CN113292632B - 一种转基因植物外源蛋白提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种转基因植物外源蛋白提取纯化方法，涉及转基因植物外源蛋白提取纯化和食用安全鉴定技术领域；S1:植物前处理：将植物组织洗净擦干后并去除叶梗和粗脉；S2：植物总蛋白提取：将植物组织经液氮冷冻粉碎，通过蛋白提取试剂得到总蛋白；S3：植物蛋白初步分离：利用超滤管超滤，分离蛋白；S4：电泳分离蛋白：蛋白凝胶后进行电泳分离蛋白；S5：利用蛋白切胶仪器进行切胶；S6：从凝胶上回收蛋白；S7：蛋白复性；S8：蛋白鉴定。现有技术中蛋白提取纯化方法周期长、成本高不具备通性的技术问题，通过电泳分离蛋白的方式，实现周期短，两个月即可，大大提高工作效率；一万多的成本即可；该方法适用于动植物中各种目的蛋白的分离纯化，具有通用性。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白提取纯化技术领域，更具体的说，本发明涉及一种转基因植物外源蛋白提取纯化方法。
背景技术
转基因植物是将特定的外源目的基因转移到受体生物中，外源基因表达的外源蛋白发挥生物学作用。外源蛋白的安全性需要经过试验证明，开展安全性试验首先需要从植物中提取纯化外源性蛋白，针对蛋白开展试验研究。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，需根据蛋白的特性选择合适的纯化方法来提高获得的蛋白的纯度和数量。
现有蛋白纯化的方法：蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如RNA、DNA等分开，常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，常用的方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等；
现有蛋白纯化方法的缺点：一是周期长，因为每一种蛋白都需要单独摸条件，所以周期长达半年以上；二是成本高，每一种蛋白需要不同的层析柱，耗材成本、人工成本均较高；三是方法不具备通用性。
发明内容
本发明旨在于解决现有技术中蛋白提取纯化方法周期长、成本高不具备通性的技术问题。
本发明的目的与功效，由以下具体技术手段所达成：
一种转基因植物外源蛋白提取纯化方法，其步骤在于，
S1：植物前处理：将植物组织洗净擦干后并去除叶梗和粗脉；
S2：将植物组织经液氮冷冻粉碎，通过蛋白提取试剂得到总蛋白；
S3：植物蛋白初步分离：利用超滤管超滤，分离蛋白；
S4：电泳分离蛋白：蛋白凝胶后进行电泳分离蛋白；
S5：利用蛋白切胶仪器进行切胶；
S6：从凝胶上回收蛋白；
S7：蛋白复性；
S8：蛋白鉴定。
一种转基因植物外源蛋白提取纯化方法的装置，包括电泳槽、槽盖，电泳槽内设有胶床，胶床上端设有接线柱，接线柱包括有正极接线柱和负极接线柱，胶床两侧设有玻璃板组件，玻璃板组件将电泳槽内部分隔三组内槽，电泳槽内部位于玻璃板组件外侧的前后端均设有可旋转挤压锁紧玻璃板组件的压辊组件，电泳槽顶部开口处开合设有槽盖，槽盖上端设有与接线柱电性连接的连接线。
优选的，胶床呈“U”状，胶床上端前后侧均设有向外延伸的凸缘，电泳槽顶部前后侧对应凸缘设有限位槽一，凸缘与限位槽一契合。
优选的，胶床内部左右两侧均设有U状的限位条，玻璃板组件包括内玻璃板和外玻璃板，内玻璃板与外玻璃板组合形成凝胶槽，内玻璃板高度高于外玻璃板，内玻璃板前后侧固定有凸起的侧板，侧板中心设有高度与外玻璃板高度一致的限位槽二，内玻璃板顶部设有注胶口，注胶口靠近胶床中心一侧高度偏低，内玻璃板靠近外玻璃板一侧与外玻璃板同一高度处设有入胶口，注胶口与入胶口连通，内玻璃板与限位条紧密贴合。
优选的，玻璃板组件远离限位条一侧下端与胶床形成开口槽，开口槽与凝胶槽连通，开口槽外侧设有通过压辊组件转动进而移动闭合或打开开口槽的胶块，胶块远离玻璃板组件一侧与电泳槽的内壁之间固定有2组伸缩杆组件。
优选的，压辊组件包括转辊、压层、把手和中心轴，转辊内中心设有上下贯穿的中心轴，转辊通过中心轴转动设置于电泳槽内底部，转辊外侧设有包裹转辊四分之三面积的压层，压层为橡胶材质，中心轴上端固定有把手，且把手与中心轴组成“T”状，把手旋转时与电泳槽顶部、凸缘以及玻璃板组件顶部相接。
优选的，电泳槽内底部位于中心轴内侧均设有可转动的从动轴，从动轴上端与中心轴下端均固定有齿轮，且齿轮之间啮合卡接，伸缩杆组件包括有齿条杆和活塞杆，活塞杆固定在电泳槽的内壁上，齿条杆套接在活塞杆上端，齿条杆与从动轴上端齿轮啮合卡接。
优选的，电泳槽内正对应外玻璃板的侧壁上端前后均设有水平延伸至外玻璃板一侧的限位柱组件，限位柱组件包括弧形板，弧形板内外弧均以中心轴为轴心点旋转形成，把手长度大于中心轴至弧形板外弧距离的两倍长度，弧形板上端设有弧形状的开口，开口内部设有弧形的弧形杆，弧形杆上端滑动连接有限位柱，弧形杆上端位于限位柱与玻璃板组件之间套接有复位弹簧。
优选的，电泳槽一侧设有一组锁扣板，另一侧设有两组锁扣板，锁扣板呈L状，锁扣板外侧螺纹连接有螺栓，槽盖一侧设有一组对接孔，另一侧设有两组对接孔，对接孔与螺栓对应设置。
有益效果：
1、周期短，两个月即可，大大提高工作效率；成本低，一万多的成本即可；通用性，该方法适用于动植物中各种目的蛋白的分离纯化。
2、通过顺时针转动把手，把手带动中心轴顺时针转动，中心轴带动转棍转动，转棍则带动压层顺时针转动压住外玻璃板，从而使外玻璃板紧密贴合内玻璃板，同时中心轴通过齿轮与齿轮之间的啮合带动从动轴逆时针转动，从动轴通过齿轮带动齿条杆推动胶块往开口槽内移动从而堵住开口槽，同时把手转动压住内玻璃板，使内玻璃板下部紧密贴合胶床，即可在电泳槽内部进行凝胶操作，大大缩短操作时间，并能够防止玻璃板组件在移动过程中出现气泡的问题，且在凝胶过程中不易污染操作台面。
3、凝胶后，通过逆时针转动把手，压层会脱离外玻璃板，把手另一端波动限位柱在弧形杆上端移动，使得压层脱离外玻璃板时，限位柱能够压住外玻璃板，从而防止外玻璃板在没有挤压时松动，防止凝胶过程中产生气泡影响电泳，当需要拆卸玻璃板组件时，可以逆时针转动把手，通过复位弹簧作用，限位柱能够复位。
附图说明：
图1为本发明的电泳槽结构示意图。
图2为本发明的电泳槽***结构示意图。
图3为本发明的玻璃板组件结构示意图。
图4为本发明的电泳槽俯视结构示意图。
图5为本发明的胶块连接结构示意图。
图6为本发明的限位柱组件结构示意图。
图1-6中：电泳槽1、限位槽一101、胶床2、凸缘21、玻璃板组件3、内玻璃板31、侧板311、限位槽二312、注胶口313、入胶口314、外玻璃板32、压辊组件4、转辊41、压层42、把手43、中心轴44、槽盖5、连接线51、拉手52、对接孔53、锁扣板6、螺栓61、胶块7、齿条杆71、活塞杆72、开口槽8、正极接线柱9、负极接线柱10、限位条11、限位柱组件12、弧形板121、开口122、弧形杆123、限位柱124、从动轴13。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-6，一种转基因植物外源蛋白提取纯化方法，其步骤在于，
S1：植物前处理：将植物组织洗净擦干后并去除叶梗和粗脉；
S2：植物总蛋白提取：将植物组织经液氮冷冻粉碎，取液氮冻存的植物组织，放入冰冻的研钵内研磨至粉末状，注意使组织一直处于冰冻状态，每500ul冷的提取液中加入3ul蛋白稳定剂和2ul蛋白酶抑制剂,混匀后置冰上备用；将研磨好的组织转移到EP管中，按每200mg植物组织加500ul的比例加提取试剂，混匀后冰上放置20分钟，其间可数次颠倒混匀，以便蛋白溶解。
研磨后冰上或2°C冰箱静置45分钟；
在4°C，10000rpm以上条件下离心15-20分钟；
将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到总蛋白；
S3：植物蛋白初步分离：利用超滤管进行超滤，分离蛋白；
选取适当规格的超滤管，加入PBS没过滤膜，7500g离心5min，润洗超滤管。
倒掉超滤管中的PBS，加入要超滤浓缩的蛋白样品，7500g离心15min至截留部分剩余200-300ul液体。向上层截留住的液体中加入4ml PBS,混匀后7500g离心min至截留部分剩余200-300ul液体。重复以上步骤两次，取出最后一次截留住的200-300ul液体，收集即所需蛋白样品，进行后续实验。
S4：电泳分离蛋白：将总蛋白置于玻璃板组件3的凝胶槽内凝胶，凝胶完成后，将缓冲液倒入电泳槽1及其胶床2与玻璃板组件3形成的立槽中，最后利用电泳槽1电泳分离蛋白；
将蛋白样品按照SDS-PAGE凝胶电泳要求，按步骤进行凝胶电泳，尽量将溴芬蓝指示剂跑到凝胶底部，以便蛋白按照分子量大小进行充分分离。
S5：利用蛋白切胶仪器进行切胶；
切取染色孔胶进行考马斯亮蓝染色，然后将此胶条放回到在整体胶中原来的位置，通过显色胶条上的蛋白条带找到在未染色胶上对应区域，并切取含目的蛋白条带的PAGE胶（尽可能地把多余的胶切除，否则会影响回收效率）。
S6：从凝胶上回收蛋白；
将切下的、重量不超过1克的胶块粉碎成细小的碎片，用自备的15mL塑料离心管收集这些破碎的凝胶颗粒。将适量（2-3ml）蛋白胶纯化溶液与之混合，4°C摇晃洗脱过夜；10000 g离心10分钟，转移上清到新的10-15mL的塑料离心管中，注意不要吸取碎胶；加入5倍体积（10-15ml）的预冷的蛋白沉淀溶液，摇晃混匀，-20°C放置至少10-30分钟；室温12,000 g离心5-20分钟，弃上清；室温充分晾干，得到的沉淀即为回收的蛋白质。
S7：蛋白复性；
依据回收蛋白量，加入适量8M尿素复性蛋白，于-80℃保存，以备后用。
S8：蛋白鉴定。
依据《转基因生物及其产品食用安全检测——外源基因异源表达蛋白质等同性分析导则》（农业部1485号公告-17-2010）进行蛋白鉴定。
一种转基因植物外源蛋白提取纯化方法的装置，包括电泳槽1、槽盖5，电泳槽1上端开口处盖合有槽盖5，电泳槽1内卡合设置胶床2，胶床2上端固定有接线柱，接线柱包括有正极接线柱9和负极接线柱10，胶床2两侧设有玻璃板组件3，玻璃板组件3将电泳槽1内部分隔三组内槽，位于玻璃板组件3外侧内槽相通，电泳槽1内部位于玻璃板组件3外侧的前后端均转动连接有可旋转挤压锁紧玻璃板组件3的压辊组件4，槽盖5底部设有与接线柱卡合的插槽，插槽内有金属垫片，槽盖5上端固定有与金属垫片电性的连接线51，胶床2内部左右两侧均固定连接有U状的限位条11，玻璃板组件3结构具体为：包括内玻璃板31和外玻璃板32，内玻璃板31与外玻璃板32组合形成凝胶槽，内玻璃板31高度高于外玻璃板32，内玻璃板31前后侧固定有凸起的侧板311，侧板311中心设有高度与外玻璃板32高度一致的限位槽二312，内玻璃板31顶部设有注胶口313，注胶口313靠近胶床2中心一侧高度偏低，内玻璃板31靠近外玻璃板32一侧与外玻璃板32同一高度处设有入胶口314，注胶口313与入胶口314连通，内玻璃板311与限位条11紧密贴合；通过旋转压辊组件4能够压紧玻璃板组件3，防止玻璃板组件3在凝胶过程中出现气泡的情况，玻璃板组件3在电泳槽1内部进行凝胶，大大缩短操作时间，并能够防止玻璃板组件3在移动过程中出现气泡的问题，且在凝胶过程中不易污染操作台面。
其中：胶床2呈“U”状，胶床2上端前后侧均设有向外延伸的凸缘21，电泳槽1顶部前后侧对应凸缘21设有限位槽一101，凸缘21与限位槽一101契合。
其中：玻璃板组件3远离限位条11一侧下端与胶床2形成开口槽8，开口槽8与凝胶槽连通，电泳槽1内壁对应开口槽8固定连接有2组伸缩杆组件，伸缩杆组件具体结构为：包括有齿条杆71和活塞杆72，活塞杆72固定在电泳槽1的内壁上，齿条杆71套接在活塞杆72上端，齿条杆71靠近玻璃板组件3之间固定连接有胶块7，压辊组件4包括转辊41、压层42、把手43和中心轴44，转辊41内中心固定连接有上下贯穿的中心轴44，转辊41通过中心轴44转动连接于电泳槽1内底部，转辊41外侧固定有包裹转辊41四分之三面积的压层42，压层42为橡胶材质，中心轴44上端固定有把手43，且把手43与中心轴44组成“T”状，把手43旋转时与电泳槽1顶部、凸缘21以及玻璃板组件3顶部相接，电泳槽1内底部位于中心轴44内侧均设有可转动的从动轴13，从动轴13上端与中心轴44下端均固定有齿轮，且齿轮之间啮合卡接，齿条杆71与从动轴13上端齿轮啮合卡接；凝胶前，顺时针转动把手43，把手43带动中心轴44顺时针转动，中心轴44带动转棍41转动，转棍41则带动压层42顺时针转动压住外玻璃板32，从而使外玻璃板32紧密贴合内玻璃板31，同时中心轴44通过齿轮与齿轮之间的啮合带动从动轴13逆时针转动，从动轴13通过齿轮带动齿条杆71推动胶块7往开口槽8内移动从而堵住开口槽8，同时把手43转动压住内玻璃板31，使内玻璃板31下部紧密贴合胶床2，即可在电泳槽1内部进行凝胶操作，凝胶完成后，反向转动把手43即可带动胶块7反向移动脱离开口槽8，同时另一端的把手43移动继续压住内玻璃板31，压层42反向转动继续压住外玻璃板32，将玻璃板组件3之间电泳槽1加上缓冲液，缓冲液高度与内玻璃板31顶部内侧偏低一侧持平，在电泳槽1内部位于胶床2两侧加上缓冲液，高度高于开口槽8，然后进行电泳蛋白分离的操作。
其中：电泳槽1内正对应外玻璃板32的侧壁上端前后均设有水平延伸至外玻璃板32一侧的限位柱组件12，限位柱组件12具体结构为：包括弧形板121，弧形板121内外弧均以中心轴44为轴心点旋转形成，把手43长度大于中心轴44至弧形板121外弧距离的两倍长度，弧形板121上端设有弧形状的开口122，开口122内部设有弧形的弧形杆123，弧形杆123上端滑动连接有限位柱124，弧形杆123上端位于限位柱124与玻璃板组件3之间套接有复位弹簧；当把手43逆时针转动时，压层42会脱离外玻璃板32，把手43另一端波动限位柱124在弧形杆123上端移动，使得压层42脱离外玻璃板32时，限位柱124能够压住外玻璃板32，从而防止外玻璃板32在没有挤压时松动，防止凝胶过程中产生气泡影响电泳，当需要拆卸玻璃板组件3时，可以逆时针转动把手43，通过复位弹簧作用，限位柱124能够复位。
其中：电泳槽1一侧固定连接有一组L状的锁扣板6，另一侧固定有两组锁扣板6，锁扣板6外侧螺纹连接有螺栓61，槽盖5一侧设有一组对接孔53，另一侧设有两组对接孔53，对接孔53与螺栓61对应设置；槽盖5正常对应才能盖住，通过螺栓61旋钮进入对接孔53，防止接线柱与槽盖5上端连接线51连线错误。
工作原理：
凝胶前，顺时针转动把手43，把手43带动中心轴44顺时针转动，中心轴44带动转棍41转动，转棍41则带动压层42顺时针转动压住外玻璃板32，从而使外玻璃板32紧密贴合内玻璃板31，同时中心轴44通过齿轮与齿轮之间的啮合带动从动轴13逆时针转动，从动轴13通过齿轮带动齿条杆71推动胶块7往开口槽8内移动从而堵住开口槽8，同时把手43转动压住内玻璃板31，使内玻璃板31下部紧密贴合胶床2，将组织液通过注胶口313加入，通过入胶口313进入凝胶槽凝胶，凝胶完成后，反向转动把手43即可带动胶块7反向移动脱离开口槽8，当把手43逆时针转动时，压层42会脱离外玻璃板32，把手43另一端波动限位柱124在弧形杆123上端移动，使得压层42脱离外玻璃板32时，限位柱124能够压住外玻璃板32，从而防止外玻璃板32在没有挤压时松动，防止凝胶过程中产生气泡影响电泳，同时另一端的把手43移动继续压住内玻璃板31，压层42反向转动继续压住外玻璃板32，将玻璃板组件3之间电泳槽1加上缓冲液，缓冲液高度与内玻璃板31顶部内侧偏低一侧持平，在电泳槽1内部位于胶床2两侧加上缓冲液，高度高于开口槽8，然后盖住槽盖5，将连接线51接电进行电泳蛋白分离的操作，操作好后，连接线51断电，通过拉手52将槽盖5打开即可进行下游实验。
Claims (3)
1.一种转基因植物外源蛋白提取纯化方法的装置，包括电泳槽(1)、槽盖(5)，其特征在于，所述电泳槽(1)内设有胶床(2)，所述胶床(2)上端设有接线柱，所述接线柱包括有正极接线柱(9)和负极接线柱(10)，所述胶床(2)两侧设有玻璃板组件(3)，所述玻璃板组件(3)将电泳槽(1)内部分隔三组内槽，所述电泳槽(1)内部位于玻璃板组件(3)外侧的前后端均设有可旋转挤压锁紧玻璃板组件的压辊组件(4)，电泳槽(1)顶部开口处开合设有槽盖(5)，所述槽盖(5)上端设有与接线柱电性连接的连接线(51)；所述胶床(2)内部左右两侧均设有U状的限位条(11)，所述玻璃板组件(3)包括内玻璃板(31)和外玻璃板(32)，所述内玻璃板(31)与外玻璃板(32)组合形成凝胶槽，所述内玻璃板(31)高度高于外玻璃板(32)，所述内玻璃板(31)前后侧固定有凸起的侧板(311)，所述侧板(311)中心设有高度与外玻璃板(32)高度一致的限位槽二(312)，所述内玻璃板(31)顶部设有注胶口(313)，注胶口(313)靠近胶床(2)中心一侧高度偏低，所述内玻璃板(31)靠近外玻璃板(32)一侧与外玻璃板(32)同一高度处设有入胶口(314)，所述注胶口(313)与入胶口(314)连通，所述内玻璃板(311)与限位条(11)紧密贴合；
所述玻璃板组件(3)远离限位条(11)一侧下端与胶床(2)形成开口槽(8)，开口槽(8)与凝胶槽连通，所述开口槽(8)外侧设有通过压辊组件(4)转动进而移动闭合或打开开口槽(8)的胶块(7)，所述胶块(7)远离玻璃板组件(3)一侧与电泳槽(1)的内壁之间固定有2组伸缩杆组件；
所述压辊组件(4)包括转辊(41)、压层(42)、把手(43)和中心轴(44)，所述转辊(41)内中心设有上下贯穿的中心轴(44)，所述转辊(41)通过中心轴转动设置于电泳槽(1)内底部，转辊(41)外侧设有包裹转辊(41)四分之三面积的压层(42)，压层(42)为橡胶材质，所述中心轴(44)上端固定有把手(43)，且把手(43)与中心轴(44)组成“T”状，所述把手(43)旋转时与电泳槽(1)顶部、凸缘(21)以及玻璃板组件(3)顶部相接；
所述电泳槽(1)内底部位于中心轴(44)内侧均设有可转动的从动轴(13)，所述从动轴(13)上端与中心轴(44)下端均固定有齿轮，且齿轮之间啮合卡接，所述伸缩杆组件包括有齿条杆(71)和活塞杆(72)，所述活塞杆(72)固定在电泳槽(1)的内壁上，齿条杆(71)套接在活塞杆(72)上端，齿条杆(71)与从动轴(13)上端齿轮啮合卡接；
所述电泳槽(1)内正对应外玻璃板(32)的侧壁上端前后均设有水平延伸至外玻璃板(32)一侧的限位柱组件(12)，所述限位柱组件(12)包括弧形板(121)，所述弧形板(121)内外弧均以中心轴(44)为轴心点旋转形成，所述把手(43)长度大于中心轴(44)至弧形板(121)外弧距离的两倍长度，弧形板(121)上端设有弧形状的开口(122)，所述开口(122)内部设有弧形的弧形杆(123)，所述弧形杆(123)上端滑动连接有限位柱(124)，弧形杆(123)上端位于限位柱(124)与玻璃板组件(3)之间套接有复位弹簧。
2.如权利要求1所述的转基因植物外源蛋白提取纯化方法的装置，其特征在于，所述胶床(2)呈“U”状，胶床(2)上端前后侧均设有向外延伸的凸缘(21)，所述电泳槽(1)顶部前后侧对应凸缘(21)设有限位槽一(101)，凸缘(21)与限位槽一(101)契合。
3.如权利要求1所述的转基因植物外源蛋白提取纯化方法的装置，其特征在于，所述电泳槽(1)一侧设有一组锁扣板(6)，另一侧设有两组锁扣板(6)，所述锁扣板(6)呈L状，锁扣板(6)外侧螺纹连接有螺栓(61)，所述槽盖(5)一侧设有一组对接孔(53)，另一侧设有两组对接孔(53)，所述对接孔(53)与螺栓(61)对应设置。
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