CN113267629A - 一种抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物检测试剂盒技术领域，公开了一种抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括反应膜条、酶联试剂、显色底物、样本稀释液、浓缩洗涤液和反应终止液；所述反应膜条上包含多条彼此独立的抗原检测线，所述抗原检测线通过包被细胞核成分抗原后采用封闭液封闭；所述封闭液是指含有牛血清白蛋白和磷脂的磷酸盐缓冲溶液。本发明采用特定成分的封闭液对包被细胞核成分抗原进行封闭处理，可以显著增强试剂盒的储存及检测稳定性，且不影响检测准确性。且进一步采用含有正负电荷磷脂成分的封闭液，可在一定程度上提高试剂盒检测灵敏度。具有良好的应用前景。

Description

一种抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物检测试剂盒技术领域，具体涉及一种抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

自身免疫性疾病(Autoimmune Diseases)是由于机体免疫***对自身存在的抗原发生免疫反应，进而导致自身器官组织损害的一类疾病。其发病过程涉及自身抗原的暴露、机体促炎症的微环境、先天免疫***的激活、抗原呈递反应激活获得性免疫***、T细胞的激活以及B细胞释放出大量抗自身抗体等等病理机制。

正常情况下免疫***只对侵入机体的外来物，如细菌、病毒、寄生虫以及移植物等产生反应，消灭或排斥这些异物。在某些因素影响下，机体的组织成份或免疫***本身出现了某些异常，致使免疫***误将自身成份当成外来物来攻击。这时候免疫***会产生针对机体自身一些成份的抗体及活性淋巴细胞，损害破坏自身组织脏器，导致疾病。如果不加以及时有效的控制，其后果十分严重，最终甚至危害生命。在目前自身免疫疾病发病机理不清楚的情况下，最好办法就是早期发现、早期诊断与早期治疗，这是提高自身免疫疾病疗效的关键。

虽然不同的自身免疫疾病各有其特殊的临床表现和诊断标准，但其常具有一个共同特征就是患者的血清中常可以检测出高滴度的自身抗体或能与自身组织成分起反应的致敏淋巴细胞，其中常通过检测血清中抗核抗体(anti-nucleic antibody，ANA)来诊断自身免疫疾病。抗核抗体是以真核细胞的核成分为靶抗原的自身抗体的总称。所用混合抗原中，nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Sc1-70、Jo-1、核小体、dsDNA、组蛋白、核糖体Р蛋白、AMA-M2、PM-Sc1、CENP B及PCNA等是常见抗核抗体的靶成分。

专利CN 102937648 A公开了一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒。包括膜条、酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液，膜条由载片和依次固定在载片上的抗原条带、临界质控带、功能质控线构成，抗原条带由dsDNA、核小体、SmD1、核糖体P0蛋白、组蛋白、U1snRNP、Ro/SS-A(52KD)、Ro/SS-A(60KD)、La/SS-B、Scl-70、CENP-B、Jo-1、AMA-M2、PM-Scl、PCNA、Mi-2和Ku中的至少两个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成。

现有检测试剂盒虽然能够一次性检测多种自身免疫抗体，所能检测的免疫疾病种类也越来越多，但试剂盒的储存稳定期较短，检测效率还有待提高。

专利CN 108398551 A公开了一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法。从酶联免疫试剂盒的封闭液和酶标稀释液入手，通过选择适宜成分，使得酶联免疫试剂盒能够较长时间保持检测的稳定性。同时，以所述组合物制备的抗核抗体检测试剂盒具有较佳稳定性，保质期在2年以上。但其封闭液和酶标稀释液成分复杂，可能对检测准确性产生不利影响，且未对试剂盒的检测灵敏度方面进行改进。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种抗核抗体谱检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述抗核抗体谱检测试剂盒的制备方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种抗核抗体谱检测试剂盒，包括反应膜条、酶联试剂、显色底物、样本稀释液、浓缩洗涤液和反应终止液；所述反应膜条上包含多条彼此独立的抗原检测线，所述抗原检测线通过包被细胞核成分抗原后采用封闭液封闭；所述封闭液是指含有牛血清白蛋白(BSA)和磷脂的磷酸盐(PBS)缓冲溶液。

进一步地，所述细胞核成分抗原是指dsDNA、组蛋白、SmD1、SmB/B’、snRNP-A、snRNP-C、snRNP-68/70、SSA/Ro60、SSA/Ro52、SSB\La、Scl-70、Jo-1、核糖体P0蛋白、PCNA、CENP-B、PM-Scl、AMA-M2、Mi-2、Ku、核小体。

进一步地，所述磷脂选自磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)及磷脂酰肌醇(PI)中的至少一种。

进一步优选地，所述磷脂选自磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)中的至少一种。

进一步优选地，所述封闭液中牛血清白蛋白的质量浓度为0.5％～2％，磷脂的质量浓度为0.5％～2％。

进一步地，所述反应膜条为固定于载片上的硝酸纤维素膜或尼龙膜。

进一步地，所述酶联试剂为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体。

进一步地，所述显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与四唑硝基蓝底物组合(BCIP/NBT)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

进一步地，所述样本稀释液为含有牛血清白蛋白(BSA)的1×TBST缓冲液；所述浓缩洗涤液为10×TBST缓冲液；所述反应终止液为1×PBS缓冲液。

进一步地，所述反应膜条上还包含质控带和阴性对照；所述质控带为0.5-30μg/ml的人源IgG，所述阴性对照为已剥除IgG的人类血清。

上述抗核抗体谱检测试剂盒的制备方法，包括如下制备步骤：

(1)将细胞核成分抗原采用包被液稀释后划线于基质膜上，然后将包被抗原的基质膜置于封闭液中封闭，得到反应膜条；

(2)将步骤(1)所得反应膜条与酶联试剂、显色底物、样本稀释液、浓缩洗涤液和反应终止液组装，得到所述抗核抗体谱检测试剂盒。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明采用特定成分的封闭液对包被细胞核成分抗原进行封闭处理，可以显著增强试剂盒的储存及检测稳定性，且不影响检测准确性。

(2)本发明进一步采用含有正负电荷磷脂成分的封闭液，经发现可提高试剂盒检测灵敏度。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例的一种抗核抗体谱检测试剂盒，通过如下方法制备得到：

(1)分别将dsDNA、组蛋白、SmD1、SmB/B’、snRNP-A、snRNP-C、snRNP-68/70、SSA/Ro60、SSA/Ro52、SSB\La、Scl-70、Jo-1、核糖体P0蛋白、PCNA、CENP-B、PM-Scl、AMA-M2、Mi-2、Ku、核小体。

抗原采用包被液(0.1M的PBS缓冲溶液)稀释至终浓度为200ng/μl，将人源IgG采用包被液(0.1M的PBS缓冲溶液)稀释至终浓度为10μg/ml作为质控样，再采用点样仪将上述包被抗原及质控样以及已剥除IgG的人类血清(阴性对照)划线于硝酸纤维膜上，得到平行的20条抗原带，1条质控带和1条阴性对照带。然后将上述包被后的膜条置于封闭液中，常温封闭0.5h。封闭液组成为含有1wt.％BSA和1wt.％不同磷脂(分别为磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)及磷脂酰肌醇(PI))的1×PBS缓冲溶液，得到反应膜条。

(2)将步骤(1)所得反应膜条与酶联试剂30ml(辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体)、显色底物30ml(BCIP/NBT)、样本稀释液液4×40ml(含有0.5wt.％BSA的1×TBST缓冲液)、浓缩洗涤液50ml(10×TBST缓冲液)和反应终止液40ml(1×PBS缓冲液)组装，得到所述抗核抗体谱检测试剂盒。

采用上述抗核抗体谱检测试剂盒对待测样品进行检测，具体步骤为：

1、样品准备：24小时内保存于4℃冰箱的人血清样本。

2、洗涤液配制：用9份蒸馏水稀释1份10×浓缩洗涤液，混匀配制为标准洗涤液。

3、将反应膜条放入反应孵育盘的反应凹槽，加入1ml标准洗涤液，轻轻晃动至彻底湿润膜条后，移去洗涤液。

4、用样本稀释液按照1血清样本:200稀释液的比例稀释待检测血清样本，将1ml已稀释的样本加入膜条反应凹槽。

5、将孵育盘放于以60rpm/min速度轻轻摇动的摇床上，于室温(25度)孵育5分钟后，弃去反应凹槽内样本溶液。

6、加入2ml标准洗涤液于膜条反应槽，置于摇床室温轻摇，2分钟后弃除洗涤液，重复3次。

7、加入1ml酶联试剂，于室温孵育5分钟后，弃尽反应凹槽内溶液。

8、重复步骤6。

9、加入1ml显色底物，置于摇床上，室温避光孵育5分钟后，弃尽底物溶液。

10、加入2ml蒸馏水洗涤膜条，摇床轻摇1分钟后弃除蒸馏水。

11、加入1ml反应终止液，室温静置1分钟，弃去终止液。

12、重复步骤10。

13、取出膜条，用吸水纸吸干残留液体。

反应完成后，使用全自动凝胶成像分析仪对检测结果进行分析。通过与阴性对照线及质控线的结果进行比对，可判读自免抗体滴度为阴性或阳性。使用全自动判读分析仪器即可判读结果并同时可输出量化检测数值。

一、对以上实施例采用不同磷脂封闭液组成的检测试剂盒进行稳定性测试，对照组试剂盒为为含有1wt.％BSA的1×PBS缓冲溶液封闭液(不加入磷脂)。试剂盒储存温度为2-8℃恒温室。测定对应阳性血清样品初始状态/存放6个月之后的检测信号数值，结果如下表1所示。

表1

通过表1结果可见，本发明采用含有磷脂成分的封闭液对包被细胞核成分抗原进行封闭处理，可以显著增强试剂盒的储存及检测稳定性(存放6个月之后各抗原的检测信号数值变化幅度均在6％以内，而对照组均在12％以上)。说明磷脂成分的两性结构及磷脂双分子层结构有利于抗原成分结构及构象的稳定。且采用磷脂成分PC、PE和PS的封闭液，检测信号值均具有一定程度的提高，推测可能是PC、PE和PS分子结构上带有的正负电荷有利于提高检测的信号值，灵敏度更高。

二、对以上实施例采用不同磷脂封闭液组成的检测试剂盒(以PC和PA磷脂成分封闭液试剂盒作为测试例)进行相关免疫性疾病的检出率比较(相应阳性样本及健康人血样各100例)，对照组试剂盒为为含有1wt.％BSA的1×PBS缓冲溶液封闭液(不加入磷脂)。比较组试剂盒为欧蒙医学实验诊断有限公司生产的检测试剂盒。统计初始状态/存放6个月之后测试结果如下表2所示。

表2

	PC	PA	对照组	比较组
					红斑狼疮病人血样	81％/79％	82％/83％	74％/67％	75％/72％
混合型***病人血样	69％/68％	65％/65％	68％/60％	72％/68％
					干燥综合征病人血样	67％/66％	66％/67％	65％/54％	65％/62％
健康人血样	0％/0％	0％/0％	0％/0％	0％/0％

通过表2结果可见，本发明采用含有磷脂成分的封闭液对包被细胞核成分抗原进行封闭处理，检测准确性具有一定程度的提高，检测稳定性具有显著提高。检出率数据与现有市场上欧蒙医学实验诊断有限公司生产的检测试剂盒各有优势，且稳定性更优。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗核抗体谱检测试剂盒，其特征在于：包括反应膜条、酶联试剂、显色底物、样本稀释液、浓缩洗涤液和反应终止液；所述反应膜条上包含多条彼此独立的抗原检测线，所述抗原检测线通过包被细胞核成分抗原后采用封闭液封闭；所述封闭液是指含有牛血清白蛋白和磷脂的磷酸盐缓冲溶液。

2.根据权利要求1所述的一种抗核抗体谱检测试剂盒，其特征在于：所述细胞核成分抗原是指dsDNA、组蛋白、SmD1、SmB/B’、snRNP-A、snRNP-C、snRNP-68/70、SSA/Ro60、SSA/Ro52、SSB\La、Scl-70、Jo-1、核糖体P0蛋白、PCNA、CENP-B、PM-Scl、AMA-M2、Mi-2、Ku、核小体。

3.根据权利要求1或2所述的一种抗核抗体谱检测试剂盒，其特征在于：所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油及磷脂酰肌醇中的至少一种。

4.根据权利要求1或2所述的一种抗核抗体谱检测试剂盒，其特征在于：所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸中的至少一种。

5.根据权利要求1或2所述的一种抗核抗体谱检测试剂盒，其特征在于：所述封闭液中牛血清白蛋白的质量浓度为0.5％～2％，磷脂的质量浓度为0.5％～2％。

6.根据权利要求1或2所述的一种抗核抗体谱检测试剂盒，其特征在于：所述反应膜条为固定于载片上的硝酸纤维素膜或尼龙膜。

7.根据权利要求1或2所述的一种抗核抗体谱检测试剂盒，其特征在于：所述酶联试剂为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体；所述显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与四唑硝基蓝底物组合或3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

8.根据权利要求1或2所述的一种抗核抗体谱检测试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液为含有牛血清白蛋白的1×TBST缓冲液；所述浓缩洗涤液为10×TBST缓冲液；所述反应终止液为1×PBS缓冲液。

9.根据权利要求1或2所述的一种抗核抗体谱检测试剂盒，其特征在于：所述反应膜条上还包含质控带和阴性对照；所述质控带为0.5-30μg/ml的人源IgG，所述阴性对照为已剥除IgG的人类血清。

10.权利要求1～9任一项所述的一种抗核抗体谱检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：

(1)将细胞核成分抗原采用包被液稀释后划线于基质膜上，然后将包被抗原的基质膜置于封闭液中封闭，得到反应膜条；

(2)将步骤(1)所得反应膜条与酶联试剂、显色底物、样本稀释液、浓缩洗涤液和反应终止液组装，得到所述抗核抗体谱检测试剂盒。