CN113264985A - 一种人绒毛膜***肽适配体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肽适配体技术领域，具体为一种人绒毛膜***肽适配体，包括下列P1至P6任意一条多肽序列：P1：MHLMRMKPLLLT；P2：MHPRKMLQLMLN；P3：STRLRRRSRRQT；P4：PPLRINRHILTR；P5：MKLKPMRIMINP；P6：MKSRMLPLNRRL。本发明还提供了所述人绒毛膜***肽适配体的制备方法。本发明提供的人绒毛膜***肽适配体与HCG结合的特异性好、结合率高，应用到HCG检测中能更精准的反应样本的HCG情况。本发明的人绒毛膜***肽适配体的应用包括但不限于制作检测HCG的检测试剂、制作检测HCG的生物检测传感器等。

Description

一种人绒毛膜***肽适配体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及肽适配体技术领域，特别是涉及一种人绒毛膜***肽适配体及其制备方法和应用。
背景技术
人绒毛膜***(Human Chorionic Gonadotropin，HCG)是一种由胎盘绒毛膜囊泡的滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，由α亚基和β亚基两条不同的亚基和244种氨基酸组成，分子量约为36.7kDa。在结构上，α亚基与很多激素如促甲状腺激素、***等相似，而β亚基是HCG特有的，故临床上HCG检测主要是利用β亚基的特异性。
胎盘可产生HCG，滋养层细胞瘤、含滋养层组织的生殖细胞瘤以及一些非滋养层细胞瘤也可产生HCG。妊娠妇女血清中主要含有完整分子的HCG，其浓度会在怀孕早期呈指数型增长，并与时间有关，这对维持妊娠起着重要作用。若HCG数值的变化不规律，特定时间过高或者过低，说明妊娠异常。检测结果的异常偏高提示绒毛膜癌、***或多胎妊娠可能，检测结果偏低则提示先兆/早期流产、异位妊娠、妊娠中毒或胎儿宫内死亡。结合甲胎蛋白检测和准确的孕龄、孕妇体重等其他参数，检测HCG+β有助于在孕中期评价21三体综合征的风险，21三体孕妇的血清甲胎蛋白浓度降低，而母体血清HCG+β浓度可达到正常中位值的两倍。监测人绒毛膜***水平可以预测妊高征的发生，对妊娠期高血压疾病的病程诊断有着重要的指导意义。
HCG也是一种重要的血清和尿液肿瘤标志物，与妊娠无关的HCG浓度升高还可见于生殖细胞、卵巢、膀胱、胰腺、胃、肺和肝脏肿瘤病人。各种恶性肿瘤中血清HCG值升高的患病率(％)：睾丸或胎盘绒癌(100)，***(97)，非***性生殖肿瘤(48-86)，***瘤(10-22)，胰腺癌(腺癌(11-80)和胰岛细胞癌(22-50))，胃癌(0-52)，上皮癌(18-41)，结肠癌(0-37)，肺癌(0-36)，乳癌(7-25)，肝癌(17-21)，小肠肿瘤(13)和肾癌(10)。
此外，HCG检测在运动医学中也非常重要。由于HCG可能会被男性运动员滥用于掩盖合成代谢类固醇或者用于促进***的产生，该激素被列为世界反***机构禁用物质。
HCG的检测方法，目前包括胶体金免疫层系试纸、荧光免疫分析、共振散射光谱分析、光谱法、光致发光以及电化学免疫电极等，在这些方法中，罗氏的电化学发光法是目前应用最广泛的HCG检测方法。
胶体金免疫层系试纸检测尿HCG并不能准确反应体内HCG的量。T线颜色在妊娠早期随HCG增高而加深，在接近峰值时出现高浓度钩状效应，随HCG增高而减弱。***、侵蚀性***、绒毛膜癌、滋养细胞肿瘤等生殖***疾病β-HCG均异常增高(>100000U/L)，同样会因浓度过高引起的高浓度钩状效应，使T线颜色减弱。异位妊娠8-9日后体内的β-HCG降至正常，尿检也可出现阳性。妊娠3个月后，HCG水平下降，尿液检测可能出现阴性或弱阳性。此外，试纸如果存放时间过长，保存不当，可能失效致检测结果假阴性。故临床上需结合血β-HCG、临床症状及影像学检查等辅助诊断判断是否妊娠或是否患相关疾病。医学上一般推荐血HCG检查，通过血液检查HCG值比用早孕试纸更灵敏、更准确地判断是否妊娠或患病。
罗氏的电化学发光法检测范围0.100-10000mIU/mL，无法满足妊娠12～14周HCG超过10000mIU/mL的浓度检测，故检测时常需进行稀释后二次检测。该方法仪器复杂，试剂稳定性差，抗体的保存条件苛刻，必须由专业实验室人员操作，仪器对于样本要求高：不能有血凝块和气泡、样本量在150uL以上、稀释倍数无法确定、存在潜在交叉污染，以上缺陷使得该仪器主要存在于医院检验科或第三方体外诊断公司并常常报错，需要工程师及时解决问题，而无法普及。
足见，现有技术对HCG的检测具有非常忙明显的缺陷，使得现有技术对HCG的检测结果参考价值受限，还需要借助较多其他检测方法进行评估。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种人绒毛膜***肽适配体。
本发明的另一目的在于提供一种人绒毛膜***肽适配体的制备方法和应用
本发明的技术方案如下：
一种人绒毛膜***肽适配体，其多肽序列为包括P1至P6任一项所示的序列：
(SEQ ID NO.1)P1：MHLMRMKPLLLT；
(SEQ ID NO.2)P2：MHPRKMLQLMLN；
(SEQ ID NO.3)P3：STRLRRRSRRQT；
(SEQ ID NO.4)P4：PPLRINRHILTR；
(SEQ ID NO.5)P5：MKLKPMRIMINP；
(SEQ ID NO.6)P6：MKSRMLPLNRRL。
进一步的，所述人绒毛膜***肽适配体，其多肽序列优选包括序列：PPLRINRHILTR。
进一步的，所述人绒毛膜***肽适配体，其包括的序列为经过修饰的序列；所述修饰包括极性甘氨酸修饰；所述极性甘氨酸修饰包括：在所述P1至P6任一项所示的序列的至少一端引入3个极性甘氨酸。
优选的，经过极性甘氨酸修饰后的序列为P11至P61所示的序列：
(SEQ ID NO.7)P11：GGGMHLMRMKPLLLT；
(SEQ ID NO.8)P21：GGGMHPRKMLQLMLN；
(SEQ ID NO.9)P31：GGGSTRLRRRSRRQT；
(SEQ ID NO.10)P41：GGGPPLRINRHILTR；
(SEQ ID NO.11)P51：GGGMKLKPMRIMINP；
(SEQ ID NO.12)P61：GGGMKSRMLPLNRRL。
进一步的，所述P1至P6所示的序列或所述P11至P61所示的序列还可以是经过半胱氨酸修饰的序列，所述半胱氨酸修饰包括：在所述P1至P6所示的各序列或所述P11至P61所示的各序列的一端引入半胱氨酸。
一种人绒毛膜***肽适配体的制备方法，包括
用M13噬菌体文库溶液对HCG进行孵育，将得到的结合噬菌体通过培养放大，进行结合实验；经过3～8轮重复筛选，确定肽段出现频次，筛选出具有最高结合亲和力的噬菌体菌落；翻译pIII蛋白结构域的DNA序列得到多肽序列6条：
(SEQ ID NO.1)P1：MHLMRMKPLLLT；
(SEQ ID NO.2)P2：MHPRKMLQLMLN；
(SEQ ID NO.3)P3：STRLRRRSRRQT；
(SEQ ID NO.4)P4：PPLRINRHILTR；
(SEQ ID NO.5)P5：MKLKPMRIMINP；
(SEQ ID NO.6)P6：MKSRMLPLNRRL。
进一步的，在用M13噬菌体文库溶液对HCG进行孵育之前，还包括将HCG添加到24孔板孵育，目的是使HCG蛋白固定在孔壁上，便于后续反应。
进一步的，所述人绒毛膜***肽适配体的制备方法中，筛选出6条多肽序列后，还包括：扩增所筛选出的6条高亲和力多肽序列，再与HCG孵育，洗脱，计算单个噬菌体与HCG的结合率，得到结合率最高的多肽作为最佳肽适配体；所述单个噬菌体与HCG的结合率计算公式为：结合噬菌体效价/输入噬菌体效价×100％；筛选出最优多肽序列为P4：PPLRINRHILTR。
进一步的，所述人绒毛膜***肽适配体的制备方法中，还包括分别对P1至P6所示的各序列进行修饰；所述修饰包括极性甘氨酸修饰；所述极性甘氨酸修饰包括：在P1至P6所示的各序列的至少一端上加入三个极性甘氨酸(Gly，G)，以增加序列的亲水性和水溶性，增大与电极表面的距离，减小空间位阻。
优选的，经过极性甘氨酸修饰后的序列为P11至P61所示的序列：
(SEQ ID NO.7)P11：GGGMHLMRMKPLLLT；
(SEQ ID NO.8)P21：GGGMHPRKMLQLMLN；
(SEQ ID NO.9)P31：GGGSTRLRRRSRRQT；
(SEQ ID NO.10)P41：GGGPPLRINRHILTR；
(SEQ ID NO.11)P51：GGGMKLKPMRIMINP；
(SEQ ID NO.12)P61：GGGMKSRMLPLNRRL。
进一步的，所述人绒毛膜***肽适配体的制备方法中，为使P1至P6所示的各序列或经过修饰的P1至P6所示的各序列后续能更稳定地与其他载体结合固定，比如纳米金电极表面，对多肽序列或经过修饰的多肽序列的NH2-末端进行半胱氨酸(Cys，C)修饰，引入一个半胱氨酸(Cys，C)，提供与电极的锚定点。
本发明的人绒毛膜***肽适配体可应用于HCG的相关检测中；包括但不限于制作检测HCG的检测试剂、制作检测HCG的生物检测传感器等。
本发明的有益效果：
多肽适配体是一段10-20个残基的多肽，其作为适配体能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合，具有抗体性质。本发明提供的人绒毛膜***肽适配体与HCG结合的特异性好、结合率高，应用到HCG检测中能更精准的反应样本的HCG情况。
本发明提供了人绒毛膜***肽适配体，首次通过免疫印迹法(WesternBlot，WB)对肽噬菌体文库初步筛选出的HCG肽适配体进行验证，确定HCG肽适配体与HCG的结合摩尔比例(HCG：肽适体＝1:303)，为实验提供理论支撑，为类似研究提供新思路。同时进一步的对肽适配体进行半胱氨酸修饰并表征；使肽适配体自身的性能更好，亲水性和水溶性，增大与电极表面的距离，减小空间位阻；甘氨酸修饰提供与电极的锚定点，使本发明的肽适配体应用效果更好。
现有技术的方法在检测高浓度HCG时，由于抗原抗体的结合的不平衡，破坏了复合物的水合状态，从而出现沉淀，表现出高浓度钩状反应。本发明与现有技术与用了不同的检测原理，应用人绒毛膜***肽适配体进行检测，蛋白是和肽段结合，阻碍电极表面电子的传递，结合的蛋白越多，电阻越大，从而根据电阻的变化反应结合蛋白的量，完全回避了这一现象。
本发明提供的肽适配体结构比蛋白更简单，更稳定，保存也更方便，大大减少了现有技术因“保存失效”出现的检测偏差。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是进行修饰后的P41序列的高效液相色谱检分析结果图。
图2是进行修饰后的P41序列的质谱分析结果图。
图3是验证肽适体与HCG结合的电泳凝胶图像。
具体实施方式
以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
在本公开使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本公开。在本公开和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
本申请实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。本申请实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例一本发明的人绒毛膜***肽适配体及其制备方法
1、实验仪器及材料
-80℃超低温冰箱(中科美菱，合肥)；精密电子分析天平(Mettler Toledo，德国)；恒温振荡器(BOYN，杭州)；离心机(迈克尔，湖南)；涡旋混合器(莱普特科学仪器，北京)；移液枪(Eppendorf，德国)；电泳仪(Bio-Rad，美国)；转膜仪(Bio-Rad，美国)；磁力搅拌器(雷磁，上海)；制冰机(XUEKEKE，美国)；凝胶成像***(Bio-Rad，美国)；超纯水仪(Heal Force，香港)；金属浴恒温器(Kylin-Bell，海门)；HCG标准品(领潮生物，上海)；HCG-α单克隆抗体(领潮生物，上海)；肽适配体(科肽生物，上海)；三(2-羧乙基)膦(TCEP)(阿拉丁，上海)；Loading Buffer(Thermo，美国)；ECL显色液(Thermo，美国)；Marker(Thermo，美国)；丙烯酰胺试剂盒(Bio-Rad，美国)；PVDF膜(Millipore，美国)；BSA封闭液(索莱宝，北京)；HCG标准品(领潮生物，上海)；肽适配体(科肽生物，上海)；三(2-羧乙基)膦(TCEP)(阿拉丁，上海)；六巯基己醇(MCH)(阿拉丁，上海)；PBS(索莱宝，北京)；氯金酸(HAuCl4·H2O)(阿拉丁，上海)；人血清白蛋白(联迈生物，上海)；胎牛血清(Gibco，澳洲)；BSA封闭液(索莱宝，北京)；氢氧化钠(阿拉丁，上海)；盐酸(湘雅药学院)；促甲状腺激素(中检所，北京)；***(中检所，北京)；促***(索莱宝，北京)；亚铁***(AR)(国药集团，北京)；铁***(AR)(国药集团，北京)；噬菌体文库(Invitrogen，新加坡)；碳浆(十条，日本)；绝缘油墨(依美，东莞)；PET基材(思鸿源塑胶制品，东莞)。
2、实验方法
2.1肽适配体的筛选和优选
将HCG添加到24孔板孵育(孵育条件：500μL的0.1mol/L的NaHCO3(pH 8.6)，4℃，过夜)，使HCG蛋白固定在孔壁上；弃去废液，采用BSA封闭，PBS洗涤，加入M13噬菌体文库溶液孵育(孵育体系：0.1％(v/v)TBST缓冲液，50mM Tris-HCl,，pH 7.5，150mM NaCl和0.1％(v/v)Tween-20]；孵育条件：37℃孵育30min)，除去未结合的噬菌体，将得到的结合噬菌体通过培养放大，进行结合实验；经过3～8轮重复筛选(优选5轮)，收集到具有最高结合亲和力的噬菌体菌落，通过翻译pIII蛋白结构域的DNA序列得到多肽序列6条：(P1)MHLMRMKPLLLT，(P2)MHPRKMLQLMLN，(P3)STRLRRRSRRQT，(P4)PPLRINRHILTR，(P5)MKLKPMRIMINP，(P6)MKSRMLPLNRRL。
在一些实施例中，本发明得到6条多肽序列还可以进一步筛选，操作包括：扩增上述的6条高亲和力序列，再于24孔板与HCG孵育(孵育环境：4mL PEG/NaCl溶液(其中：20％，w/v PEG-8000,2.5M NaCl)，孵育条件：4℃孵育2h)，采用酸(1mL 0.2M甘氨酸-HCl(pH 2.2)和1mg/mL BSA)进行洗脱，计算单个噬菌体与HCG的结合率(结合噬菌体效价/输入噬菌体效价)，得到结合率最高的多肽作为肽适配体(P4：PPLRINRHILTR)。
2.2肽适配体的修饰
分析上述6条高亲和力序列，发现存在较多带正电荷的氨基酸(29.2％)和非极性疏水氨基酸(27.5％)，不存在负电荷残基，这可能是因为在筛选过程中，HCG(pI＝2.95)在TBST缓冲液(pH＝7.5)中带负电，说明HCG和多肽的结合力可能包括静电作用和疏水作用。分析这些肽适配体发现，其解离常数比商业抗体高两个数量级，并接近HCG受体中的单链可变区片段(抗原抗体互补决定区)的解离常数。Ascolia等在2002年报道HCG受体胞外结合区域存在一种名为富含亮氨酸重复的结构基序，这种基序在肽适配体中存在，可能与HCG的结合有关。
基于以上事实，本发明对上述筛选出来的多肽序列进行修饰；即分别在多肽序列的至少一端引入3个极性甘氨酸(Gly，G)。以P4(PPLRINRHILTR)序列为例，在原多肽PPLRINRHILTR的基础上加入三个极性甘氨酸(Gly，G)，得到序列P41(GGGPPLRINRHILTR)增加亲水性和水溶性，增大与电极表面的距离，减小空间位阻。
在一些实施例中，为使多肽序列在后续的应用中能稳定地固定在纳米金电极表面，对肽适配体或修饰后的肽适配体的NH2-末端进行半胱氨酸(Cys，C)修饰，提供与电极的锚定点；以P4(PPLRINRHILTR)序列为例，为使P4(PPLRINRHILTR)或P41的序列(GGGPPLRINRHILTR)能稳定地固定在纳米金电极表面，对肽适配体或修饰后的肽适配体的NH2-末端进行半胱氨酸(Cys，C)修饰，提供与电极的锚定点，从而得到肽适配体序列：CGGG-PPLRINRHILTR或C-PPLRINRHILTR。
实施例二本发明的人绒毛膜***肽适配体的性能验证
2.1肽适配体的基本性质
以P4(PPLRINRHILTR)序列为例，利用肽段计算器类网络工具(PepCalc https://pepcalc.com/)对P4肽段的亲水性和等电点等性质进行检测，得到结果如图1所示，水溶性等特性均符合要求。
2.2肽适配体的合成与表征
以P4(PPLRINRHILTR)序列为例，委托上海科肽生物合成肽段：CGGGPPLRINRHILTR，
生物合成后，用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和质谱(MS)对其进行了表征：
UPLC***采用反相柱(Kromasil 100-5C18，4.6mm*150mm,5m)，柱温和样品温度均为40.0℃，流动相为溶剂A(0.1％三氟乙酸乙腈)和溶剂B(0.1％三氟乙酸水)。以0.5mL/min的流速进行线性梯度：10％A(0-10min)，10％-70％A(10-20min)，70％A(20-25min)。检测波长220nm。
参见图1和表1，高效液相色谱图积分结果表明，保留时间为10.346min的主峰代表目标肽段，面积占比98％，肽适配体纯度为98.01％，符合传感器修饰要求。
在MS分析中，适配体的母离子类型分别为[M+H]2+和[M+H]3+，对应的质荷比(M/z)分别为881.25和587.8。破碎电压为15v，碰撞能量为21ev。
参见图2，质谱分析结果表明，该肽的准分子离子峰离子信息与相应氨基酸序列一致，质荷比为587和881的离子峰代表了带了三个正电荷和两个正电荷。
表1：高效液相色谱表征结果
RT Area Height ％Area
1 9.915 194260 13418 1.85
2 10.346 10296363 588286 98.01
3 10.867 15143 5453 0.14
2.3肽适体与HCG结合的WB验证
2.3.1实验原理
HCG与HCG肽段结合物都能与HRP标记的HCG-α单抗特异性结合，设置不同的结合比例(1:4、11、20、37、75、113、189、303、378)，HRP催化ECL显影，观察不同结合比例下条带亮度。结合物条带与单独的HCG对比，根据条带的不同位置，反应不同的分子量，从而观察HCG与肽段是否结合。
2.3.2实验步骤
①制胶：取干净的胶梳和玻板安装于胶架上，按照表2和表3所列的配方配制8％的分离胶和5％的浓缩胶；用移液枪将分离胶打入玻板内，上层预留约2cm，用以制备浓缩胶，上层用无水乙醇轻轻覆盖，室温下凝胶；约20min后，观察确实已经凝胶，倒置玻璃板，倒出无水乙醇，用滤纸吸干净无水乙醇，加浓缩胶；将剩余空间用浓缩胶灌满后***15孔齿梳，室温下凝胶30min；待制备的浓缩胶完全凝固，无液体流动后，取出齿梳，将带有凝胶的板子固定在电泳架子上，再将电泳架子放入电泳槽中，加入1xSDS-PAGE电泳缓冲液(从10x用纯水稀释成1x)1L。
表2：8％分离胶成分表
成分 8％分离胶
超纯水 6.9mL
30％丙烯酰胺溶液 4.0mL
1.5M Tris，pH8.8 3.8mL
10％SDS 0.15mL
10％过硫酸铵 0.15mL
TEMED 0.018mL
表3：5％浓缩胶成分表
Figure BDA0002953309530000081
Figure BDA0002953309530000091
②配制肽段溶液：将真空封装的肽段从-20℃冰箱中取出，2mg肽段中加入100ulPBS，成浓度20mg/ml的肽段溶液(1μl相当于11nmol)；取20mg/ml的肽段溶液5μl，加入45μlPBS，成2mg/ml的肽段溶液(1μl相当于1.1nmol)。
③上样：按表4所示混匀，100℃煮15min变性，每孔上样10ul。
表4：各组成分汇总表
Figure BDA0002953309530000092
④电泳：浓缩胶电泳，80V电泳30min后，分离胶电泳，将电压调节为120V，待溴酚蓝电泳近胶底部时(约1h，距离底部1cm)，停止电泳。
⑤转膜：准备1x转膜液1L(从80ml稀释成800ml，加入200ml甲醇，总共为1L)，继续准备滤纸、海绵和PVDF膜，PVDF膜剪成合适大小后泡于甲醇中约30s以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。取出后与其他二者一起浸泡于已预冷的转膜液中，待用；用塑料板撬开玻璃板，使整块胶平铺于其中一块玻璃板上，根据marker所指示的分子量切去胶不需要的部分；将转膜夹打开，黑面板置于下面，由下至上依次放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸和海绵，用玻璃棒小心地铺平各层，并除去各层之间的气泡后(不要损伤凝胶与PVDF膜)，固定转移夹；将转移夹放入电泳槽中，加入适量预冷的转膜液至浸没转移夹，盖上电极盖，电泳槽放于冰水浴条件下，250mA转膜2h。
⑥封闭：等待转膜完成后，从转膜夹子中取出PVDF膜，用丽春红染料染色后检验转膜效果，并根据所需蛋白的大小将PVDF膜剪成相应大小的条带，将PVDF膜置于5％的牛奶封闭液中，于室温中在摇床上封闭2h后用PBST洗干净牛奶封闭。
⑦孵育抗体：将PVDF膜放入杂交袋中，加入适量相应抗体稀释液(TBST稀释，抗体浓度为1:500-1:1000)使PVDF膜能完全被浸没，排除气泡，封口，4℃冰箱振摇过夜；TBST漂洗膜，漂洗3次，每次10min。
⑧化学发光、显影、定影：移液枪吸取等量适量的发光液A(鲁米洛)和B(过氧化氢)，均匀混合，将混合液尽量均匀滴加在膜上，将膜放入成像仪中显影，全程在避光条件进行。
⑨凝胶图像分析：用Quantity one(Bio.Rad)软件进行图像扫描(凝胶图参见图4)，用image J软件进行半定量并计算各蛋白的灰度值(见表5)，以此表示各蛋白相对表达量。
表5：各蛋白的灰度值
编号 1 2 3 4 5 6
结合比 纯HCG 1：75 1：113 1：189 1：303 1：378
灰度值(n＝5) 212±6 180±7 135±5 91±1 72±2 69±3
2.3.3实验结论分析
分子量为36kd的HCG条带随着结合比例的增加灰度变浅，说明蛋白与肽段结合成复合物，分子质量变大，不与HCG蛋白出现在同一条带上；复合物在实验中并未出现条带，一方面是由于肽适配体与HCG的作用位点在α链，与HCG-α单抗竞争作用位点，从而无法显影；另一方面也可以是由于所配胶的浓度无法分离出分子量更大的蛋白。HCG与肽适体的结合比例大约为1:303(摩尔比)，本发明肽适体在检测HCG时，可参考这个结合比配制肽适配体浓度。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 长沙市信励致和科技有限责任公司
<120> 一种人绒毛膜***肽适配体及其制备方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met His Leu Met Arg Met Lys Pro Leu Leu Leu Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met His Pro Arg Lys Met Leu Gln Leu Met Leu Asn
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Thr Arg Leu Arg Arg Arg Ser Arg Arg Gln Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Pro Pro Leu Arg Ile Asn Arg His Ile Leu Thr Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Lys Leu Lys Pro Met Arg Ile Met Ile Asn Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Lys Ser Arg Met Leu Pro Leu Asn Arg Arg Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Gly Gly Met His Leu Met Arg Met Lys Pro Leu Leu Leu Thr
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Gly Gly Met His Pro Arg Lys Met Leu Gln Leu Met Leu Asn
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Gly Gly Ser Thr Arg Leu Arg Arg Arg Ser Arg Arg Gln Thr
1 5 10 15
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Gly Gly Pro Pro Leu Arg Ile Asn Arg His Ile Leu Thr Arg
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Gly Gly Met Lys Leu Lys Pro Met Arg Ile Met Ile Asn Pro
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gly Gly Gly Met Lys Ser Arg Met Leu Pro Leu Asn Arg Arg Leu
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种人绒毛膜***肽适配体，其特征在于，所述人绒毛膜***肽适配体的多肽序列包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6任一项所示的序列。
2.根据权利要求1所述的人绒毛膜***肽适配体，其特征在于，所述人绒毛膜***肽适配体包括的序列为经过以下方式修饰的序列：在所述人绒毛膜***肽适配体包括的序列的至少一端引入3个极性甘氨酸。
3.根据权利要求2所述的人绒毛膜***肽适配体，其特征在于，所示经过修饰后的序列为SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.12任一项所示的序列。
4.根据权利要求1至3任意一项所述的人绒毛膜***肽适配体，其特征在于，所述人绒毛膜***肽适配体包括的序列为经过半胱氨酸修饰的多肽序列。
5.一种人绒毛膜***肽适配体的制备方法，其特征在于，包括：
用M13噬菌体对人绒毛膜***进行孵育，将得到的结合噬菌体培养放大，进行结合实验；经过3～8轮重复筛选，找出具有最高结合亲和力的噬菌体菌落；翻译pIII蛋白结构域的DNA序列得到如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示的序列。
6.根据权利要求5所述的人绒毛膜***肽适配体的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，用M13噬菌体对人绒毛膜***进行孵育之前将人绒毛膜***添加到24孔板进行孵育。
7.根据权利要求5所述的人绒毛膜***肽适配体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法中，筛选出SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示的序列后，还包括：将SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示的序列再与人绒毛膜***孵育，计算单个噬菌体与人绒毛膜***的结合率，筛选得到优选序列；所述单个噬菌体与人绒毛膜***的结合率计算公式为：结合噬菌体效价/输入噬菌体效价×100％。
8.根据权利要求5至7任意一项所述的人绒毛膜***肽适配体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法中，筛选出SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示的序列后还包括：对所筛选出的多肽序列进行甘氨酸修饰；操作方法包括：在SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示的任意一条序列的至少一端上加入三个极性甘氨酸。
9.根据权利要求4至7任意一项所述的人绒毛膜***肽适配体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法中，还包括：对权利要求4至7任意一项所述的人绒毛膜***肽适配体的制备方法得到的序列的NH2-末端进行半胱氨酸修饰。
10.权利要求1至3任意一项所述的人绒毛膜***肽适配体，或者权利要求4至9任意一项所述的人绒毛膜***肽适配体的制备方法所制得的人绒毛膜***肽适配体用于制作检测人绒毛膜***的检测试剂或制作检测人绒毛膜***的生物检测传感器；在所述检测人绒毛膜***的检测试剂或检测人绒毛膜***的生物检测传感器中，所述人绒毛膜***与人绒毛膜***肽适配体的结合摩尔比例为1:303。
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