CN113267586B

CN113267586B - 嘌呤代谢标志物在制备肺癌分子靶向药物获得性耐药筛查和诊断试剂中的应用

Info

Publication number: CN113267586B
Application number: CN202110482954.0A
Authority: CN
Inventors: 朱亮; 唐亚斌; 陈红专; 雷绘敏; 张可人; 吕倩明; 沈瑛; 张雨霏; 马春爽; 徐光旎
Original assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2041-04-30
Also published as: CN113267586A

Abstract

本发明提供嘌呤代谢标志物在制备肺癌分子靶向药物获得性耐药筛查和诊断试剂中的应用，所述嘌呤代谢标志物为单磷酸腺苷、单磷酸鸟苷、单磷酸肌苷、单磷酸黄苷、腺苷、鸟苷、肌苷、黄苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸中的一种或多种。代谢标志物对肺癌分子靶向药物获得性耐药有良好的诊断潜力，可用于肺癌分子靶向药物获得性耐药诊断和疗效监测，其对后续临床应用研究的开展具有良好的指导意义。

Description

嘌呤代谢标志物在制备肺癌分子靶向药物获得性耐药筛查和诊断试剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及嘌呤代谢标志物在制备肺癌分子靶向药物获得性耐药筛查和诊断试剂中的应用。

背景技术

肺癌是我国死亡率最高的恶性肿瘤。针对表皮生长因子(EGFR)激活性突变的肺癌，靶向该驱动基因的酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal Growth Factor Receptor-TyrosineKinase Inhibitors,EGFR-TKI)等分子靶向药物治疗取得重大进展。东亚人群中肺癌患者携带EGFR激活性突变比例远超欧美患者，因此EGFR-TKI靶向治疗对我国肺癌患者具有特别重要的意义。但是，在初治显效后，肿瘤不可避免地获得对EGFR-TKI的耐药性，极大限制了该类药物最终临床价值的发挥。

目前临床上应用最广泛的耐药性检测方法主要集中在EGFR和KRAS基因突变检测，该方法存在灵敏度不佳，检出效率不高等问题，因此大量研究都在寻找耐药检测的新的生物标志物。通过筛选耐药产生时的标志性代谢物，进而探讨耐药产生的机制，可能会为肺癌的临床治疗提供一定帮助。

发明内容

本发明的目的在于，提供一组嘌呤代谢标志物在制备肺癌分子靶向药物获得性耐药筛查和诊断试剂中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了嘌呤代谢标志物在制备肺癌分子靶向药物获得性耐药筛查和诊断试剂中的应用，所述嘌呤代谢标志物为单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸肌苷(IMP)、单磷酸黄苷(XMP)、腺苷(Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、肌苷(Inosine)、黄苷(Xanthosine)、腺嘌呤(Adenine)、鸟嘌呤(Guanine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、黄嘌呤(Xanthine)和尿酸(Uric acid)中的一种或多种。

作为一个优选方案，所述嘌呤代谢标志物为单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸肌苷(IMP)、腺苷(Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、肌苷(Inosine)、腺嘌呤(Adenine)、鸟嘌呤(Guanine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、黄嘌呤(Xanthine)和尿酸(Uricacid)的组合物。

作为一个优选方案，所述嘌呤代谢标志物为单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸肌苷(IMP)、单磷酸黄苷(XMP)、腺苷(Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、肌苷(Inosine)、腺嘌呤(Adenine)、鸟嘌呤(Guanine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、黄嘌呤(Xanthine)和尿酸(Uric acid)的组合物。

作为一个优选方案，所述嘌呤代谢标志物为单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸肌苷(IMP)、单磷酸黄苷(XMP)、腺苷(Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、肌苷(Inosine)、黄苷(Xanthosine)、腺嘌呤(Adenine)、鸟嘌呤(Guanine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、黄嘌呤(Xanthine)和尿酸(Uric acid)的组合物。

作为一个优选方案，所述嘌呤代谢标志物为单磷酸腺苷(AMP)。

作为一个优选方案，所述嘌呤代谢标志物为次黄嘌呤(Hypoxanthine)。

作为一个优选方案，所述嘌呤代谢标志物为单磷酸腺苷(AMP)和次黄嘌呤(Hypoxanthine)的组合物。

作为一个优选方案，所述嘌呤代谢标志物为单磷酸腺苷(AMP)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)和腺苷(Adenosine)的组合物。

作为一个优选方案，所述试剂包括诊断制剂、试剂盒或芯片。所述诊断制剂、试剂盒或芯片包括检测标志物组合相对及绝对浓度的试剂。

本发明中所述肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌。所述分子靶向药物包括包括厄洛替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、埃克替尼(Icotinib)、奥希替尼(Osimertinib)、阿美替尼(Almonertinib)，及其可药用盐。

高通量的代谢组学手段有助于筛选到更加灵敏和特异的耐药标志物。在本发明中，我们收集了肺癌分子靶向药物获得性耐药的生物样本，包括细胞、动物组织以及临床血浆/尿液样本，采用非靶向检测联合靶向分析方法对上述生物样本进行嘌呤代谢的定性定量分析。通过差异倍数分析和t-test分析，筛选到十三种嘌呤代谢标志物，该标志物或者其特异组合可对分子靶向药物耐药组和敏感组具有很好的区分，具有良好的临床应用前景。

在具体的实施方案中，所述嘌呤代谢标志物在分子靶向药物获得性耐药组生物样本中含量水平显著升高(高于敏感组水平)。敏感组是指对未获得对分子靶向药物耐药性的生物样本。

所述代谢标志物筛查是在受试的生物样本中检测的，包括细胞、动物以及临床样本等。

本发明利用所述代谢标志物筛查和诊断肺癌分子靶向药物获得性耐药的步骤为：(1)获取受试生物样本；(2)检测受试生物样本中所述嘌呤代谢标志物组合的含量水平；(3)将受试生物样本中所述嘌呤代谢标志物组合的含量水平与分子靶向药物敏感组的代谢物含量比较；(4)相较于分子靶向药物敏感组对照，所述代谢标志物组合含量升高指示所述受试生物样本已产生分子靶向药物获得性耐药。

检测受试生物样本中多种代谢标志物信号强度的方法包括紫外法、荧光法、质谱法、核磁共振法等。检测受试生物样本中多种代谢标志物信号强度的方法包括质谱法，所述质谱法为液相色谱-高分辨质谱。当采用质谱法检测代谢物水平时，在获得生物样本的步骤之后，还可以包括代谢物提取、样本前处理步骤。

所述质谱法是一级全扫描模式联合二级质谱分析法。全扫描模式是同时采集生物样本中质荷比m/z 70到m/z 1000范围内的所有小分子一级质谱信息，通过统计分析筛选并提取代谢物，进一步结合数据库二级谱图以及标准品保留时间等信息，最终确定嘌呤代谢物。

本发明的优点在于，本发明公开了与肺癌分子靶向药物获得性耐药相关的代谢标志物，并进一步证实所述嘌呤代谢物组合可以作为肺癌分子靶向药物获得性耐药筛查和诊断的生物标志物。可以通过对比耐药组与敏感组的所述筛查代谢标志物含量水平，对临床肺癌患者分子靶向药物获得性耐药进行诊断，其对后续临床应用研究的开展具有良好的指导意义。

附图说明

图1：耐药细胞内液及组织中嘌呤代谢物组合标志物水平增强。左图为热图，黑色表示倍数变化Fold Change(耐药/敏感)大于1，且有统计学差异，灰色表示倍数变化FoldChange(耐药/敏感)小于1，且有统计学差异。右图为根据热图数据绘制的嘌呤代谢变化示意图，代谢物右上角箭头表示该代谢物在耐药组vs敏感组中的变化方向，箭头朝上表示该嘌呤代谢物在耐药组水平较高(Fold Change大于1)，箭头朝下表示该嘌呤代谢物在耐药组水平较低(Fold Change小于1)。CDX，cell derived xenograft；ER，erlortinibresistant；GR，gefitinib resistant；OR，osimertinib resistant。

图2：耐药组小鼠血浆中嘌呤代谢物组合标志物水平增强。颜色越深表示该代谢物含量越高，耐药组n＝6，敏感组n＝7。

图3：不同耐药细胞的外液中嘌呤代谢物组合标志物水平均增强。代谢物附近的数值表示其Fold Change值(耐药组/敏感组)。OR，osimertinib resistant；OS，osimertinibsensitive。

图4：复发组病人血清中嘌呤代谢物组合标志物水平增强。上图为临床复发组(Recurrence，也即耐药)vs缓解组(Response，也即敏感)血清样本中嘌呤代谢轮廓变化趋势图，代谢物附近的数值表示其Fold Change值(复发组/缓解组)。下图为耐药组增强最明显的AMP及adenosine在复发组vs缓解组之间的含量比较柱状图分析。

图5：临床血清中12个嘌呤标志物组合预测耐药的ROC曲线。

图6：临床血清中AMP预测耐药的ROC曲线。

图7：临床血清中Hypoxanthine预测耐药的ROC曲线。

图8：临床血清中AMP+Hypoxanthine组合预测耐药的ROC曲线。

图9：临床血清中AMP+Hypoxanthine+Adenosine组合预测耐药的ROC曲线。

图10：复发组病人尿液中嘌呤代谢物组合标志物水平增强。代谢物附近的数值表示其Fold Change值(复发组/缓解组)。

图11：尿液中11个嘌呤标志物组合预测耐药的ROC曲线。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

我们用液相色谱-高分辨质谱通过全扫描模式检测生物样本中的代谢物，通过统计分析筛选与获得性耐药相关的代谢物。代谢标志物的鉴定是采用二级碎片及标准品保留时间匹配进行。

实施例.基于高效液相色谱-高分辨质谱检测嘌呤代谢物

为了检测分子靶向药物获得性耐药组及敏感组生物样本中的嘌呤代谢物水平，通过对样本进行代谢物提取、除蛋白等前处理操作，获得样本中代谢物的响应强度。

材料与试剂

1)仪器：超高效液相色谱(Nexera UPLC System,Shimadzu，日本)、四级杆飞行时间质谱(TripleTOF^TM 5600plus,SCIEX，美国)等；

2)试剂耗材：色谱级甲醇及乙腈、LCMS级甲酸、氨水及碳酸氢铵均购自德国MERCK化工公司；超纯水取自

Integral 3纯水***；ZIC-HILIC色谱柱(150mm x 2.1mmi.d.,3.5μm；Merck)

1.1样本收集

细胞样本收集：EGFR-TKI敏感细胞HCC827及H1975，及其对应同源诱导获得性耐药细胞HCC827ER、HCC827GR、HCC827OR、H1975OR均采用RPMI1640完全培养基培养，采用6孔板培养，每种细胞板密度为2.5×10⁵个/孔，当细胞汇合度达到80-90％时进进行样品收集。首先，取每孔内1mL培养基取为细胞外液样本，弃去剩余培养基，然后用2mL PBS轻轻润洗两次并弃去，迅速将细胞样品放置-80℃保存，以达到淬灭代谢酶，固定代谢轮廓的目的。

动物组织及血浆样本收集：构建皮下移植瘤模型所需的免疫缺陷BALB/C裸小鼠为3周龄左右，体重18-25g，雌性，由上海交通大学提供。拔除采血管胶塞，用玻璃毛细管(长度2cm)眼窝取血至1.5mL离心管中，立即轻轻地180度上下颠倒混匀，持续8次，摇匀后将采血管放置在冰上，当采集完毕后，离心(4℃，3500rpm，10min)。制备好的血浆置于-80℃冰箱保存，待质谱分析。采血完成后的裸鼠颈椎脱臼处死，手术采集肿瘤组织，组织剪切后成20mg左右/块，依次放入液氮淬灭，然后迅速称量瘤重并记录数据，最后-80℃冰箱保存。

临床血清及尿液样本收集：本实施例中，共收集EGFR-TKI治疗复发患者vs缓解患者共计213例，具体临床信息如表1所示。采集其血清及尿液样本，然后采用高效液相色谱-高分辨质谱技术来开展代谢物检测。首先通过发现集(Identification Set)筛选得到嘌呤代谢标志物，随后在测试集(First Validation Set)中对该生物标志物进行初步验证，最后通过验证集(Second Validation Set)再次评估标志物的诊断效能。

表1临床样本背景信息

1.2样本前处理

细胞：从-80℃冰箱取出6孔板，每孔加入预冷的裂解液(80％甲醇水溶液)1mL，放入-80℃冰箱静置萃取代谢物2小时，然后使用细胞刮刀快速刮板收集至离心管中。4℃，15000g离心10分钟，取上清真空浓缩，挥干后用150μL 50％乙腈水溶液复溶，涡旋振荡60秒，15000g离心10min(4℃)，取上清液100μL，采用0.22μm滤器过滤后进入质谱分析。

动物组织：取肿瘤组织块至1.5mL离心管中，然后加入3mm陶瓷珠5粒及1mm陶瓷珠10粒，用于研磨肿瘤块，接着加入500μL极性代谢物提取液(-80℃预冷的80％甲醇水溶液)，然后放入多功能生物样品均质器中，设定5000rpm振荡30秒，每次振荡间隔10秒，重复操作3次，将制得的肿瘤组织匀浆放入-80℃静置4小时，然后4℃离心10分钟，转速为15000g，取上清400μL至新的1.5mL离心管中，真空浓缩挥干，然后用150μL 50％乙腈水溶液复溶，涡旋振荡60秒，15000g离心10min(4℃)，取上清液100μL，采用0.22μm滤器过滤后进入质谱分析。

细胞外液、动物血浆、人血清及人尿液：精密吸取样本100μL，加入预冷的乙腈400μL，涡旋振荡30秒。4℃，15000g离心10分钟，分取上清液，并将其真空浓缩挥干，150μL 50％乙腈水溶液复溶，涡旋振荡60秒，15000g离心10min(4℃)，取上清液100μL，采用0.22μm滤器过滤后进入质谱分析。

1.3液相条件

正负离子检测模式均采用相同的流动相及洗脱梯度。色谱柱为ZIC-HILIC色谱柱(150mm x 2.1mm i.d.,3.5μm；Merck)；流动相A为水(含10mM碳酸氢铵及0.2％氨水)，流动相B为纯乙腈。流速为0.25mL/min，进样量为2μL，柱温为40℃，具体洗脱梯度，如表1所示：

表2流动相洗脱梯度

1.4质谱分析

离子源类型：电喷雾离子源(ESI)。电离模式：正离子模式(ESI+)和负离子模式(ESI-)。数据采集模式：TOF MS采集一级质谱信息，即分子离子峰的精确质荷比，IDA MS/MS模式采集二级质谱信息，即碎片离子的精确质荷比。

正负离子模式的毛细管电压分别为5500V(ESI+)和-4500V(ESI-)，TOF MS扫描范围：m/z 70-1000，离子源温度为：550℃，雾化气，辅助加热气和气帘气流量分别设为55psi，55psi和35psi。

通过对嘌呤标准品溶液进行分析确证，获取到嘌呤代谢物相关的加合离子形式、精确质荷比、特征碎片离子、色谱保留时间等关键结果，该结果将用于后续嘌呤代谢物的定量分析，详情见下表：

表3嘌呤代谢物定量分析参数

1.5数据分析

采用Sciex仪器自带软件PeakView^TM对样本色谱质谱原始数据进行峰提取，并与嘌呤标准品进行精确分子量、MS/MS碎片离子及保留时间匹配。基于匹配信息，采用MultiQuant软件对样本中嘌呤代谢物进行峰提取及积分等定量分析，最终产生代谢物名称-样本名称-信号强度的数据矩阵，将该矩阵导入MarkerView软件采用细胞数量或肿瘤组织重量进行归一化，然后进行t-test分析，得到目标嘌呤代谢物在耐药组及敏感组的含量水平对比结果。

1.6耐药细胞内液体系中嘌呤水平升高

本研究采用pheatmap的R语言包对数据进行分析及热图(heatmap)绘制。我们对HCC827-CDX ER vs ES肿瘤组织、HCC827 ER vs ES细胞内液、HCC827GR vs GS细胞内液、H1975 OR vs OS细胞内液等细胞内液体系进行了分析，如图1所示。相对于敏感组，耐药组的嘌呤含量显著增强，主要体现在IMP、XMP、AMP、GMP及尿酸等主要嘌呤代谢物水平显著升高。但耐药组的R5P、PRPP、AICAR均未随之增强。

将热图中的嘌呤代谢物及其变化趋势映射到嘌呤代谢网络图中(图1右)，可以发现一个规律：耐药组单磷酸核苷(IMP、XMP、GMP、AMP)普遍水平升高，导致其去磷酸化代谢产物-核苷(Inosine、Xanthosine、Guanosine、Adenosine)也普遍水平升高，最终导致其嘌呤碱基(Hypoxanthine、Xanthine、Guanine、Adenine、Uric acid)也普遍水平升高。也即出现嘌呤代谢物在耐药组普遍水平升高的代谢表型。这13种嘌呤代谢物也即本发明中的嘌呤代谢物组合标志物，即单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸肌苷(IMP)、单磷酸黄苷(XMP)、腺苷(Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、肌苷(Inosine)、黄苷(Xanthosine)、腺嘌呤(Adenine)、鸟嘌呤(Guanine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、黄嘌呤(Xanthine)和尿酸(Uricacid)。

1.7耐药细胞外液体系中嘌呤水平升高

HCC827-CDX ER vs ES小鼠血浆、HCC827 OR vs OS细胞外液、H1975 OR vs OS细胞外液等用于细胞外液体系嘌呤代谢物组合标志物的验证。小鼠血浆的热图结果提示，相对于敏感组，耐药组除了IMP无显著差异外，嘌呤代谢物组合内其余标志物均增强(图2)。

进一步我们在细胞水平也进行了验证，HCC827 OR vs OS、H1975 OR vs OS的细胞外液数据均提示胞外的嘌呤代谢产物水平升高，同CDX模型血浆结果基本保持一致(图3)。其中AMP与Hypoxanthine无论在HCC827OR还是H1975OR中都增强显著，Fold Change(耐药组/敏感组)大于10倍以上。

1.8复发组病人血清中嘌呤代谢标志物组合发现及验证

如图4所示，R5P及PRPP水平低于检测限，未检出。除了Xanthosine无显著差异以外，其余嘌呤代谢标志物组合中的代谢物浓度水平均在复发组显著升高，整体出现嘌呤水平升高的代谢表型(图4)。其中变化最为显著的是AMP以及Adenosine，复发组AMP为缓解组的2.95倍，Adenosine则是缓解组的1.87倍(图4)。临床血清的嘌呤靶向代谢组学结果提示复发组患者出现嘌呤代谢重编程，嘌呤代谢标志物组合含量显著增强。基于上述发现集的血清代谢数据筛选出一个由12个嘌呤代谢物组成的标志物组合，即单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸肌苷(IMP)、单磷酸黄苷(XMP)、腺苷(Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、肌苷(Inosine)、腺嘌呤(Adenine)、鸟嘌呤(Guanine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、黄嘌呤(Xanthine)和尿酸(Uric acid)。

发现集的ROC分析得出AUC值为0.889，特异性为0.81，敏感性为0.73。然后通过测试集113例血清样本进行测试，以评估其诊断性能，ROC分析得出AUC值为0.831，特异性为0.84，敏感性为0.71。接着，验证集样本中ROC分析得出AUC为0.865，特异性为0.85，敏感性为0.79，这说明该标志物组合是筛查和诊断分子靶向药物获得性耐药的特异性标志物(图5)。

此外，筛选得到AMP亦可用于筛查和诊断分子靶向药物获得性耐药，其在发现集中AUC值为0.664，特异性为0.68，敏感性为0.56；在测试集中AUC值为0.814，特异性为0.77，敏感性为0.65；在验证集中AUC值为0.737，特异性为0.61，敏感性为0.62(图6)。

Hypoxanthine也可用于筛查和诊断耐药，其在发现集中AUC值为0.803，特异性为0.78，敏感性为0.69；在测试集中AUC值为0.762，特异性为0.66，敏感性为0.58；在验证集中AUC值为0.777，特异性为0.63，敏感性为0.69(图7)。

AMP及Hypoxanthine组合也可用于筛查和诊断耐药，其在发现集中AUC值为0.704，特异性为0.60，敏感性为0.64；在测试集中AUC值为0.792，特异性为0.69，敏感性为0.67；在验证集中AUC值为0.753，特异性为0.62，敏感性为0.65(图8)。

AMP、Hypoxanthine以及Adenosine三者组合也可用于筛查和诊断耐药，其在发现集中AUC值为0.712，特异性为0.66，敏感性为0.64；在测试集中AUC值为0.659，特异性为0.61，敏感性为0.59；在验证集中AUC值为0.795，特异性为0.67，敏感性为0.68(图9)。

1.9复发组病人尿液中嘌呤代谢标志物组合发现及验证

如图10所示，除了R5P、PRPP、XMP及Xanthosine等无显著差异以外，其余嘌呤代谢标志物组合中的代谢物浓度水平均在复发组显著升高。其中变化最为显著的是Xanthine以及Guanine，复发组Xanthine含量为缓解组的6.1倍，Guanine含量则是缓解组的5.55倍。因此，尿液代谢组学结果提示复发组患者尿液中同样存在嘌呤含量显著升高的代谢表型。基于上述发现集的尿液代谢数据可筛选得到由11个嘌呤代谢物组成的标志物组合，即单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸肌苷(IMP)、腺苷(Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、肌苷(Inosine)、腺嘌呤(Adenine)、鸟嘌呤(Guanine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、黄嘌呤(Xanthine)和尿酸(Uric acid)。

该发现集的ROC分析得出AUC值为0.842，特异性为0.69，敏感性为0.85。然后通过测试集评估其上述组合的诊断性能，ROC分析得出AUC值为0.728，特异性为0.65，敏感性为0.75。接着，验证集样本ROC分析得出AUC为0.756，特异性为0.64，敏感性为0.81(图11)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.嘌呤代谢标志物在制备肺癌分子靶向药物获得性耐药筛查和诊断试剂中的应用，其特征在于，所述肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌，所述分子靶向药物包括厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、奥希替尼、阿美替尼，及其可药用盐，所述嘌呤代谢标志物在分子靶向药物获得性耐药组生物样本中的含量水平显著升高，高于敏感组水平，敏感组是指未获得分子靶向药物耐药性的生物样本，所述生物样本为血清，所述嘌呤代谢标志物为单磷酸腺苷、单磷酸鸟苷、单磷酸肌苷、单磷酸黄苷、腺苷、鸟苷、肌苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸的组合物。

2.根据权利要求1所述嘌呤代谢标志物在制备肺癌分子靶向药物获得性耐药筛查和诊断试剂中的应用，其特征在于，所述试剂包括诊断制剂、试剂盒或芯片。

3.嘌呤代谢标志物在制备肺癌分子靶向药物获得性耐药筛查和诊断试剂中的应用，其特征在于，所述肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌，所述分子靶向药物包括厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、奥希替尼、阿美替尼，及其可药用盐，所述嘌呤代谢标志物在分子靶向药物获得性耐药组生物样本中的含量水平显著升高，高于敏感组水平，敏感组是指未获得分子靶向药物耐药性的生物样本，所述生物样本为尿液，所述嘌呤代谢标志物为单磷酸腺苷、单磷酸鸟苷、单磷酸肌苷、腺苷、鸟苷、肌苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸的组合物。

4.根据权利要求3所述嘌呤代谢标志物在制备肺癌分子靶向药物获得性耐药筛查和诊断试剂中的应用，其特征在于，所述试剂包括诊断制剂、试剂盒或芯片。