CN113274538A - 一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用，所述bFGF缓释纳米敷料是由包含有碱性成纤维细胞生长因子、三磷酸腺苷或其盐、金属离子的乳液制得的静电纺丝纳米纤维膜。本发明将三磷酸腺苷或其盐以及金属离子作为bFGF的稳定剂，通过bFGF与金属离子和负电大分子之间的静电相互作用和配位作用，形成了“bFGF‑负电大分子‑金属离子”的三元复合体系，简单高效地建立bFGF的稳定策略，协同提高了bFGF在敷料中的活性，其代替了传统的易产生免疫原性的动物源性成分稳定剂，同时避免了微球包埋的复杂操作。该敷料经静电纺丝形成的纳米纤维中存在的“芯壳”结构和三元复合体系同样促进了bFGF的长效缓释效果。

Description

一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用。
背景技术
创伤在日常生活中的发生十分普遍，一些创面较大的伤口治疗周期长，容易造成人力、医疗、费用负担；而面对一些小伤口，若不进行有效的干预而仅靠机体自身的修复机制自愈，容易留下瘢痕而影响视觉美感。
生长因子是一类具有刺激细胞生长活性的多肽类物质，通过与特异性、高亲和的受体结合，从而调节细胞生长与其他细胞功能。外源性加入生长因子可启动人体自身的“主动”修复能力，在促进肉芽组织形成的同时使创面再上皮化进程加速，在创面愈合的过程中发挥重要作用。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是人类最早发现、活性最高、功能最强大的因子。在急性创面中，bFGF能够促进成纤维细胞增殖，调节各种细胞外基质(ECM)成分的合成和沉积，促进肉芽组织形成和上皮再生。但它在体内含量极低，且对热和酸敏感，容易失活，这给其临床应用带来了极高挑战性，因此选择合适的给药剂型非常关键。
传统的bFGF剂型主要有喷雾剂、冻干粉剂、凝胶剂，喷雾剂中的bFGF以溶液形式存在，其在运输、储藏、使用等环节非常容易失活；冻干粉剂同样以溶液的形式进行给药，能够快速结合受伤创面，但由于起效快，体内代谢迅速，半衰期短，并不利于伤口恢复，且无法实现bFGF的长期缓释；凝胶剂暴露在体表容易流失，一天内需反复多次给药，在一定程度上限制了它的临床应用。因此，借助合适的载药材料实现其控释与缓释，延长其保质期限是提高生长因子类药物临床应用的关键所在。
静电纺丝是一种可以连续生产纳米纤维的技术，所得纳米纤维膜整体呈现无纺布的形态，具有致密的多孔结构和高比表面积。同时，通过控制纺丝时间可以调节纳米纤维膜的孔隙大小，大部分纳米纤维膜的孔隙直径为纳米级，远小于各种病原菌的直径，具有高效的隔菌性。目前有很多研究工作致力于bFGF静电纺丝新剂型开发。
CN107185025A公开了一种中药纳米纺丝复合纤维膜敷料、制备方法及其应用，该复合纤维膜敷料将PLGA作为载体，以其担载姜黄素(CUR)和成纤维细胞生长因子(bFGF)，以静电纺丝的方法制备可降解纳米纺丝复合材料。其中，姜黄素占聚乳酸-乙醇酸共聚物质量分数为1～3％，成纤维细胞生长因子占聚乳酸-乙醇酸共聚物质量分数为8.33～33.33×10-4％。该复合纤维膜敷料具有良好的纳米结构，具有维持药物缓释效应，减少成纤维细胞生长因子单独用药的易流失特点，具有良好的透气性、防水功能且纳米尺寸的孔径利于细胞的增殖和伤口的愈合。
CN109602953A公开了一种新型长效缓释VEGF和bFGF可降解生物纳米膜片及其制备方法，该方法将生物可降解聚合物材料溶于极性、易挥发有机溶剂中，通过静电纺丝方法，制得具有纳米尺度结构的生物可降解纳米纤维膜片；将生长因子负载至生物可降解纳米纤维膜片上，经冷冻干燥，灭菌包装后，即得所需生物纳米膜片。该生物纳米膜片可应用于神经外科间接血管搭桥术后血管再生不足，提高相关缺血性脑血管疾病的治疗效果，降低缺血性脑卒中的再次发生风险。
CN110013567A公开了一种具有多级结构的可降解载药控释心肌修复补片，所述心肌修复补片由血管内皮生长因子/碱性成纤维细胞生长因子(VEGF/bFGF)、聚吡咯/金属微粒与左旋聚乳酸/聚乙内酯(PLLA/PCL)在温和溶剂中共混，室温下利用超声乳化和多流体取向静电纺丝技术制备。该心肌修复补片表面利用激光雕刻技术制成多级结构，具有可降解载药控释功能；其表层涂布聚多巴胺，有利于组织粘附。
CN110975007A公开了一种具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜及其制备方法，该引导组织再生膜是由碱性成纤维细胞生长因子与合成高分子化合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物、天然成分羊毛角蛋白构建而成，碱性成纤维细胞生长因子含量为0.03～0.3g/L，聚乳酸-羟基乙酸共聚物浓度为15～20％，羊毛角蛋白浓度为1.0～1.5％。该引导组织再生膜制备方法简单，成膜条件温和，具有良好的细胞相容性和主动诱导牙周组织的再生的性能，符合生物体内应用的要求，作为一种有诱导组织再生作用的生物膜具有良好的应用前景。
CN105040280B授权了聚丙烯网片/静电纺丝纳米纤维膜及其制备方法和应用，该发明创造性的将聚丙烯网片与静电纺丝纳米纤维膜进行复合，利用纳米纤维膜改善聚丙烯网片的生物相容性，利用聚丙烯网片改善纳米纤维膜的抗张强度，两者相辅相成，再引入制备包埋碱性成纤维因子bFGF的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA微球实现药物控释，可填补临床现有的聚丙烯网片的诸多不足。
在现有的静电纺丝负载bFGF的策略中，为了改善bFGF的缓释性能，通常采用乳液电纺来制备具有“芯壳”结构的载药纳米纤维敷料，通过壳层材料的持续降解而实现bFGF的长期缓释，在操作上具有简便性，在生产放大上具有可行性。然而，若将乳液电纺应用于载bFGF新型创伤敷料的制备，还需要考虑到乳液制备过程及对蛋白药物活性的影响。为了提高bFGF的活性，现有技术通常会使用牛血清白蛋白作为生长因子的稳定剂，或者将生长因子制备成纳米微球进行预先包埋。但牛血清白蛋白的添加引入了动物源性成分，增加了生长因子制剂成分的复杂性；而纳米微球的制备增加了纳米纤维制备过程的复杂性。
因此，开发一种长效维持bFGF活性、具有良好bFGF缓控释效果的纳米敷料，并降低操作上的复杂性，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术容易导致bFGF失活、无法实现良好缓释效果的不足，本发明的目的在于提供一种bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用。该纳米敷料综合了bFGF、稳定剂以及纳米纤维膜对创面愈合的促进作用，为生物活性型创面敷料的产品开发及应用提供了研究基础。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料，所述bFGF缓释纳米敷料是由包含有碱性成纤维细胞生长因子、三磷酸腺苷或其盐、金属离子的乳液制得的静电纺丝纳米纤维膜。
本发明所涉及的bFGF缓释纳米敷料创造性地将三磷酸腺苷或其盐以及金属离子作为bFGF的稳定剂，由于bFGF分子表面富含正电荷，通过bFGF与金属离子和负电大分子之间的静电相互作用和配位作用，形成了“bFGF-负电大分子-金属离子”的三元复合体系，简单高效地建立bFGF的稳定策略，协同提高了bFGF在敷料中的活性，其代替了传统的易产生免疫原性的动物源性成分稳定剂，同时避免了微球包埋的复杂操作。该敷料经静电纺丝形成的纳米纤维中存在的“芯壳”结构和三元复合体系同样促进了bFGF的长效缓释效果。同时，该纳米敷料综合了bFGF、金属离子、三磷酸腺苷或其盐，以及静电纺丝纳米纤维膜对创面愈合的促进作用。该纳米敷料具有良好的细胞增殖活性和血液相容性，有效促进创面愈合，具有广阔的应用前景。
优选地，所述乳液包括包含有碱性成纤维细胞生长因子、三磷酸腺苷或其盐、金属离子的内水相和包含有生物相容性高分子材料的外油相。
优选地，所述三磷酸腺苷或其盐包括三磷酸腺苷、三磷酸腺苷二钠盐、三磷酸腺苷镁盐、三磷酸腺苷四锂盐中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合例如三磷酸腺苷和三磷酸腺苷二钠盐的组合、三磷酸腺苷二钠盐和三磷酸腺苷镁盐的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述金属离子包括锌离子、镁离子、铜离子、亚铁离子或镍离子中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合例如锌离子和镁离子的组合、铜离子和亚铁离子的组合、亚铁离子和镍离子的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述生物相容性高分子材料包括聚乳酸、聚羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚四氟乙烯、聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合例如聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物的组合、聚己内酯和聚四氟乙烯的组合、聚四氟乙烯和聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明中，所述碱性成纤维细胞生长因子、三磷酸腺苷或其盐、金属离子通过静电作用和配位作用形成三元复合体系。
优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子、金属离子、三磷酸腺苷或其盐的比例为(1-100)mg:(0.01-10)mmol:(0.01-10)mmol。
所述(1-100)mg是指具体点值可以选择1mg、2mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、85mg、90mg、100mg等。
所述(0.01-10)mmol是指具体点值可以选择0.01mmol、0.05mmol、0.1mmol、0.5mmol、1mmol、1.5mmol、2mmol、3mmol、4mmol、5mmol等。
上述各项数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子、金属离子、三磷酸腺苷或其盐的比例为(2-50)mg:(1-5)mmol:(1-5)mmol。
优选地，所述静电纺丝纳米纤维膜的纳米纤维直径为250-550nm，例如250nm、280nm、300nm、325nm、350nm、375nm、400nm、425nm、450nm、500nm、550nm等，该数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料的制备方法，所述制备方法包括：
将包含有碱性成纤维细胞生长因子、三磷酸腺苷或其盐、金属离子的乳液进行静电纺丝，干燥，制得所述具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料。
优选地，所述静电纺丝的参数包括：纺丝液流速0.2-0.8mL/h、纺丝电压20-30kV、针头与收集板的距离15-25cm、纺丝针头4-7号。
所述纺丝液流速可以为0.2mL/h、0.3mL/h、0.4mL/h、0.5mL/h、0.6mL/h、0.7mL/h、0.8mL/h等。
所述纺丝电压可以为20kV、22kV、23kV、24kV、25kV、26kV、27kV、28kV、29kV、30kV等。
所述针头与收集板的距离可以为15cm、16cm、17cm、18cm、20cm、21cm、22cm、24cm、25cm等。
所述纺丝针头可以选择4号、5号、6号、7号。
上述各项数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述干燥为自然干燥、烘干、真空烘干或冷冻干燥。
优选地，所述乳液的制备方法包括如下步骤：
(1)将碱性成纤维细胞生长因子、缓冲液、金属盐、三磷酸腺苷或其盐混合，制得内水相溶液；将生物相容性高分子材料和有机溶剂混合，制得外油相溶液；
(2)将内水相溶液、外油相溶液和乳化剂混合乳化，即得所述乳液。
其制备过程的示意图如图1所示。
优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或HEPES缓冲液中的任意一种或两种的组合；所述至少两种的组合例如磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液的组合、Tris-HCl缓冲液和HEPES缓冲液的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜或四氢呋喃中的任意一种或两种的组合；所述至少两种的组合例如二氯甲烷和三氯甲烷的组合、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺的组合、二甲亚砜和四氢呋喃的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述外油相溶液中生物相容性高分子材料的浓度为2-20％(w/v)，例如2％、3％、5％、8％、10％、12％、15％、20％等，该数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选5-12％(w/v)。
优选地，步骤(2)中内水相溶液与外油相溶液的体积比为0.1-10％(v/v)，例如0.1％、0.5％、1％、2％、4％、5％、6％、8％、10％等，该数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选0.5～6％(v/v)。
优选地，步骤(2)具体操作方法包括：将乳化剂与外油相溶液混匀后，在冰浴搅拌下向其中逐滴加入内水相溶液，乳化，即得所述乳液。
优选地，所述乳化剂包括非离子型乳化剂、两性离子型乳化剂、阴离子型乳化剂或阳离子型乳化剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述非离子型乳化剂包括Span20、Span40、Span60、Span80、Span85、Tween20、Tween40、Tween60、Tween80或Tween85中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述两性离子型乳化剂包括卵磷脂、氨基酸型乳化剂、甜菜碱型乳化剂或硬脂酸三乙醇胺皂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述阴离子型乳化剂包括十二烷基苯磺酸钠、油酸、月桂酸、硫酸化蓖麻油或硬脂酸钙中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述阳离子型乳化剂包括苄基三乙基氯化铵、季铵盐类化合物或烷基铵盐化合物中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述乳化剂在所述外油相溶液中的添加量为0.1-5％(v/v)，例如0.1％、0.2％、1％、2％、3％、4％、5％等，该数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。进一步优选为0.2-2％(v/v)。
优选地，所述乳化的方法包括磁子搅拌法、均质分散法、超声乳化法、注射器互推法或膜乳化法中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述乳化的时间为1-30min，例如1min、2min、3min、5min、10min、12min、15min、20min、22min、25min、30min等，该数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选2-12min。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料在制备促进创面愈合材料中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的bFGF缓释纳米敷料创造性地将三磷酸腺苷或其盐以及金属离子作为bFGF的稳定剂，由于bFGF分子表面富含正电荷，通过bFGF与金属离子和负电大分子之间的静电相互作用和配位作用，形成了“bFGF-负电大分子-金属离子”的三元复合体系，简单高效地建立bFGF的稳定策略，协同提高了bFGF在敷料中的活性，其代替了传统的易产生免疫原性的动物源性成分稳定剂，同时避免了微球包埋的复杂操作。
该敷料经静电纺丝形成的纳米纤维中存在的“芯壳”结构和三元复合体系同样促进了bFGF的长效缓释效果。
同时，该纳米敷料综合了bFGF、金属离子、三磷酸腺苷或其盐，以及静电纺丝纳米纤维膜对创面愈合的促进作用。该纳米敷料具有良好的细胞增殖活性和血液相容性，有效促进创面愈合，具有广阔的应用前景。与未添加稳定剂的bFGF纳米敷料相比，所述bFGF缓释纳米敷料促进人真皮成纤维细胞增殖的活性提高了1.39倍，Ⅰ型胶原容积提高了3.45倍，溶血率显著降低，具有良好的生物相容性。
本发明所涉及的bFGF缓释纳米敷料对于小鼠皮肤缺损模型具有较好的治疗效果。与空白组和未添加稳定剂的bFGF纳米敷料相比，所述bFGF缓释纳米敷料在相同时间内促进创面愈合的速度更快，14天时小鼠创面处的表皮厚度、胶原容积密度与正常皮肤相比无显著性差异，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明制备bFGF缓释纳米敷料的示意图；
图2是各组bFGF缓释纳米敷料的SEM图；
图3是各组bFGF缓释纳米敷料的TEM图；
图4是各组bFGF缓释纳米敷料的bFGF体外释放曲线图；
图5是各组bFGF缓释纳米敷料的天狼星红染色结果图；
图6是各组小鼠创面部位愈合情况的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种bFGF缓释纳米敷料(简称bFGF/PCL)，其制备方法如下：
(1)将100μg重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)冻干粉重溶于100μL Tris(5mM,pH＝7.6)中，用含5％海藻糖的PBS冻存液(pH＝7.2)稀释至100μg/mL以制备bFGF储液；
(2)称取2.383g HEPES溶于700mL超纯水中，用氢氧化钠溶液调节pH＝7.4，定容至1000mL，过滤除菌，制备HEPES缓冲液(10mM,pH＝7.4)；
(3)将50μL bFGF储液和50μL HEPES缓冲液混合，制备100μL内水相溶液；
(4)将200mg聚己内酯溶于2mL氯仿中，制备浓度为10％(w/v)的聚己内酯溶液作为外油相溶液；
(5)向步骤(4)得到的2mL聚己内酯溶液中加入1.5％(v/v)(30μL)Span80，混匀，在冰浴搅拌下，将步骤(3)得到的100μL内水相溶液滴加入上述溶液中，并采用超声法乳化5min，得到乳液；
(6)将乳液进行静电纺丝，使用5号针头、注射泵流速设为0.5mL/h、电压设置为25kV、收集板距离设置为20cm。电纺完成后将纤维膜置于通风橱过夜，以去除残留的有机溶剂，得到bFGF/PCL。
所制备获得的纳米纤维直径经SEM测定为271±66nm。
实施例2
本实施例提供一种bFGF缓释纳米敷料(简称bFGF-Zn/PCL)，其制备方法如下：
(1)将100μg重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)冻干粉重溶于100μL Tris(5mM,pH＝7.6)中，用含5％海藻糖的PBS冻存液(pH＝7.2)稀释至100μg/mL以制备bFGF储液；
(2)称取2.383g HEPES溶于700mL超纯水中，用氢氧化钠溶液调节pH＝7.4，定容至1000mL，过滤除菌，制备HEPES缓冲液(10mM,pH＝7.4)；
(3)称取27.26g氯化锌粉末溶于100mL去离子水中，加盐酸助溶，得到浓度为2M的Zn2+母液，将其稀释至40mM制备Zn2+储液；
(4)将50μL bFGF储液、10μL Zn2+储液和40μL HEPES缓冲液混合，制备100μL内水相溶液；
(5)将200mg聚己内酯溶于2mL氯仿中，制备浓度为10％(w/v)的聚己内酯溶液作为外油相溶液；
(6)向步骤(5)得到的2mL聚己内酯溶液中加入1.5％(v/v)(30μL)Span80，混匀，在冰浴搅拌下，将步骤(4)得到的100μL内水相溶液滴加入上述溶液中，并采用超声法乳化5min，得到乳液；
(7)将乳液进行静电纺丝，使用5号针头、注射泵流速设为0.5mL/h、电压设置为25kV、收集板距离设置为20cm。电纺完成后将纤维膜置于通风橱过夜，以去除残留的有机溶剂，得到bFGF-Zn/PCL。
所制备获得的纳米纤维直径经SEM测定为324±127nm。
实施例3
本实施例提供一种bFGF缓释纳米敷料(简称bFGF-ATP/PCL)，其制备方法如下：
(1)将100μg重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)冻干粉重溶于100μL Tris(5mM,pH＝7.6)中，用含5％海藻糖的PBS冻存液(pH＝7.2)稀释至100μg/mL以制备bFGF储液；
(2)称取2.383g HEPES溶于700mL超纯水中，用氢氧化钠溶液调节pH＝7.4，定容至1000mL，过滤除菌，制备HEPES缓冲液(10mM,pH＝7.4)；
(3)称取605.2mg ATP二钠盐溶于50mL无菌去离子水中，配制40mM的ATP溶液；
(4)将50μL bFGF储液、10μL ATP溶液和40μL HEPES缓冲液混合，制备100μL内水相溶液；
(5)将200mg聚己内酯溶于2mL氯仿中，制备浓度为10％(w/v)的聚己内酯溶液作为外油相溶液；
(6)向步骤(5)得到的2mL聚己内酯溶液中加入1.5％(v/v)(30μL)Span80，混匀，在冰浴搅拌下，将步骤(4)得到的100μL内水相溶液滴加入上述溶液中，并采用超声法乳化5min，得到乳液；
(7)将乳液进行静电纺丝，使用5号针头、注射泵流速设为0.5mL/h、电压设置为25kV、收集板距离设置为20cm。电纺完成后将纤维膜置于通风橱过夜，以去除残留的有机溶剂，得到bFGF-ATP/PCL。
所制备获得的纳米纤维直径经SEM测定为324±146nm。
实施例4
本实施例提供一种bFGF缓释纳米敷料(简称bFGF-ATP-Zn/PCL)，其制备方法如下：
(1)将100μg重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)冻干粉重溶于100μL Tris(5mM,pH＝7.6)中，用含5％海藻糖的PBS冻存液(pH＝7.2)稀释至100μg/mL以制备bFGF储液；
(2)称取2.383g HEPES溶于700mL超纯水中，用氢氧化钠溶液调节pH＝7.4，定容至1000mL，过滤除菌，制备HEPES缓冲液(10mM,pH＝7.4)；
(3)称取605.2mg ATP二钠盐溶于50mL无菌去离子水中，配制40mM的ATP溶液；称取27.26g氯化锌粉末溶于100mL去离子水中，加盐酸助溶，得到浓度为2M的Zn2+母液，将其稀释至40mM制备Zn2+储液；
(4)将50μL bFGF储液、5μL ATP溶液、5μL Zn2+储液和40μL HEPES缓冲液混合，制备100μL内水相溶液；
(5)将200mg聚己内酯溶于2mL氯仿中，制备浓度为10％(w/v)的聚己内酯溶液作为外油相溶液；
(6)向步骤(5)得到的2mL聚己内酯溶液中加入1.5％(v/v)(30μL)Span80，混匀，在冰浴搅拌下，将步骤(4)得到的100μL内水相溶液滴加入上述溶液中，并采用超声法乳化5min，得到乳液；
(7)将乳液进行静电纺丝，使用5号针头、注射泵流速设为0.5mL/h、电压设置为25kV、收集板距离设置为20cm。电纺完成后将纤维膜置于通风橱过夜，以去除残留的有机溶剂，得到bFGF-ATP-Zn/PCL。
所制备获得的纳米纤维直径经SEM测定为364±138nm。
实施例5
本实施例提供一种bFGF缓释纳米敷料(简称bFGF-ATP-Mg/PCL)，其制备方法如下：
(1)将100μg重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)冻干粉重溶于100μL Tris(5mM,pH＝7.6)中，用含5％海藻糖的PBS冻存液(pH＝7.2)稀释至100μg/mL以制备bFGF储液；
(2)称取2.383g HEPES溶于700mL超纯水中，用氢氧化钠溶液调节pH＝7.4，定容至1000mL，过滤除菌，制备HEPES缓冲液(10mM,pH＝7.4)；
(3)称取605.2mg ATP二钠盐溶于50mL无菌去离子水中，配制40mM的ATP溶液；称取38.08mg氯化镁溶于100mL去离子水中，得到浓度为40mM的Mg2+储液；
(4)将50μL bFGF储液、5μL ATP溶液、5μL Mg2+储液和40μL HEPES缓冲液混合，制备100μL内水相溶液；
(5)将200mg聚己内酯溶于2mL氯仿中，制备浓度为10％(w/v)的聚己内酯溶液作为外油相溶液；
(6)向步骤(5)得到的2mL聚己内酯溶液中加入1.5％(v/v)(30μL)Span80，混匀，在冰浴搅拌下，将步骤(4)得到的100μL内水相溶液滴加入上述溶液中，并采用超声法乳化5min，得到乳液；
(7)将乳液进行静电纺丝，使用5号针头、注射泵流速设为0.5mL/h、电压设置为25kV、收集板距离设置为20cm。电纺完成后将纤维膜置于通风橱过夜，以去除残留的有机溶剂，得到bFGF-ATP-Mg/PCL。
所制备获得的纳米纤维直径经SEM测定为550±113nm。
实施例6
本实施例提供一种bFGF缓释纳米敷料(简称bFGF-ATP-Zn/PCL)，其制备方法如下：
(1)将100μg重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)冻干粉重溶于100μL Tris(5mM,pH＝7.6)中，用含5％海藻糖的PBS冻存液(pH＝7.2)稀释至100μg/mL以制备bFGF储液；
(2)称取2.383g HEPES溶于700mL超纯水中，用氢氧化钠溶液调节pH＝7.4，定容至1000mL，过滤除菌，制备HEPES缓冲液(10mM,pH＝7.4)；
(3)称取605.2mg ATP二钠盐溶于50mL无菌去离子水中，配制40mM的ATP溶液；称取27.26g氯化锌粉末溶于100mL去离子水中，加盐酸助溶，得到浓度为2M的Zn2+母液，将其稀释至20mM制备Zn2+储液；
(4)将50μL bFGF储液、5μL ATP溶液、5μL Zn2+储液和40μL HEPES缓冲液混合，制备100μL内水相溶液；
(5)将200mg聚己内酯溶于2mL氯仿中，制备浓度为10％(w/v)的聚己内酯溶液作为外油相溶液；
(6)向步骤(5)得到的2mL聚己内酯溶液中加入1.5％(v/v)(30μL)Span80，混匀，在冰浴搅拌下，将步骤(4)得到的100μL内水相溶液滴加入上述溶液中，并采用超声法乳化5min，得到乳液；
(7)将乳液进行静电纺丝，使用5号针头、注射泵流速设为0.5mL/h、电压设置为25kV、收集板距离设置为20cm。电纺完成后将纤维膜置于通风橱过夜，以去除残留的有机溶剂，得到bFGF-ATP-Zn/PCL。
所制备获得的纳米纤维直径经SEM测定为350±104nm。
实施例7
本实施例提供一种bFGF缓释纳米敷料(简称bFGF-ATP-Zn/PCL)，其制备方法如下：
(1)将100μg重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)冻干粉重溶于100μL Tris(5mM,pH＝7.6)中，用含5％海藻糖的PBS冻存液(pH＝7.2)稀释至100μg/mL以制备bFGF储液；
(2)称取2.383g HEPES溶于700mL超纯水中，用氢氧化钠溶液调节pH＝7.4，定容至1000mL，过滤除菌，制备HEPES缓冲液(10mM,pH＝7.4)；
(3)称取302.6mg ATP二钠盐溶于50mL无菌去离子水中，配制20mM的ATP溶液；称取27.26g氯化锌粉末溶于100mL去离子水中，加盐酸助溶，得到浓度为2M的Zn2+母液，将其稀释至40mM制备Zn2+储液；
(4)将50μL bFGF储液、5μL ATP溶液、5μL Zn2+储液和40μL HEPES缓冲液混合，制备100μL内水相溶液；
(5)将200mg聚己内酯溶于2mL氯仿中，制备浓度为10％(w/v)的聚己内酯溶液作为外油相溶液；
(6)向步骤(5)得到的2mL聚己内酯溶液中加入1.5％(v/v)(30μL)Span80，混匀，在冰浴搅拌下，将步骤(4)得到的100μL内水相溶液滴加入上述溶液中，并采用超声法乳化5min，得到乳液；
(7)将乳液进行静电纺丝，使用5号针头、注射泵流速设为0.5mL/h、电压设置为25kV、收集板距离设置为20cm。电纺完成后将纤维膜置于通风橱过夜，以去除残留的有机溶剂，得到bFGF-ATP-Zn/PCL。
所制备获得的纳米纤维直径经SEM测定为300±78nm。
实施例8
本实施例提供一种bFGF缓释纳米敷料(简称bFGF-ATP-Zn/PCL)，其制备方法如下：
(1)将100μg重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)冻干粉重溶于100μL Tris(5mM,pH＝7.6)中，用含5％海藻糖的PBS冻存液(pH＝7.2)稀释至100μg/mL以制备bFGF储液；
(2)称取2.383g HEPES溶于700mL超纯水中，用氢氧化钠溶液调节pH＝7.4，定容至1000mL，过滤除菌，制备HEPES缓冲液(10mM,pH＝7.4)；
(3)称取302.6mg ATP二钠盐溶于50mL无菌去离子水中，配制20mM的ATP溶液；称取27.26g氯化锌粉末溶于100mL去离子水中，加盐酸助溶，得到浓度为2M的Zn2+母液，将其稀释至20mM制备Zn2+储液；
(4)将50μL bFGF储液、5μL ATP溶液、5μL Zn2+储液和40μL HEPES缓冲液混合，制备100μL内水相溶液；
(5)将200mg聚己内酯溶于2mL氯仿中，制备浓度为10％(w/v)的聚己内酯溶液作为外油相溶液；
(6)向步骤(5)得到的2mL聚己内酯溶液中加入1.5％(v/v)(30μL)Span80，混匀，在冰浴搅拌下，将步骤(4)得到的100μL内水相溶液滴加入上述溶液中，并采用超声法乳化5min，得到乳液；
(7)将乳液进行静电纺丝，使用5号针头、注射泵流速设为0.5mL/h、电压设置为25kV、收集板距离设置为20cm。电纺完成后将纤维膜置于通风橱过夜，以去除残留的有机溶剂，得到bFGF-ATP-Zn/PCL。
所制备获得的纳米纤维直径经SEM测定为250±96nm。
对比例1
本对比例提供一种不含bFGF的纳米敷料(简称PBS/PCL)，作为空白对照，其制备方法为：
(1)将200mg聚己内酯溶于2mL氯仿中，制备浓度为10％(w/v)的聚己内酯溶液作为外油相溶液；
(2)向步骤(1)得到的2mL聚己内酯溶液中加入1.5％(v/v)(30μL)Span80，混匀，在冰浴搅拌下，将100μL PBS溶液(pH＝7.2)滴加入上述溶液中，并采用超声法乳化5min，得到乳液；
(3)将乳液进行静电纺丝，使用5号针头、注射泵流速设为0.5mL/h、电压设置为25kV、收集板距离设置为20cm。电纺完成后将纤维膜置于通风橱过夜，以去除残留的有机溶剂，得到PBS/PCL。
对比例2
本对比例提供一种bFGF凝胶剂，作为bFGF纳米敷料的对照，其制备方法如下：
(1)取卡波姆940 0.85g，用15g甘油和5g 1,2-丙二醇分散均匀，加入0.1M NaOH57g，补10mM PBS至100g，搅拌均匀，80℃水浴加热30min，制备凝胶基质；
(2)将步骤(1)得到的凝胶基质采用高压蒸汽灭菌锅(105Kpa，121℃)灭菌30min，降温冷却；
(3)将1mL步骤(2)得到的凝胶基质与100μL bFGF溶液(4μg/mL)混匀，即得bFGF凝胶剂。
测试例1
本测试例为bFGF缓释纳米敷料的纤维形貌结构及接触角表征，具体用到的表征方法为：用SEM和接触角对所述bFGF缓释纳米敷料表面形貌进行表征，接触角测试数据如表1所示，SEM示意图如图2所示；用TEM对芯壳结构进行表征，测试结果如图3所示。
表1
Figure BDA0003090127740000181
Figure BDA0003090127740000191
由图2可知：实施例1的bFGF/PCL纳米敷料具有较多的穗状细丝，实施例2的bFGF-Zn/PCL表面有许多刺突，实施例3的bFGF-ATP/PCL和实施例4的bFGF-ATP-Zn/PCL的表面形貌较好。由表1可知，实施例1的bFGF/PCL具有一定亲水性，而实施例2-4的bFGF纳米敷料的水接触角明显增加，说明疏水性增加。
测试例2
本测试例为bFGF缓释纳米敷料的力学性能表征，具体方法为：将纳米敷料固定于夹具上，采用动态机械分析仪(DMA)对纳米敷料施加拉伸外力，直到膜断裂，得到测试结果如表2所示。
表2
纳米敷料类型 拉伸强度(MPa) 断裂伸长率(％)
实施例1 bFGF/PCL 3.12 73.43
实施例2 bFGF-Zn/PCL 9.79 111.81
实施例3 bFGF-ATP/PCL 9.93 88.13
实施例4 bFGF-ATP-Zn/PCL 10.46 111.92
由表2可知，实施例1的bFGF/PCL纳米敷料具有较低的拉伸强度和断裂伸长率；在实施例2-4中，ATP和Zn2+的加入使载bFGF纳米敷料的拉伸强度和断裂伸长率显著提高，实施例4的效果最佳。特别是在实施例2和实施例4中，Zn2+的加入使纳米纤维膜最大断裂伸长率能够达到100％以上，这对于发生在指关节、踝关节等频繁移动部位的伤口具有十分重要的应用意义。
测试例3
本测试例为bFGF缓释纳米敷料的体外释放性能评价测试，具体方法如下：
(1)将各组bFGF缓释纳米敷料裁剪成质量为3mg，精确称重后浸入2mL无菌PBS溶液中，在37℃摇床中以100rpm的恒定速率震荡；
(2)在预定时间从离心管中全部取出2mL释放液，同时补加新鲜PBS溶液2mL，继续放入摇床中；
(3)按照试剂盒的说明采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对步骤(2)中取出的释放液进行浓度测定；测试结果如图4和表3所示。
表3
纳米敷料类型 14天释放(％)
实施例1 bFGF/PCL 33.54
实施例2 bFGF-Zn/PCL 27.36
实施例3 bFGF-ATP/PCL 28.12
实施例4 bFGF-ATP-Zn/PCL 22.76
由表3的测试数据可知，与实施例1相比，bFGF-ATP-Zn三元复合物及bFGF-ATP、bFGF-Zn二元复合物的形成使纳米敷料中的bFGF具有明显的缓释效果，其中bFGF-ATP-Zn/PCL纳米敷料的缓释效果最优。
测试例4
本测试例为bFGF缓释纳米敷料的血液相容性评价测试，具体为采用红细胞进行bFGF纳米敷料溶血率检测，方法如下：
(1)将各组bFGF缓释纳米敷料裁剪成直径1.5cm的圆片，每面经紫外照射各15min，置于24孔培养板底部；
(2)Balb/c小鼠眼球取血，将1mL血离心去除上层血清以分离红细胞，洗涤两次，用30mL PBS(10mM，pH＝7.2)重悬稀释，将1mL稀释后的红细胞加入到24孔培养板的纳米敷料上，37℃孵育1h；
(3)收集各孔浸提液，1000rpm离心10min，分离上清液，用酶标仪测定上清在540nm处的吸光度，以红细胞中添加0.1％Triton X-100作为阳性对照(n＝4)，以红细胞中添加0.1％PBS作为空白对照；
(4)溶血率的计算方法为：(样品组的吸光度-空白组吸光度)/(阳性对照组吸光度-空白组吸光度)×100％；测试结果如表4所示。
表4
纳米敷料类型 溶血率(％)
实施例1 bFGF/PCL 14.72
实施例2 bFGF-Zn/PCL 3.36
实施例3 bFGF-ATP/PCL 7.29
实施例4 bFGF-ATP-Zn/PCL 3.13
对比例1 PBS/PCL 15.02
由表4可知，对比例1中的PBS/PCL纳米纤维膜具有相对较高的溶血率；实施例1中bFGF/PCL的溶血率(14.72％)与对比例1相当。添加ATP或Zn2+之后，实施例2-4的溶血率大幅度下降，这说明ATP或Zn2+的加入有效提高了载bFGF纳米敷料的血液相容性，其中实施例4的血液相容性最好。
测试例5
本测试例为bFGF缓释纳米敷料的细胞相容性评价测试，具体为使用人真皮成纤维细胞进行纳米敷料的细胞增殖实验，方法如下：
(1)将各组bFGF缓释纳米敷料裁剪成直径1.5cm的圆片，每面经紫外照射各15min，置于24孔培养板底部，待人真皮成纤维细胞生长到充分融合后，胰蛋白酶消化，计数，以每孔5.0×104的细胞数量种植在各孔板中的纳米敷料上，每两天更换一次培养基；使用CCK-8试剂盒检测纳米敷料上细胞的粘附与增殖情况。在接种细胞2d、4d、6d后，PBS清洗，每孔加入400μL含10％CCK8的DMEM培养基，37℃孵育2h，随后每孔吸出150μL加入96孔板中，用酶标仪在450nm波长读板；测试结果如表5所示；
表5
Figure BDA0003090127740000221
由表5可知，实施例1-4和对比例1-2的细胞增殖活性在6天时间内均有所增加。与对比例1相比，实施例1-2、4所制备的bFGF纳米敷料OD值较高，说明细胞活性较高；而对比例2中的bFGF凝胶具有最高的OD值，这是由于凝胶在液体培养基中溶解，bFGF从凝胶基质中快速释放导致；采用实施例3制备的bFGF-ATP/PCL纳米敷料的OD值最低。实施例4在第6天时的OD值接近对比例2中的bFGF凝胶，具有四种实施例中最优的细胞增殖活性，与实施例1相比，细胞活性提高了1.39倍，由此说明bFGF、ATP和Zn2+对于细胞增殖具有协同作用。
(2)成纤维细胞胶原分泌情况采用天狼星红染色表征，在接种细胞第6天后，将不锈钢环取下，PBS清洗纤维膜，在25℃下以4％多聚甲醛固定30min，去离子水清洗后以天狼星红染色液浸染1h，水洗去除多余染料，使用光学显微镜进行染色观察分析，测试结果如图5所示；使用image J软件进行半定量分析，分析结果如表6所示。
表6
纳米敷料类型 胶原容积(％)
实施例1 bFGF/PCL 6.02
实施例2 bFGF-Zn/PCL 6.97
实施例3 bFGF-ATP/PCL 2.13
实施例4 bFGF-ATP-Zn/PCL 20.78
对比例1 PBS/PCL 4.05
对比例2 bFGF凝胶 29.33
由表6可知，在实施例1-4中，实施例4中bFGF-ATP-Zn/PCL的胶原容积最高(20.78％)，但与对比例2相比仍有差距(29.33％)；实施例3制备的bFGF-ATP/PCL胶原分泌量最低，仅有2.13％。上述结果证实，实施例4所制备的bFGF-ATP-Zn/PCL具有良好的生物相容性，将其应用于体外细胞培养能有效促进细胞增殖和胶原分泌。
测试例6
本测试例为bFGF缓释纳米敷料的创面愈合效果测试，具体方法为：
BALB/c小鼠称重后随机分成5组，每组4只，待小鼠麻醉后用电动剃刀剃除背部毛发，为防止新生毛发生长过快产生干扰，对局部进行脱毛膏处理。经碘伏消毒后使用眼科剪在小鼠背部制造直径6mm左右全皮层伤口，手术后拍照记录初始伤口面积，伤口处碘伏消毒，按照各实验组要求覆盖相应经灭菌处理的敷料，使用圆形创可贴和无菌纱布进行敷料的固定，待创伤发生后的3、7、10、14天，观察创面部位的愈合情况并拍照记录面积，测试结果如图6所示，通过image J软件计算伤口的愈合率，计算结果如表7所示。
表7
Figure BDA0003090127740000241
由表7可知，实施例4制备的bFGF-ATP-Zn/PCL纳米敷料具有最快的创面愈合速度，14天时具有最小的伤口面积。由此可以证明，本发明提供的bFGF缓释纳米敷料中，bFGF-ATP-Zn三元复合体系与纳米纤维协同配合，共同加速创面愈合。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料，其特征在于，所述bFGF缓释纳米敷料是由包含有碱性成纤维细胞生长因子、三磷酸腺苷或其盐、金属离子的乳液制得的静电纺丝纳米纤维膜。
2.如权利要求1所述的具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料，其特征在于，所述乳液包括包含有碱性成纤维细胞生长因子、三磷酸腺苷或其盐、金属离子的内水相和包含有生物相容性高分子材料的外油相；
优选地，所述三磷酸腺苷或其盐包括三磷酸腺苷、三磷酸腺苷二钠盐、三磷酸腺苷镁盐、三磷酸腺苷四锂盐中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述金属离子包括锌离子、镁离子、铜离子、亚铁离子或镍离子中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述生物相容性高分子材料包括聚乳酸、聚羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚四氟乙烯、聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物中的任意一种或至少两种的组合。
3.如权利要求1或2所述的具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生长因子、三磷酸腺苷或其盐、金属离子通过静电作用和配位作用形成三元复合体系；
优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子、金属离子、三磷酸腺苷或其盐的比例为(1-100)mg:(0.01-10)mmol:(0.01-10)mmol；
优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子、金属离子、三磷酸腺苷或其盐的比例为(2-50)mg:(1-5)mmol:(1-5)mmol。
4.如权利要求1-3任一项所述的具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料，其特征在于，所述静电纺丝纳米纤维膜的纳米纤维直径为250-550nm。
5.如权利要求1-4中任一项所述的具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将包含有碱性成纤维细胞生长因子、三磷酸腺苷或其盐、金属离子的乳液进行静电纺丝，干燥，制得所述具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的参数包括：纺丝液流速0.2-0.8mL/h、纺丝电压20-30kV、针头与收集板的距离15-25cm、纺丝针头4-7号；
优选地，所述干燥为自然干燥、烘干、真空烘干或冷冻干燥。
7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述乳液的制备方法包括如下步骤：
(1)将碱性成纤维细胞生长因子、缓冲液、金属盐、三磷酸腺苷或其盐混合，制得内水相溶液；将生物相容性高分子材料和有机溶剂混合，制得外油相溶液；
(2)将内水相溶液、外油相溶液和乳化剂混合乳化，即得所述乳液。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或HEPES缓冲液中的任意一种或两种的组合；
优选地，所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜或四氢呋喃中的任意一种或两种的组合；
优选地，所述外油相溶液中生物相容性高分子材料的浓度为2-20％(w/v)，优选5-12％(w/v)。
9.如权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中内水相溶液与外油相溶液的体积比为0.1-10％(v/v)，优选0.5～6％(v/v)；
优选地，步骤(2)具体操作方法包括：将乳化剂与外油相溶液混匀后，在冰浴搅拌下向其中逐滴加入内水相溶液，乳化，即得所述乳液；
优选地，所述乳化剂包括非离子型乳化剂、两性离子型乳化剂、阴离子型乳化剂或阳离子型乳化剂中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述非离子型乳化剂包括Span20、Span40、Span60、Span80、Span85、Tween20、Tween40、Tween60、Tween80或Tween85中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述两性离子型乳化剂包括卵磷脂、氨基酸型乳化剂、甜菜碱型乳化剂或硬脂酸三乙醇胺皂中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述阴离子型乳化剂包括十二烷基苯磺酸钠、油酸、月桂酸、硫酸化蓖麻油或硬脂酸钙中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述阳离子型乳化剂包括苄基三乙基氯化铵、季铵盐类化合物或烷基铵盐化合物中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述乳化剂在所述外油相溶液中的添加量为0.1-5％(v/v)，进一步优选为0.2-2％(v/v)；
优选地，所述乳化的方法包括磁子搅拌法、均质分散法、超声乳化法、注射器互推法或膜乳化法中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述乳化的时间为1-30min，优选2-12min。
10.如权利要求1-4中任一项所述的具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料在制备促进创面愈合材料中的应用。
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