CN111248409B - 一种低盐豆瓣酱发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种低盐豆瓣酱发酵方法，本发明提供的多菌种协同发酵方法及其在豆瓣酱中的应用，实现了产品的低盐化，制备得到的低盐豆瓣酱较中浓度和高浓度盐浓度下制备出的豆瓣酱的风味物质总量分别增加了50.4％和111.1％，使得发酵结束后，6％盐度的酱醅风味更加饱满，香气更为醇厚；有机酸含量也较中浓度和高浓度盐浓度下制备出的豆瓣酱提高了14.7％和27.4％，使得口感更佳柔和，从而形成独特的风味。有效地提高豆酱的风味与品质，进而指导传统豆酱产业的升级换代。
Description
技术领域
本发明涉及一种低盐豆瓣酱发酵方法，属于生物工程发酵技术领域。
背景技术
豆瓣酱是我国一种传统的发酵调味品，通常以蚕豆、面粉、辣椒和盐为主要原料，经曲霉、酵母及细菌等多种微生物发酵而成。传统豆瓣酱的生产是一个多菌种混合固态发酵的开放式过程，主要包括两部分。首先是原料预处理后接种纯种米曲霉进行2~3天的通风制曲。然后是自然发酵，将成曲在陶瓷大缸中与盐水混合后再次发酵，日晒夜露3~5个月，发酵期间进行人工翻醅，是豆酱制作过程中的主要步骤。在漫长的发酵过程中，蚕豆和面粉中的蛋白质、淀粉、脂肪等成分在米曲霉分泌的各种酶的作用下分解成糖、氨基酸等小分子，然后细菌和酵母利用这些小分子进一步合成各种风味化合物，最终形成了酱独特的风味。
盐是蚕豆酱发酵过程中的主要成分，在露天发酵环境中，盐对筛选耐盐功能菌群、抑制腐败菌和致病菌的生长起着重要作用。此外，最近的研究发现，高盐饮食与高血压、心脏病、肾脏疾病和脑出血的诱发有直接关系。因此，豆类发酵食品的低盐化引起了各界广泛的关注。然而，在实际的生产过程中，盐度的降低易导致有害微生物的生长繁殖，造成酱醅的异杂味。目前也有在无菌条件下进行发酵的报道，但是由于技术的限制还一直未能彻底解析自然发酵状态下功能微生物的结构和功能，因而无法在无菌培养条件中达到比较好的发酵效果，比如之前已有部分企业采用单一的纯菌米曲霉进行工业化生产豆酱，但其风味和口感都不如传统发酵的豆酱丰富。因此，在无菌环境中应用确定的起始发酵剂势在必行。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种多菌种协同低盐豆瓣酱发酵方法，酱醅盐度控制在6-9%，能够使豆瓣酱得到充分发酵，实现了产品的低盐化，并有效的提高了豆酱的风味与品质。
本发明提供了一种低盐豆瓣酱发酵方法，所述方法为在豆酱发酵过程中添加鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、魏斯式乳杆菌进发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述鲁氏结合酵母为鲁氏结合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）Y-8，已于2019年7月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CMCC No. 18293，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；所述肉葡萄球菌为肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)M43，于2019年7月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.18295，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）公开于公开号：CN106867938B，发明名称为“一株降低生物胺的解枯草芽孢杆菌及其应用”的专利文件中；所述融合魏斯式乳杆菌（Weissella confusa）公开于公开号为CN103571782B“一株融合乳杆菌及其应用”的专利文件中。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵方法具体步骤为：将米曲霉接入蚕豆与小麦粉的混合体系中进行培养制备得到成曲；将成曲与盐水混合制成酱醅；向酱醅中接种肉葡萄球菌、融合魏斯式乳杆菌、枯草芽孢杆菌和鲁氏结合酵母进行发酵；发酵完成后制备得到蚕豆酱。
在本发明的一种实施方式中，所述蚕豆与小麦粉的质量比为2~6:1~2。
在本发明的一种实施方式中，所述的成曲是在25~35℃下培养50~70 h后制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述米曲霉的接种量为终浓度1×105~1×107个孢子/g。
在本发明的一种实施方式中，所述肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和鲁氏结合酵母的接种量为终浓度1×109~1×1010cfu/g、1×109~1×1010cfu/g、1×108~1×109cfu/g、104~105cfu/g。
在本发明的一种实施方式中，所述盐水在发酵体系中的终浓度为5 g/L ~15 g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的时间为5~8周。
本发明提供了一种风味物质增加的豆酱的制备方法，所述方法为在豆酱发酵前添加鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、魏斯式乳杆菌进行发酵。
本发明提供了一种快速制备豆瓣酱的方法，所述方法是在豆酱发酵前添加鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、魏斯式乳杆菌进行发酵。
本发明提供了一种发酵剂，所述发酵剂包含鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、魏斯式乳杆菌。
本发明提供了一种发酵剂的制备方法，所述方法为：将肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、魏斯式乳杆菌、鲁氏结合酵母分别接种至培养基中，在30~40℃下活化至对数中后期，传代培养2~3次至菌液中细胞浓度达到106cfu/mL以上活菌数时，将菌液在6000~10000 rpm下离心15~25 min收集沉淀，在沉淀中依次加入缓冲液和冷冻保护剂，待细胞浓度为不低于107cfu/mL时，进行真空冷冻干燥处理，分别得到不同菌株的冷冻干燥粉剂；将肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、魏斯式乳杆菌、鲁氏结合酵母粉剂以（1×105~1×106）:（1×105~1×106）:（1×104~1×105）:1的比例混合得到发酵剂。
在本发明的一种实施方式中，待细胞浓度为不低于108cfu/mL时，真空冷冻干燥处理。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为双蒸水或磷酸缓冲溶液，冷冻保护剂为海藻糖或脱脂乳粉。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为pH值为5~8的0.1~1 M磷酸盐缓冲液，所述冷冻保护剂为5%~20%（w/v）的海藻糖和/或脱脂乳粉。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为pH值为7的0.2 M磷酸盐缓冲液，所述冷冻保护剂为10~15%（w/v）的海藻糖或脱脂乳粉。
在本发明的一种实施方式中，将肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、魏斯式乳杆菌、鲁氏结合酵母粉剂以（1×104~1×105）:（1×104~1×105）:（1×103~1×104）:1的比例混合得到发酵剂。
在本发明的一种实施方式中，将肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、魏斯式乳杆菌、鲁氏结合酵母粉剂以1×105: 1×105: 1×104:1的比例混合得到发酵剂。
本发明提供了一种发酵剂在制备豆类发酵食品中的应用，所述食品包括蚕豆酱、黄豆酱、酱油。
本发明提供了一种低盐豆瓣酱发酵方法在制备豆类发酵食品中的应用，所述食品包括蚕豆酱、黄豆酱、酱油。
本发明的有益效果：本发明提供的多菌种协同发酵方法及其在豆瓣酱中的应用，实现了产品的低盐化，在6%的盐度时能够很好进行豆瓣酱的发酵，制备得到的低盐豆瓣酱较中浓度和高浓度盐浓度下制备出的豆瓣酱的风味物质总量分别增加了50.4%和111.1%，使得发酵结束后，6%盐度的酱醅风味更加饱满，香气更为醇厚；有机酸含量也较中浓度和高浓度盐浓度下制备出的豆瓣酱提高了14.7%和27.4%，使得口感更佳柔和，从而形成独特的风味。
生物材料保藏
鲁氏结合酵母（Zygosaccharomyces rouxii），已于2019年7月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CMCC No. 18293，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus），已于2019年7月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.18295，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1是菌株的代谢特性。CK：对照；A：米曲霉；B：枯草芽孢杆菌；S：肉葡萄球菌；W：融合魏斯式菌；Z：鲁氏结合酵母。（a）酶活；（b）挥发性风味物质；（c）非挥发性有机酸；（d）游离氨基酸。
图2是米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌在不同盐度液体培养基中培养72小时后的OD600值。
图3是米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌对酱醅发酵过程中常见有害细菌的抑菌作用。A：米曲霉；B：枯草芽孢杆菌；S：肉葡萄球菌；W：融合魏斯式菌；Z：鲁氏结合酵母。
图4是米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌菌株单双组合培养发酵时的生物量。A：米曲霉；B：枯草芽孢杆菌；S：肉葡萄球菌；W：融合魏斯式菌；Z：鲁氏结合酵母。
图5是多菌种协同发酵在不同盐度条件下的豆瓣酱发酵特性；（a）氨基酸态氮，（b）有机酸，（c）非挥发性有机酸，（d）挥发性风味物质；其中，L是盐度6%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，M是盐度9%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，H是盐度12%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，A是盐度12%时仅接种米曲霉的豆瓣酱酱醅。
具体实施方式
本发明所使用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）见专利《一株降低生物胺的解枯草芽孢杆菌及其应用》（公开号：CN106867938B）；融合魏斯式乳杆菌（Weissella confusa）见专利《一株融合乳杆菌及其应用》（公开号：CN103571782B）；米曲霉3.042从商业渠道购得。
实施例1 传统豆瓣酱微生物群落的解析
通过扩增子测序对传统豆瓣酱发酵过程中的微生物群落结构进行了解析，发现酱醅中占主体地位的细菌属主要为葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）和魏斯氏菌属（Weissella），分别占细菌总量的79.8%，7.5%和 5.9%；真菌属主要为曲霉属（Aspergillus），和接合酵母属（Zygosaccharomyces），分别占真菌总量的97%和1.3%。然后对酱醅中的微生物进行了分离纯化并基于菌株的食品安全性，确定了这5个优势微生物属的代表种，分别为肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、融合魏斯式乳杆菌（Weissella confusa）、米曲霉（Aspergillusoryzae）和鲁氏结合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）。
实施例2 菌株的培养
PDA培养基：马铃薯200 g加水蒸煮过滤，加入葡萄糖20克，琼脂20克，采用去离子水定容至1 L。
YPD培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉10 g，采用去离子水定容至1 L。
MRS培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，乙酸钠5 g，柠檬酸氢二铵2 g，磷酸氢二钾2 g，吐温-80 1.0 mL，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，采用去离子水定容至1 L。
将米曲霉接种于PDA斜面培养基上，于28℃静置培养2-3d，用0.9%生理盐水洗脱制备孢子悬浮液。
将鲁氏结合酵母以1%的接种量接种于MYPD液体培养基中，于30℃、200 rpm震荡培养至对数生长中后期，OD600为0.8~1.0。
将肉葡萄球菌和融合魏斯式乳杆菌以1%的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃、200 rpm震荡培养至对数生长中后期，OD600为0.8~1.0。
将枯草芽孢杆菌以1%的接种量接种于LB液体培养基中，于37℃、200 rpm震荡培养至对数生长中后期，OD600为0.8~1.0。
实施例3 菌株的功能验证实验
采用体外混合培养发酵法对米曲霉、鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和融合魏斯氏乳杆菌的功能进行了验证。
将10 g蚕豆粉、2.5 g小麦粉、50 g蚕豆酱加入1.0 L去离子水中煮30 min，过滤后制成模拟液体培养基。然后将这些菌种接种到液体培养基中，模拟豆瓣酱的发酵过程，每个菌种的初始细胞密度调整为1.0×106CFU/g。所有发酵均在30℃下进行3天，发酵结束后对单菌发酵液的风味物质进行了检测，以未接种的发酵培养基为对照品。所有实验均为一式三份。
豆瓣酱有机酸含量测定方法：称取2 g-10 g酱醅放入50 mL EP管中，加入40 mL超纯水浸泡2 h，每隔15 min震荡一次，7500 rpm离心5 min。取上清液1 mL于2mL EP管中，加入106 g/L亚铁***溶液和硫酸锌溶液各0.4 mL去除蛋白质和色素，静止沉淀2 h(涡旋振荡)后7500 rpm离心3 min，取上清液10000 rpm离心5 min，然后0.22 μm滤膜（绿色水系）过膜。
有机酸标样：草酸、丙酮酸、乙酸、乳酸、琥珀酸浓度分别为0.05、0.05、0.50、0.50、0.50和1.00 mg/mL。
分析条件：色谱柱：Waters Atlantis T3(5 um, 4.6×250 mm)；柱温：40℃；流动相：精确称取NaH2PO4·2H2O 3.12 g，用去离子水定容至1000 mL，用H3PO4调节溶液pH值至2.7；进样体积：10 uL；流速：0.7 mL/min；检测波长：UV210 nm。
如图1所示，米曲霉和枯草芽孢杆菌是分泌蛋白酶和淀粉糖化酶的主要微生物，米曲霉分泌的蛋白酶和淀粉酶分别为408.4 U/g和169.1 U/g，枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶和淀粉酶分别为178.0 U/g和24.5 U/g，而肉葡萄糖球菌分泌的蛋白酶和淀粉酶分别仅为30.7 U/g和30.0 U/g，融合魏斯式乳杆菌、鲁氏结合酵母分泌的淀粉糖化酶分别仅有21.2U/g、20.7 U/g，且均不能分泌蛋白酶；因而米曲霉和枯草芽孢杆菌是分泌蛋白酶和淀粉糖化酶有可能对大分子物质的降解起到一定的作用。
此外，在接种鲁氏结合酵母的培养基中，酯类和醇类化合物的含量显著增加，分别为 906.3 μg/L和1738.2 μg/L，较对照分别提高了68.9倍和15.5倍，较米曲霉分别提高了17.2和9.6%，较枯草芽孢杆菌分别提高了16.6倍和14.2倍，较肉葡萄糖球菌分别提高了26.8倍和10.3倍，较融合魏斯式乳杆菌分别提高了16.6倍和3.8倍。我们还发现，米曲霉和肉葡萄球菌能够合成乙酸（分别为4.6 g/L和3.8 g/L），而对照、枯草芽孢杆菌和鲁氏结合酵母中分别只有1.8 g/L、2.3 g/L和1.3 g/L；而融合魏斯式乳杆菌不仅能合成乙酸（3.7g/L），还能合成高含量的乳酸（4.7 g/L），而米曲霉、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肉葡萄球菌和鲁氏结合酵母中分别只有2.0 g/L、1.0 g/L、1.8 g/L、。这说明融合魏斯式乳杆菌、米曲霉和肉葡萄球菌具有较高的有机酸生产能力，这些有机酸进一步导致了蚕豆酱发酵过程中可滴定酸的增加和pH值的降低。
与有机酸的合成能力相似，融合魏斯式乳杆菌、米曲霉和肉葡萄球菌还具有较高的氨基酸合成能力或蛋白质降解能力，游离氨基酸含量分别为26.0 g/kg、23.2 g/kg、23.1g/kg，而对照、枯草芽孢杆菌、鲁氏结合酵母的游离氨基酸含量分别为20.4 g/kg、16.2 g/kg、20.4 g/kg。
实施例4 菌株盐度耐受实验
配置不同盐浓度培养基：在MYPD、MRS或LB液体培养基中分别添加0%、4%、8%、12%、16%和20%（w/v）NaCl。将实施例1中培养至对数生长中后期的米曲霉、鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和融合魏斯式乳杆菌分别接种于相应的PDA（米曲霉）、MYPD（鲁氏结合酵母）、MRS（肉葡萄球菌和融合魏斯式乳杆菌）或LB（枯草芽孢杆菌）液体培养基，使得其在培养基中的终浓度为106CFU或孢子/g接种后分别培养3天后，测定各菌株在不同盐度条件下的生长状况，细胞浓度由600 nm处的吸光度值计算，以评价其耐盐性。
如图2所示，米曲霉、鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和魏斯式乳杆菌在含8% NaCl的培养基上均能生长，其中米曲霉、枯草芽孢杆菌和魏斯式乳杆菌的耐盐性较低，在12%的盐度下几乎不生长，而鲁氏结合酵母和肉葡萄球菌表现出良好的耐盐性生长。鲁氏结合酵母和肉葡萄球菌在NaCl 终浓度为4%和8% 条件下生长速度较快，在NaCl终浓度为0%、12%和16% 条件下生长速度次之，在NaCl终浓度20%时鲁氏结合酵母菌株生长速度相对缓慢，而肉葡萄球菌仍能生长。
实施例5 菌株抑菌实验
采用滤纸法对酱醅发酵过程中常见的有害菌进行抑菌试验。先在平板上涂布100μL生长到对数期的指示菌（选取实验室在前期试验中从酱醅中筛选出的蜡状芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为指示菌），然后将6 mm圆形无菌滤纸均匀地蘸取实验菌培养液，平坦地放置在琼脂板的中间。以无菌水为阴性对照，30℃孵育48 h后，通过抑菌圈的大小评价其生长抑制。如图3所示，枯草芽孢杆菌可以抑制蜡状芽孢杆菌的生长；融合魏斯式乳杆菌可以抑制大肠杆菌的生长；肉葡萄球菌和魏斯式菌可以抑制金黄色葡萄球菌的生长。
实施例6 菌株的相互作用实验
采用体外混合培养发酵法分析米曲霉、鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和魏斯式乳杆菌之间的微生物相互作用。
将10 g蚕豆粉、2.5 g小麦粉、50 g蚕豆酱加入1.0 L去离子水中煮30 min，过滤后制成模拟液体培养基。然后将这些菌种接种到液体培养基中，模拟豆瓣酱的发酵过程，每个菌种的初始细胞密度调整为1.0×106CFU或孢子/g。所有发酵均在30℃下进行3天。以未接种的发酵培养基为对照品。采用实时荧光定量PCR技术对发酵结束后不同菌种的细胞进行计数。所有实验均为一式三份。不同物种之间的微生物相互作用会影响其生长，进而影响整个微生物群落结构及其代谢活动。如图4所示，米曲霉（A）和枯草芽孢杆菌（B）相互抑制，在共培养条件下细胞数量均有所减少。枯草芽孢杆菌（B）和融合魏斯式乳杆菌（W）之间也存在类似的竞争作用。此外，除融合魏斯式乳杆菌（W）对肉葡萄球菌（S）有明显的抑制作用，其它菌株对肉葡萄球菌影响不显著。而枯草芽孢杆菌对大部分的微生物具有一定的抑制作用。此外，在融合魏斯式乳杆菌和鲁氏结合酵母之间发现存在显著的相互促进作用。这种乳酸菌和酵母之间的相互作用在发酵食品中也是普遍存在的。
实施例7 多菌种协同发酵在豆酱发酵中的应用
实验分析表明枯草芽孢杆菌虽然会抑制米曲霉的生长，但其本身具有一定的酶活分泌能力，因此可以和米曲霉在醅发酵前期共同释放各种酶水解蛋白质和淀粉，为发酵后期酵母和细菌的生长提供前体物质。此外，米曲霉、肉葡萄球菌和融合魏斯式乳杆菌具有较高的有机酸和氨基酸合成能力，可以导致酱醅的酸化，并为酱醅提供独特的风味。随着发酵的进行，由于米曲霉、枯草芽孢杆菌和魏斯式乳杆菌的低盐耐受性，其在发酵中后期逐渐消亡。另一方面，随着枯草芽孢杆菌对鲁氏结合酵母抑制的解除，且前期融合魏斯式乳杆菌和肉葡萄球菌为鲁氏结合酵母的生长创造了较低的pH环境，耐盐鲁氏结合酵母开始发挥作用，主要负责醇类、酯类等多种挥发性风味成分的形成，直接导致了豆酱独特的风味。由于肉葡萄球菌和鲁氏结合酵母的较高耐盐性，其在发酵中后期发挥着重要的作用。
通过在发酵过程中接入米曲霉、鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和融合魏斯氏乳杆菌，比较了不同盐度下合成群落的发酵性能。
蚕豆121℃高压蒸煮变性后冷却至室温，与小麦粉充分混合（3:1，w/w），并接种终浓度为106个孢子/g的米曲霉，在30℃下培养60 h后制得成曲。将成曲与不同浓度的盐水混合至盐浓度分别为6%、9%和12%，最终含水量为55%。将活化至对数中后期的肉葡萄球菌、融合魏斯式乳杆菌、枯草芽孢杆菌和鲁氏结合酵母接种至酱醅中，使其在酱醅中的终浓度分别为109cfu/g、109cfu/g、108cfu/g、104cfu/g，以未接种的酱醅为对照，发酵温度为30℃，并跟踪测定不同盐浓度环境下制备的豆瓣酱中的氨基酸态氮含量和可滴定酸含量（具体步骤参见GB/T 5009.40-2003）。发现所有组别的氨基酸态氮含量在4周左右后达到平稳状态，说明发酵基本结束（表1）。
表1 不同盐浓度豆瓣酱样品中的氨基酸态氮（%）
注：L是盐度6%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，M是盐度9%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，H是盐度12%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，A是盐度12%时仅接种米曲霉的豆瓣酱酱醅。
比较了不同盐度发酵条件下，合成微生物群落的发酵性能。如图5所示，盐度越低，合成群落的有机酸的增长速率和含量也越高（表2，有机酸测定步骤见实施例3），在6%盐度的酱醅中，有机酸总量能达到140.71g/kg，较只添加米曲霉的对照提高了1.5倍，较中浓度和高浓度盐浓度制备出的豆瓣酱的有机酸含量分别提高了14.7%和27.4%；且风味物质的含量也越高，较中浓度和高浓度盐浓度下制备出的豆瓣酱的风味物质总量分别增加了50.4%和111.1%。使得发酵结束后，6%盐度的酱醅风味更加饱满，香气更为醇厚。这说明低盐可以有效地促进豆瓣酱的高效发酵，并改善蚕豆酱的风味（表3）。
豆酱风味物质测定方法：准确称取2 g左右酱醅于15ml固相微萃取瓶中，分别先后加入2 g固体NaCl，6 mL脱二氧化碳的水，并加入20 μL 25 mg/L 2-辛醇内标，放入转子后拧紧盖子并放入55 ℃带有磁力搅拌器的恒温水浴锅中，磁力搅拌速度为400 r/min。将萃取头通过固相微萃取瓶盖***到瓶中的空气部分后推出纤维头，开启磁力搅拌器，顶空吸附40 min后抽回纤维头。
色谱条件：
DB-Wax毛细管色谱柱，柱长30 mm，内径0.32 mm，液膜厚度0.25 μm；载气：He；流速：10 mL/min，不分流；柱温：进样口温度保持在250℃；升温程序设置为：起始气相色谱柱温度40℃，保持3.5 min，以5℃/min升温至90℃，再以12℃/min升温至230℃，保持10 min。
质谱条件：
电离模式：EI+；发射电流（μA）：200；驱电压（V）：0.5；电子能量（eV）：70；镜片1（V）：4，镜片2（V）：35；离子能量（eV）：1.8；离子能量斜坡（mV·amu-1）：0.0；界面温度（℃）：250；离子源温度（℃）：200；低质量分辨率：18.0;高质量分辨率：12.6；探测器电压（V）：350；扫描质量范围：33～450 amu。
表2不同盐浓度豆瓣酱样品中的有机酸物质含量（g/kg）
注：L是盐度6%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，M是盐度9%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，H是盐度12%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，A是盐度12%时仅接种米曲霉的豆瓣酱酱醅。
表3 不同盐浓度豆瓣酱样品中的各类挥发性物质含量（mg/kg）
注：L是盐度6%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，M是盐度9%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，H是盐度12%时接种米曲霉、鲁氏结合酵母、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和肉葡萄球菌发酵得到的酱醅，A是盐度12%时仅接种米曲霉的豆瓣酱酱醅。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一种低盐豆瓣酱发酵方法，其特征在于，所述方法为在豆瓣酱醅发酵阶段添加肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和鲁氏结合酵母；所述肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和鲁氏结合酵母的比例为105：105：104：1；所述豆瓣酱醅在无菌环境中进行发酵；所述鲁氏结合酵母为鲁氏结合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）Y-8，已于2019年7月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CMCCNo. 18293；所述肉葡萄球菌为肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）M43，于2019年7月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.18295；所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）公开于公开号为CN106867938B的专利文件中；所述融合魏斯式乳杆菌（Weissella confusa）公开于公开号为CN103571782B的专利文件中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为将米曲霉接入蚕豆与小麦粉的混合体系中进行培养制备得到成曲；将成曲与盐水混合制成酱醅；向酱醅中接种肉葡萄球菌、融合魏斯式乳杆菌、枯草芽孢杆菌和鲁氏结合酵母进行发酵，制备得到豆瓣酱。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和鲁氏结合酵母的接种量为在酱醅中的终浓度1×109cfu/g、1×108cfu/g、1×109cfu/g、1×104 cfu/g。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述盐水在发酵体系中的终浓度为5 g/L~20 g/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为5~8周。
6.一种提高豆瓣酱风味物质的方法，其特征在于，所述方法为在豆酱发酵前添加鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、融合魏斯式乳杆菌进行发酵；所述鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、融合魏斯式乳杆菌的比例为1：105：105：104；所述鲁氏结合酵母为鲁氏结合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）Y-8，已于2019年7月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CMCC No. 18293；所述肉葡萄球菌为肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）M43，于2019年7月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.18295；所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）公开于公开号为CN106867938B的专利文件中；所述融合魏斯式乳杆菌（Weissella confusa）公开于公开号为CN103571782B的专利文件中。
7.一种低盐豆瓣酱发酵剂，其特征在于，所述发酵剂为鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、融合魏斯式乳杆菌；所述鲁氏结合酵母、肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、融合魏斯式乳杆菌的比例为1：105：105：104；所述鲁氏结合酵母为鲁氏结合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）Y-8，已于2019年7月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CMCC No. 18293；所述肉葡萄球菌为肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）M43，于2019年7月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.18295；所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）公开于公开号为CN106867938B的专利文件中；所述融合魏斯式乳杆菌（Weissella confusa）公开于公开号为CN103571782B的专利文件中。
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