CN106334210A - 一种多功能胶原蛋白纳米纤维修复膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种多功能胶原蛋白纳米纤维修复膜的制备方法，包括如下步骤：1)配制含生长因子胶原蛋白/聚己内酯溶液；2)配置含T4噬菌体胶原蛋白/聚己内酯溶；3)采用静电纺丝技术迅速获得纳米纤维修复膜。该纳米修复膜集快速止血、长效抑菌、细胞修复为一体，有望为病人提供全功能伤口护理。

Description

一种多功能胶原蛋白纳米纤维修复膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种多功能胶原蛋白纳米纤维修复膜及其制备方法。
背景技术
在外伤或者手术之后，伤口愈合以及对外伤口的纱布修复主要依托两个现象：上皮形成和肉芽组织收缩，而后者对于保护组织连续性和减小伤口大小至关重要。收缩时，相邻的肌纤维细胞会很快转变为成肌纤维细胞，其特点在于张力纤维和平滑肌动蛋白这两个标志会存在。尤其是，在伤口收缩期肌纤维细胞转变为成肌纤维细胞的这一异化过程会体现出一个重要的事情，即这个过程会通过机械应力和TGFβ1发信号来相互影响。具体来说，生长因子TGFβ1被认为是肌纤维细胞转变为成肌纤维细胞的直接诱因，这表明smad2和smad3的活化、smad复合体到细胞核的迁移以及αSMA表达的上调节。Lee等人报告了只有当用适量浓度的TGFβ1对肌纤维细胞进行短时间的刺激时，试管中的类成肌纤维细胞中的胶原蛋白凝胶基质会强烈地收缩，否则细胞将发生永久的纤维化。因此，通过短期控制TGFβ1浓度的方式，对于某些伤口痊愈是有帮助的。
再生医学的最新方向目前主要集中在如何制备出类似细胞外基质(ECM)的细胞支架，从而实现在多维度空间中，短暂控制可调节细胞功能的生长因子释放速率。静电纺丝是一种多功能的聚合物纳米生产技术，这让具有混合了活性生长因子并具有微纳米结构细胞支架变得很容易制备，同时此细胞支架又会作为模拟细胞外基质，并提供同样的尺度和功能。可以被广泛制成纳米纤维的典型聚合物包括：合成聚酯纤维，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙酸内酯(PCL)等，以及天然聚合物如明胶、蚕丝、壳聚糖和纯化I型胶原蛋白(以下简称胶原蛋白，Coll)等。而胶原蛋白作为细胞外基质的一种主要结构化蛋白质，已经被广泛应用到医疗器械方面，如伤口敷料、皮肤再生、药物缓释、角膜替代、组织工程支架等方面。
发明内容
本发明目的是提供一种多功能胶原蛋白纳米纤维修复膜及其制备方法，与直接静脉给药或口服用药相比，采用组织工程方式针对性给药可作为治疗某一特定部位的长效药，这能够在增强药物效用的同时，缩小副作用和防止药物分解，本发明纳米纤维修复膜为含有TGFβ1生长因子的PCL/Coll静电纺丝纤维，可被用作一种特殊的止血材料兼人工细胞外基质(ECM)，通过调节PCL/Coll的混合比例研究其止血抑菌效果，同时控制TGFβ1的释放，从而调节成肌纤维细胞分化速率。该纳米修复膜集快速止血、长效抑菌、细胞修复为一体，有望为病人提供全功能伤口护理。
本发明采用的技术方案为：
一种多功能胶原蛋白纳米纤维修复膜的制备方法，包括如下步骤：
1)含生长因子胶原蛋白/聚己内酯溶液的配置
由于纯化I型胶原蛋白(以下简称胶原蛋白，Coll)可纺性差，因此加入聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)进行混纺。将聚己内酯PCL按照5～15：100的质量比溶解于六氟异丙醇中得溶液A，将胶原蛋白Coll按照5～15：100的质量比溶解于六氟异丙醇中得溶液B；
再将溶液A和溶液B混合并利用磁力搅拌装置连续搅拌4-8h，直至得到均一透明的高分子PCL/Coll纺丝溶液。再将转化生长因子TGFβ1以10-3％～10-4％，w/w的配比均匀添加到PCL/Coll纺丝溶液中，得到含生长因子胶原蛋白/聚己内酯溶液。
2)含T4噬菌体胶原蛋白/聚己内酯溶液的配置
将聚己内酯PCL按照0.5～15：100的质量比溶解于六氟异丙醇中得溶液C，将胶原蛋白Coll按照0.5～15：100的质量比溶解于六氟异丙醇中得溶液D，再将溶液C和溶液D混合并利用磁力搅拌装置连续搅拌1-8h，直至得到均一透明的高分子PCL/Coll纺丝溶液。将培养好的T4噬菌体集中液以0.1～1.5/100,v/v的配比迅速均匀的添加到的PCL/Coll纺丝溶液中，得到含T4噬菌体胶原蛋白/聚己内酯溶液。
3)静电纺丝参数的设定
采用静电纺丝技术可以迅速获得质地均匀的纳米纤维膜，如图1所示静电纺丝示意图。具体工艺参数如下：电压，5～20kV；进料速率，0.1～1mL/h；沉积时间，3～6h；纺丝距离，8～20cm；相对湿度，20-35％；室温。所有的纤维经纺丝后置于冷冻干燥机中24～36h，完全干燥后存储于-20℃。
附图说明
图1为静电纺丝示意图。
图2-1为加载TGFβ1的PCL/Coll纤维的表面形貌图。
图2-2为加载TGFβ1的PCL/Coll纤维直径分布图。
图3为PCL/Coll混纺纤维与纯PCL、纯Coll的可混合性对比研究。
图4为PCL/Coll复合混纺纤维拉伸强度对比。
图5为PCL/Coll混纺纤维与PCL和Coll的接触角变化对比
图6-1为纯胶原纤维加载了不同浓度的TGFβ1对细胞增殖率的影响。
图6-2为PCL/Coll混纺纤维加载1ng/mg TGFβ1对细胞增殖率的影响。
图7为在兔耳动脉和肝损伤模型中不同止血膜的出血量。
图8为不同样品的微观结构图：(a)噬菌体TEM图；(b)含噬菌体的PCL/CollB混纺纤维SEM图；(c)、(d)含噬菌体的PCL/CollB混纺纤维微观TEM图。
图9为RT-PCR基因表达检测情况。其中，(a)小鼠成肌纤维细胞标志基因αSMA；(b)小鼠肌纤维细胞标志基因FSP1；(c-h)为第三天不同材料上的细胞分化情况；(i–n)为第五天不同材料上的细胞分化情况；(o–t)为第七天不同材料上的细胞分化情况。
图10是植入期为1周、2周、4周、8周的Coll及PCL/Coll B病理组织学照片。
具体实施方式
实施例1 一种多功能胶原蛋白纳米纤维修复膜的制备方法
包括如下步骤：
1)含生长因子胶原蛋白/聚己内酯溶液的配置
将聚己内酯PCL按照10％的质量比溶解于六氟异丙醇中得聚己内酯六氟异丙醇溶液，将胶原蛋白Coll按照10％的质量比溶解于六氟异丙醇中得胶原蛋白六氟异丙醇溶液，将聚己内酯六氟异丙醇溶液和胶原蛋白六氟异丙醇溶液按照w/w，40/60的配比混合并利用磁力搅拌装置连续搅拌6h，直至得到均一透明的PCL/Coll B纺丝液(40/60,w/w)。
再将转化生长因子TGFβ1按照高浓度(10-3％，w/w)均匀添加到PCL/Coll B纺丝液(40/60,w/w)，得到含生长因子胶原蛋白/聚己内酯溶液。
2)含T4噬菌体胶原蛋白/聚己内酯溶液的配置
将聚己内酯按照10％的质量比溶解于六氟异丙醇中得聚己内酯六氟异丙醇溶液，将胶原蛋白Coll按照10％的质量比溶解于六氟异丙醇中得胶原蛋白六氟异丙醇溶液，将聚己内酯六氟异丙醇溶液和胶原蛋白六氟异丙醇溶液按照(40/60,w/w)的配比混合并利用磁力搅拌装置连续搅拌6h，直至得到均一透明的PCL/Coll B纺丝液(40/60,w/w)。将培养好的T4噬菌体集中液按照1/100,v/v的配比迅速均匀的添加到PCL/Coll B纺丝液(40/60，w/w)，得到含T4噬菌体胶原蛋白/聚己内酯溶液。
3)采用静电纺丝技术迅速获得质地均匀的纳米纤维膜。具体工艺参数如下：电压，20kV；进料速率，1mL/h；沉积时间，3h；纺丝距离，10cm；相对湿度，20-35％；室温。所有的纤维经纺丝后置于冷冻干燥机中24h，完全干燥后存储于-20℃。
实施例2 对比试验
第一组：仅改变实施例1步骤1)中将转化生长因子TGFβ1按照高浓度10-3％，w/w均匀添加到纯Coll纺丝液中；步骤2)中将培养好的T4噬菌体集中液按照1/100,v/v的配比迅速均匀的添加到纯Coll纺丝液中；其他过程不变。
第二组：仅改变实施例1步骤1)中将转化生长因子TGFβ1按照高浓度10-3％，w/w均匀添加到PCL/Coll A纺丝液(33.3/66.7,w/w)中；步骤2)中将培养好的T4噬菌体集中液按照1/100,v/v的配比迅速均匀的添加到PCL/Coll A纺丝液(33.3/66.7,w/w)中；其他过程不变。
第三组：实施例1。
第四组：仅改变实施例1步骤1)中将转化生长因子TGFβ1按照高浓度10-3％，w/w均匀添加到PCL/Coll C纺丝液(50/50,w/w)中；步骤2)中将培养好的T4噬菌体集中液按照1/100,v/v的配比迅速均匀的添加到PCL/Coll C纺丝液(50/50,w/w)中；其他过程不变。
第五组：仅改变实施例1步骤1)中将转化生长因子TGFβ1按照高浓度10-3％，w/w均匀添加到PCL/Coll D纺丝液(66.7/33.3,w/w)中；步骤2)中将培养好的T4噬菌体集中液按照1/100,v/v的配比迅速均匀的添加到PCL/Coll D纺丝液(66.7/33.3,w/w)中；其他过程不变。
第六组：仅改变实施例1步骤1)中将转化生长因子TGFβ1按照高浓度10-3％，w/w均匀添加到纯PCL纺丝液中；步骤2)中将培养好的T4噬菌体集中液按照1/100,v/v的配比迅速均匀的添加到纯PCL纺丝液中；其他过程不变。
实验及分析：
1、如图2-1和2-2所示将上述所制的多种静电纺丝膜采用SEM分析其表面形貌，上述制备的多种静电纺丝膜具有特殊的多孔形貌。其中100％Coll的可纺性很差，静电纺丝所制的胶原纤维尺寸极不均匀，表面不光滑，连续性极差，纤维直径7.45±2.21μm。100％PCL的呈纤性良好，纤维直径分布在0.78±0.54μm。因此将PCL与Coll混纺时，随着增加PCL的比例，所得纤维原液可纺性明显提升，纤维表面光滑性提升纤维直径逐渐降低：PCL/Coll A直径为1.67±0.72μm；PCL/Coll B直径为1.49±0.87μm；PCL/Coll C直径为1.19±0.38μm；PCL/Coll D直径为1.08±0.44μm。所有的纤维直径分布如图2-2中的直方图所示。从图2-1的SEM图中可知，微量的TGFβ1及T4噬菌体对纤维宏观形貌并无太大影响。
2、通过采用DSC的分析方法检测了PCL以及胶原蛋白两种材料的可混合性。图3中所示，胶原蛋白的吸热变性温度在214.88℃，这与文献中报道的经冷冻干燥的纯胶原蛋白吸热变形温度相符合，而纯PCL的吸热变性温度则在56℃，这与其熔点温度(Tm)相一致。所制备的四种不同比例的PCL/Coll混纺纤维均采用六氟异丙醇作为溶剂，所获得的DSC谱图中，吸热变性温度也同纯PCL的熔点一致，在56℃附近。因此，PCL与胶原蛋白在六氟异丙醇中的可混性极好，在静电纺丝喷出固化的过程中，两种不同材料之间没有在复合纤维中出现分相。
3、拉伸强度实验用于测试材料在轴向拉伸负荷下的性能。图4显示，PCL力学性能最佳，在复合物中，随着胶原蛋白的质量分数的增加，材料的拉伸性能逐渐降低。其中，由于该材料未经过固化剂交联，100％Coll的拉伸强度最差为304±102kPa；100％PCL具有极佳的柔韧性，其拉伸强度为4754±100kPa。PCL/Coll A的拉伸强度为711±98kPa；PCL/Coll B的拉伸强度为1398±76kPa；PCL/Coll C的拉伸强度为1904±97kPa；PCL/Coll D的拉伸强度为2808±150kPa。
4、材料的宏观润湿性，通过检测液体与材料基体之间的接触角来检验。图5中详细描述了不同材料的接触角及其接触角终态图。100％PCL的材料接触角极大，液体几乎完全不润湿，而100％Coll的接触角极小，润湿性极好，液滴几乎立刻在基材上铺展开来。掺杂胶原蛋白后的PCL/Coll混纺纤维相对于两种初始材料来看，具有了更为温和的接触角，材料的润湿性处于适中的状态。这主要是由于胶原蛋白具有羧基和氨基是一种亲水性极佳的材料，它的加入增强了材料的润湿性。
5、不同材料对细胞增殖率的影响：(a)纯胶原纤维加载了不同浓度的TGFβ1，(b)PCL/Coll混纺纤维加载1ng/mg TGFβ1。如图6-1所示，所有的细胞均在培养7天后发生细胞增殖，同时细胞在TGFβ1的条件刺激下获得的对照组TCPt比未添加TGFβ1的普通对照组TCP组显现出了更高的增长率。在Coll L纤维上加载极其微量的TGFβ1(1ng/mg)对NIH3T3小鼠成纤维细胞增殖有明显的刺激。然而，当TGFβ1的加载量扩大十倍后，Coll H纤维里的TGFβ1含量达到10ng/mg，但是细胞的增殖却被抑制了，这说明高浓度的TGFβ1对细胞有相当大的细胞毒性。因此，TGFβ1的加载浓度为1ng/mg对于PCL/Coll混纺纤维是最为适宜的，这样的浓度既保证了其分化功能，又不至于对细胞产生毒副作用。就像在图6-2所示，PCL/Coll A纤维在第五天之前对细胞有显著的诱导增殖作用，随后细胞数量迅速衰退，这主要是由于在第一周末期，TGFβ1有一个***式的大量释放，对细胞瞬时毒性增加。在所有的组别中，包括PCL/Coll混纺组和TCPt组，细胞在PCL/Coll B组里拥有最好的增殖及分化性能。
6、止血性能测试
通过兔肝部及耳部动脉的出血模型，以纯胶原及纯PCL作为参照，对不同配比的PCL/Coll膜进行了止血性能评估。从表1中所示，纯PCL及PCL/Coll D的肝部及耳部止血时间均大于500s，几乎没有止血效果。
当使用胶原蛋白含量高的混纺止血膜覆盖在肝部创口表面上时，平均止血时间迅速降低，其中，PCL/Coll A，PCL/Coll B，PCL/Coll C的平均止血时间分别为95.34±10.05*(耳部)、67.05±7.15*(肝部)；106.66±12.31*(耳部)、75.56±3.89*(肝部)；320.63±41.01*(耳部)、298.67±31.58*(肝部)。通过数据分析，与纯胶原膜比较，其组间存在明显差异(P<0.05)，具有统计学意义。随后，通过出血量的称量(图7)，可以更好的明确不同材料的止血效果。纯PCL的表面浸润性最差，血液没有被材料吸收，因此其获得的出血量最小。纯胶原组的出血量较大，这是由于胶原膜具有很好的表面浸润性，所有的血液均被材料吸收。PCL/Coll混纺膜中，由于添加了不同比例的纯胶原，其表面浸润性和止血时间有很大变化。PCL/Coll A、PCL/Coll B的出血量相当，而PCL/Coll C中虽PCL的含量更多但却吸收了更多的出血量，说明此材料的止血效果一般。通过数据分析，所有组间均存在明显差异(P<0.05)，具有统计学意义。
因此，从材料的止血效果来讲PCL/Coll A、PCL/Coll B止血膜具有较短的止血时间和较少的出血量。由于在这两种材料中胶原蛋白含量比较高，而胶原蛋白在止血过程中发挥主要作用，因此，PCL/Coll A、PCL/Coll B的止血实验效果最佳。
表1 两种创伤模型中不同止血膜的平均止血时间
Table 1The mean hemostatic time of different film in two rabbitinjury models
Statistical analysis was performed by T-text
(*P<0.05compared to the Coll group).
7、噬菌体活性的及纤维的形貌观察
噬菌体的微观形态极具特点，是有头部及尾部组成，如图8a中所示，其中所有的遗传物质均存在于头部之中。将T4phages添加至PCL/Coll混纺纤维中后，SEM图中未看到任何变化，与未添加时基本一致，但是在更为精准的TEM图片中可看到单根纤维上均匀分布了T4phages(图8b-d)。
8、荧光共聚焦显微镜观察
为了进一步说明细胞分化的进程，继续采用荧光显微镜观察细胞在细胞分化过程中的形貌变化，以及标志蛋白表达变化情况。其中，细胞核采用Hoechst染色(蓝色细胞核)，细胞骨架中的朊纤蛋白丝采用phalloidin染色(绿色细胞骨架)，成肌纤维细胞的标志物αSMA蛋白采用第一抗体(小鼠αSMA)及第二抗体(红色染料)进行标定。
图9为RT-PCR基因表达检测情况：(a)小鼠成肌纤维细胞标志基因αSMA(b)小鼠肌纤维细胞标志基因FSP1。αSMA的荧光免疫分析(红色)分别在TCP(无TGFβ1)，TCPt(含10ng/ml TGFβ1)及不同比例的PCL/Coll混纺纤维(含1ng/mg TGFβ1)的分化状态。其中，(c-h)为第三天不同材料上的细胞分化情况，(i–n)为第五天不同材料上的细胞分化情况，(o–t)为第七天不同材料上的细胞分化情况。图9c-t中是肌纤维细胞向成肌纤维细胞分化进程的荧光免疫显微图。在最初的三天内，没有明显的αSMA蛋白表达(图9c-h)。在第五天时，与阴性对照TCP组相比(图9i)，仅有少量的αSMA蛋白可以在阳性对照TCPt组(图9j)与PCL/Coll B纤维组(图9l)可检出。经过七天的培养后，大量的αSMA蛋白在阳性对照组(图9p)，PCL/CollA(图9q)及PCL/Coll B(图9r)中表达出来，然而只有在阴性对照组TCP(图9o)及PCL/Coll B纤维组(图9r)中，细胞才有健康正常的形貌，其他组中细胞形貌不良，活性较差。
这样的结果说明，结合RT-PCR的微观量化分析及荧光共聚焦显微镜宏观观察，PCL/Coll B纤维上的细胞具有最佳的细胞形态，同时大部分分化成了成肌纤维细胞。
9、根据材料的止血效果、抑菌效果以及其他的理化性能、生物安全性、细胞分化行为研究，PCL/Coll B复合止血膜具有最优的综合效果，因此，仅采用纯Coll膜及PCL/Coll B膜进行动物体内降解实验。
从图10中可看出，当Coll膜植入兔腿部肌肉或背部皮下之后，材料周围炎症反应不明显，在植入一周时，材料被分解为细小碎片；植入两周时，材料的碎片进一步被巨噬细胞包围；当植入四周后，Coll膜已经几乎消失，但植入区域内依然存在大量的炎症细胞，发生了炎性浸润反应；当植入八周后，兔腿部肌肉完全复原，而背部皮下组织也重新长出毛囊恢复原有的细胞形态及组织功能。
相比Coll膜的体内降解情况，PCL/Coll B膜的降解速率由于添加了降解周期较长的PCL后大幅降低。在植入一周时，PCL/Coll B膜依然为较大的碎片，材料周围存在比较严重的炎性细胞，同时由于材料较大，植入部位组织遭到严重破坏，存在大量坏死细胞；当植入两周时，PCL/Coll B膜在复杂的体内环境中被分解为尺寸较小的碎片，其周围的坏死细胞数量有所减少；当植入三周时，兔腿部肌肉中的PCL/Coll B膜基本被吸收，而兔背部皮下依然有极小的材料碎片存在，这主要是由于腿部肌肉部分毛细血管丰富，兔运动时腿部血液流速较快，细胞代谢速率较快，而背部皮下由于血液循环相对较慢，因此代谢速率也较慢；而当植入八周后，两种模型中PCL/Coll B膜均未检出，但是相比较纯Coll的植入实验而言，PCL/Coll B膜的病理图中依然可以看到少量的炎性细胞，但是细胞形态基本良好，组织功能基本恢复，可以看到形态正常的肌纤维细胞及背部皮下的毛囊组织。

Claims (8)

1.一种多功能胶原蛋白纳米纤维修复膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)配制含生长因子胶原蛋白/聚己内酯溶液，将聚己内酯溶解于六氟异丙醇中得溶液A，将胶原蛋白溶解于六氟异丙醇中得溶液B；再将溶液A和溶液B混合并利用磁力搅拌装置连续搅拌，得到均一透明的胶原蛋白/聚己内酯纺丝溶液，再将转化生长因子TGFβ1均匀添加到胶原蛋白/聚己内酯纺丝溶液中，得到含生长因子胶原蛋白/聚己内酯溶液；
2)配置含T4噬菌体胶原蛋白/聚己内酯溶液，将聚己内酯溶解于六氟异丙醇中得溶液C，将胶原蛋白溶解于六氟异丙醇中得溶液D，再将溶液C和溶液D混合并利用磁力搅拌装置连续搅拌，得到均一透明的胶原蛋白/聚己内酯纺丝溶液，将T4噬菌体集中液迅速均匀的添加到的胶原蛋白/聚己内酯纺丝溶液中，得到含T4噬菌体胶原蛋白/聚己内酯溶液；
3)采用静电纺丝技术迅速获得纳米纤维修复膜。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)的胶原蛋白/聚己内酯纺丝溶液中胶原蛋白与聚己内酯的质量比为66.7-33.3:33.3-66.7。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)的聚己内酯是按照5～15：100的质量比溶解于六氟异丙醇进行配置；胶原蛋白是按照5～15：100的质量比溶解于六氟异丙醇进行配置。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)转化生长因子TGFβ1以10-3％～10-4％，w/w的配比均匀添加到胶原蛋白/聚己内酯纺丝溶液中。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)T4噬菌体集中液以0.1～1.5/100,v/v的配比迅速均匀的添加到的胶原蛋白/聚己内酯纺丝溶液中。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)利用磁力搅拌装置连续搅拌4-8h。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)利用磁力搅拌装置连续搅拌1-8h。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)静电纺丝具体工艺参数如下：电压，5～20kV；进料速率，0.1～1mL/h；沉积时间，3～6h；纺丝距离，8～20cm；相对湿度，20-35％；室温，所有的纤维经纺丝后置于冷冻干燥机中24～36h，完全干燥后于-20℃下存储。
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