显著性高于基因型为CC/CC型个体（p<0.01），显著性高于基因型为CC/GT的个体（p<0.05）。单倍体纯合子基因型TG/TG具有增重优势。
表2 斑点叉尾鮰体重性状与3种基因型关联分析结果
| 基因型 | 体重 |
| CC/CC | 943.28 ± 266.29a |
| CC/TG | 983.95 ± 244.94a |
| TG/TG | 1083.06 ± 306.77b |
序列表
<110> 江苏省淡水水产研究所
<120> 一种用于选择斑点叉尾鮰增重性状的SNP分子标记及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tactaactag sctctttaaa a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgaaaact ytgattttta c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgatatggac accgacctga g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggtaaagct cgactgtggt g 21
Claims (2)
1.用于获得斑点叉尾鮰增重性状的SNP分子标记的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物包括序列为SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示的引物，所述SNP分子标记位于rrp44 基因第9个内含子中，用于选择斑点叉尾鮰增重性状，第一个SNPs标记位于20号染色体的第14657971个碱基处，突变类型为C/T，命名为g.20.14657971 C>T，其核苷酸序列如序列SEQ ID NO .2所示；和/或，第二个SNPs标记位于20号染色体的第14658012个碱基处，突变类型为C/G，命名为g.20. 14658012 C>G，其核苷酸序列如序列SEQ ID NO .1所示，两个SNP位点组成TG和/或CC两种单倍体基因型。
2.斑点叉尾鮰增重性状的SNP分子标记的的应用，其特征在于：用于斑点叉尾鮰分子标记辅助育种，选择具有增重优势的个体作为苗种繁育的亲本。
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