CN113249492B - 一种评估猪眼肌面积的snp标记及其应用方法 - Google Patents

一种评估猪眼肌面积的snp标记及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种评估猪眼肌面积的SNP标记及其应用方法,所述SNP标记位于猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处,具有C/T多态性;该位点的基因型为CC的猪,相较于基因型为TC和TT的猪具有更大的眼肌面积。本发明所提供的与猪眼肌面积相关的SNP标记的确定,丰富了与猪眼肌面积相关的分子标记,可以辅助选择眼肌面积大的猪优势品种,缩短了育种周期,提高了育种效率和育种精度。

Description

一种评估猪眼肌面积的SNP标记及其应用方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,具体涉及猪分子标记辅助育种,尤其涉及一种评估猪眼肌面积的SNP标记及其应用方法。
背景技术
我国是全球第一大猪肉生产国,年出栏商品猪约7亿头。同时,我国也是世界上猪肉消费量最多的国家(占50%以上),猪肉消费量占我国肉类消费量的63.2%。猪肉产量和品质等性状决定了猪现代化养殖生产全产业链的经济效益。随着我国社会的发展及居民生活水平的提高消费者对肉产品的需求发生了根本变化,低脂肪高瘦肉的猪肉产品成为了人们饮食选择过程中重要的指标之一。眼肌面积与瘦肉率高度正相关,因此,选育背膘薄、眼肌面积大的优良种猪是育种企业的首要目标。
种猪的选择在育种中是非常关键的一步,直接决定种群的质量,目前大多数猪场的选种主要以表型选择和家系选择等为主,而传统的选种方式具有误选、误淘、育种效率低和育种周期长等弊端。
随着分子标记的逐渐丰富和全基因组分型技术的日渐成熟,同时得益于计算机运算能力的提升以及SNP分型芯片成本的大幅度下降,使得利用全基因组关联分析技术进行优良种猪目标分子标记筛选成为可能。全基因组关联分析技术从诞生到目前已经有十几年的历史,期间算法和模型得到不断的优化和改善,芯片的SNP位点密度也在不断的提升,通过全基因组关联分析可以较为准确的定位与动物经济性状相关的SNP位点区域和候选基因,提高分子育种的准确性和可靠性。
但是,目前缺少功能明确、效应显著且可直接用于育种的与猪眼肌面积相关的SNP标记。
因此,提供与猪眼肌面积相关的SNP标记及其应用,对猪生产和育种具有重要的意义。
发明内容
为了克服上述问题,本发明人进行了锐意研究,发现了与猪眼肌面积相关的SNP标记,其位于猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处,具有C/T多态性,可以通过筛选该SNP位点的CC基因型来获得高眼肌面积的猪品系,丰富了与猪眼肌面积相关的分子标记,增加了猪的瘦肉率和生长速度并加快了猪遗传改良的步伐,从而完成了本发明。
具体来说,本发明的目的在于提供以下方面:
第一方面,提供一种与猪眼肌面积相关的SNP标记,其中,所述SNP标记位于猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处。
其中,所述位于猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP标记具有C/T多态性。
其中,所述位于猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP位点的基因型为CC的猪,相较于基因型为TC和TT的猪具有更大的眼肌面积。
第二方面,提供一种第一方面所述SNP标记的获取方法,其中,所述方法包括以下步骤:
步骤1,选取猪群体,进行眼肌面积数据测定;
步骤2,提取猪的基因组DNA,进行基因型分型;
步骤3,对步骤1和步骤2得到的数据进行质量控制;
步骤4,将步骤3质量控制后的数据进行关联分析,获得所述SNP标记。
第三方面,提供一种第一方面所述SNP标记或第二方面所述方法获取的SNP标记在评估猪眼肌面积方面的应用。
第四方面,提供一种鉴定或者辅助鉴定猪眼肌面积的方法,其中,所述方法包括检测猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP位点基因型的步骤。
第五方面,提供一种猪眼肌面积性状的遗传改良方法,其中,所述方法包括确定种猪位于参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP标记,并根据所述标记做出相应选择的步骤。
其中,种猪的继代选育猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处SNP位点的基因型为CC的个体,淘汰该位点基因型为TC和TT的个体。
第六方面,提供一种用于第一方面所述SNP标记的引物对,其中,所述引物对包括引物P1和引物P2,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
第七方面,提供一种第六方面所述引物对评估猪眼肌面积中的应用,其中,所述应用包括以下步骤:
步骤i,提取待测猪的基因组DNA;
步骤ii,采用引物对对待测猪的基因组DNA进行扩增,获得PCR扩增产物;
步骤iii,对扩增产物进行测序,获得包括所述SNP位点的核苷酸序列;
步骤iv,根据测序结果,获得待测猪在该SNP位点的基因型。
本发明所具有的有益效果包括:
(1)本发明提供的SNP标记,可以对猪眼肌面积这一经济性状进行选择,增加猪的瘦肉率、提高猪的生长速度并加快猪遗传改良的步伐;
(2)本发明提供的与猪眼肌面积相关的SNP标记,为猪眼肌面积性状的遗传改良提供了切实可行的方案,提高了生猪生产企业的经济效益,同时可以正向利益驱动SNP分型芯片市场的发展与繁荣;
(3)本发明提供的与猪眼肌面积相关的SNP标记,分型技术的实施可以从一定程度上排除传统育种方式对猪优良基因的误淘和误选,增强优良种猪的选择准确性,加快经济效益最大化实现的步伐。
附图说明
图1示出本发明实施例2中基因型效应的箱线图。
具体实施方式
下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明,本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
猪的眼肌面积是受许多基因调控的数量性状,采用常规遗传手段难以精准鉴定其主效基因,而基于高密度SNP芯片的全基因组关联分析技术对数量性状候选基因鉴定及致因突变的解析提供了有效的技术手段。
本发明的第一方面,提供了一种与猪眼肌面积相关的SNP标记,所述SNP标记位于猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处。
其中,所述SNP标记记为ASGA0022902。
在本发明中,所述眼肌面积优选为猪达100kg体重的活体眼肌面积。
根据本发明一种优选的实施方式,所述位于猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP标记具有C/T多态性。
其中,该SNP位点的两种等位基因为C和T,C的基因频率为0.8402,T的基因频率为0.1598,C为优势等位基因。
在进一步优选的实施方式中,所述位于猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP位点的基因型为CC的猪,相较于基因型为TC和TT的猪具有更大的眼肌面积。
其中,所述位于猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP位点对应的基因型有三种,分别为CC、TC和TT,所述CC基因型为该SNP位点为C的纯合子,TC基因型为该SNP位点为杂合子,TT基因型为该SNP位点为T的纯合子。
本发明人研究发现,SNP分型技术的实施可以从一定程度上排除表型选择中饲养环境、饲料、疾病等因素对猪优良基因的误淘和误选,增强目标性状选择准确性。本发明中优选采用高密度SNP芯片进行基因分型,相对于传统的基因分型方法(如PCR、RFLP等),可以在很短的时间周期内对大量的SNP进行基因分型,并能极大地降低成本。
本发明的第二方面,提供了一种第一方面所述SNP标记的获取方法,所述方法包括以下步骤
步骤1,选取猪群体,进行眼肌面积数据测定。
在本发明中,优选选择长白母猪作为猪群体。
所述猪群体中每个个体的眼肌面积优选按照下述步骤进行:
在猪个体体重在85~105kg范围内时,采用河北省地方标准(DB 13/T 2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程,利用B超扫描测定倒数第3-4肋间处的眼肌面积(cm2),同时测定体重(kg)等数据。最后按照如下校正公式转换成达100kg体重的活体眼肌面积:
校正眼肌面积(cm2)=实际眼肌面积(cm2)+{[100-实际体重(kg)]×实际眼肌面积(cm2)}/[实际体重(kg)+70]。
步骤2,提取猪的基因组DNA,进行基因型分型。
在本发明中,采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取猪群体中每个个体的基因组DNA,优选采集猪耳组织进行基因组DNA的提取。
优选采用分光光度计和电泳对提取的猪基因组DNA进行浓度测定和质量检测,其中,提取的DNA的A260/A280比值在1.8~2.0,A260/A230比值在1.7~1.9判定为纯度合格;将浓度高于300ng/μL判定为浓度合格。
进一步地,将检测合格的DNA利用高密度SNP芯片进行基因型检测,如纽勤公司的Neogen_POR80K芯片,优选利用分型软件GenCall Version7.0.0进行。
步骤3,对步骤1和步骤2得到的数据进行质量控制。
其中,对步骤1中得到的眼肌面积表型数据的质量控制为:清除表型值缺失的个体,清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体。
对步骤2中得到的基因分型数据的质量控制为:清除基因型检出率小于95%的SNP位点;清除检出率小于95%的个体;清除最小等位基因频率(Minimum Allele Frequency,MAF)小于1%的个体;清除哈代-温伯格平衡(Hardy–Weinberg Equilibrium,HWE)卡方检验P值小于1.0E-4的SNP位点;清除性染色体上的SNP位点。
步骤4,将步骤3质量控制后的数据进行关联分析,获得所述SNP标记。
根据本发明一种优选的实施方式,优选采用R语言包GAPIT Version 3对所有分型SNP位点与校正眼肌面积进行全基因组关联分析。
其中,该软件包的统计模型为压缩混合线性模型,GAPIT的设计目的是在大数据集上准确地执行GWAS和基因组预测,混合线性模型(Mixed Liner Model,MLM)包括固定和随机效应,模型将种群结构作为固定效应,同时将个体纳入随机效应进行个体亲缘关系矩阵的构建,其统计分析模型如下:
y=Xβ+Zμ+e
其中,Y是观察到的表型的值;β是含有固定效应的未知值,包括遗传标记,种群结构(Q矩阵)和截距;μ是来自个体或者系的多个背景QTL的随机加性遗传效应的未知值;X和Z是已知的设计矩阵;e是未观察到的残差向量。
通过上述分析,能够得到与猪眼肌面积显著相关的SNP位点,还需要进一步比较分析所得SNP位点中不同基因型与眼肌面积的关联结果。
在进一步优选的实施方式中,采用Rstudio软件利用Kruskal-Wallis方法对所得SNP位点的基因型数据和眼肌面积数据进行差异显著性检验,以获得与眼肌面积显著相关的基因型类型。
本发明的第三方面,提供一种第一方面所述SNP标记或第二方面所述方法获取的SNP标记在评估猪眼肌面积方面的应用。
本发明的第四方面,提供一种鉴定或者辅助鉴定猪眼肌面积的方法,所述方法包括检测猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP位点基因型的步骤。
其中,若待测猪的参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP位点的基因型为CC,则该待测猪具有较大的眼肌面积;若待测猪的参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP位点的基因型为TC或TT,则该待测猪具有较小的眼肌面积。
本发明的第五方面,提供一种猪眼肌面积性状的遗传改良方法,所述方法包括确定猪核心群中种猪位于参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP标记,并根据所述标记做出相应选择的步骤。
优选地,种猪的继代选育猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处SNP位点的基因型为CC的个体,淘汰该位点基因型为TC和TT的个体。
本发明的第六方面,提供一种用于鉴定第一方面所述SNP标记的引物对,所述引物对包括引物P1和引物P2,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明的第七方面,提供了一种第六方面所述引物对在评估猪眼肌面积中的应用。
优选地,所述应用包括以下步骤:
步骤i,提取待测猪的基因组DNA;
步骤ii,采用上述引物对对待测猪的基因组DNA进行扩增,获得PCR扩增产物;
步骤iii,对扩增产物进行测序,获得包括所述SNP位点的核苷酸序列;
步骤iv,根据测序结果,获得待测猪在该SNP位点的基因型。
其中,根据基因型类型判断待测猪眼肌面积的大小,当待测猪位于参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP标记的基因型为CC时,具有较大的眼肌面积,当待测猪位于参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处的SNP标记的基因型为TC或TT时,具有较小的眼肌面积。
实施例
以下通过具体实例进一步描述本发明,不过这些实例仅仅是范例性的,并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1 SNP位点的获得
1、试验材料
本实施例所应用的猪群体为来自河北美神原种猪场的363头长白母猪。
2、眼肌面积测定与校正
在猪个体体重在85~105kg范围内时,采用河北省地方标准(DB 13/T 2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程,利用B超扫描测定倒数第3-4肋间处的眼肌面积(cm2),同时测定体重(kg)等数据。最后按照如下校正公式转换成达100kg体重的活体眼肌面积:
校正眼肌面积(cm2)=实际眼肌面积(cm2)+{[100-实际体重(kg)]×实际眼肌面积(cm2)}/[实际体重(kg)+70]。
其中,清除表型值缺失的个体,清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体。
3、DNA提取与SNP分型
对试验猪群体的猪耳朵组织进行采样,置于PBS缓冲液中,低温保存。
采用北京百泰克生物技术有限公司的DP1902型号细胞/组织基因组DNA提取试剂盒,从取得的猪耳组织中提取DNA,具体步骤如下:
(1)将猪耳组织剪碎后放入一个1.5ml离心管后,加入200μl组织裂解液TL,用大口径枪头吹打混匀;
(2)加入20μl的蛋白酶K(20mg/ml),剧烈颠倒轻摇充分混匀;
(3)将裂解的耳组织放置在55℃水浴3小时或者直到组织消化完全,期间轻柔的振荡几次帮助裂解;
(4)用一个1ml不带针头的一次性输液器抽打裂解物2-3次;
(5)加入200μl结合液CB和100μl异丙醇,剧烈颠倒轻摇充分混匀;
(6)13000rpm离心5分钟,将上清液加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)10000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液;
(7)加入500μl抑制物去除液IR,12000rpm离心30秒,弃废液;
(8)加入700μl漂洗液WB,12000rpm离心30秒,弃掉废液;
(9)加入500μl漂洗液WB,12000rpm离心30秒,弃掉废液;
(10)将吸附柱AC放回空收集管中,13000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应;
(11)取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热),室温放置3-5分钟,12000rpm离心1分钟;将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12000rpm离心1分钟;洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于50μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
上述步骤中适当力度充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时(如样品粘稠不易混匀)可以涡旋振荡15秒混匀。
用紫外分光光度计和凝胶电泳进行DNA质量检测,将检测合格的DNA放置于-20℃保存。
取检测合格的DNA,利用纽勤公司的Neogen_POR80K芯片进行基因型分型。
其中,清除基因型检出率小于95%的SNP位点;清除检出率小于95%的个体;清除最小等位基因频率(Minimum Allele Frequency,MAF)小于1%的个体;清除哈代-温伯格平衡(Hardy–Weinberg Equilibrium,HWE)卡方检验P值小于1.0E-4的SNP位点;清除性染色体上的SNP位点。
4、全基因组关联分析
采用R语言包GAPIT Version 3(系华盛顿大学张志武老师实验室研发)对所有分型SNP位点与校正眼肌面积进行全基因组关联分析,采用的统计分析模型如下:
y=Xβ+Zμ+e
其中,Y是观察到的表型的值;β是含有固定效应的未知值,包括遗传标记,种群结构(Q矩阵)和截距;μ是来自个体或者系的多个背景QTL的随机加性遗传效应的未知值;X和Z是已知的设计矩阵;e是未观察到的残差向量。
通过上述分析,得到SNP位点ASGA0022902(位于猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804bp处)的不同基因型与猪眼肌面积性状极显著相关。
实施例2 SNP位点不同基因型与眼肌面积的关联结果
1、试验材料
本实施例所应用的猪群体为来自河北美神原种猪场的363头长白母猪。
2、SNP的检测
对试验猪群体的猪耳朵组织进行采样,置于PBS缓冲液中,低温保存。
采用北京百泰克生物技术有限公司的DP1902型号细胞/组织基因组DNA提取试剂盒,从取得的猪耳组织中提取DNA,用紫外分光光度计和凝胶电泳进行DNA质量检测,将检测合格的DNA放置于-20℃保存。
取所有实验样本DNA,采用纽勤公司的Neogen_POR80K检测每个个体的基因型,通过R语言提取多态性位点的序列,统计SNP位点的基因型频率和基因频率分布,结果如表1所示:
表1
Figure BDA0002380939940000121
由表1可以看出,CC基因型为实验群体优势基因型,C为优势等位基因。
3、基因型与眼肌面积的关联分析结果
采用Rstudio软件对基因型数据和表型数据利用Kruskal-Wallis方法进行差异显著性检验,其中,P-value<0.05表明差异显著。关联分析结果如表2所示:
表2
Figure BDA0002380939940000122
由表2可知,三种基因型的猪的校正眼肌面积有显著差异,在达100kg体重日龄时,CC基因型的眼肌面积显著高于TC和TT基因型的猪的眼肌面积。
进一步地,利用R语言的ggplot2、ggpubr和magrittr函数包绘制三种基因型效应的箱线图,结果如图1所示。
由图1可以明显看出,位点ASGA0022902的CC基因型的个体眼肌面积比TC基因型的眼肌面积大1.61cm2,CC基因型的个体眼肌面积比TT基因型的眼肌面积大2.93cm2
因此,由上述结果可知,该SNP位点(ASGA0022902)的多态可以作为猪眼肌面积鉴定的分子标记,应用于分子育种中以改良猪的产肉性状,提高瘦肉率和产肉量。在猪分子育种过程中,继代选育该位点的CC基因型个体作为种猪,可以筛选出高眼肌面积的猪群体,进而达到提高猪的生产效率的目的,为育种生产活动带来较高的效益。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明,不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解,在不偏离本发明精神和范围的情况下,可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进,这些均落入本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所
<120> 一种评估猪眼肌面积的SNP标记及其应用方法
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物P1(人工序列)
<400> 1
gggaccctta cccagcggat tgtgt 25
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物P2(人工序列)
<400> 2
cagaccgaac cagaaacaga 20

Claims (2)

1.用于鉴定与猪眼肌面积大小相关的SNP分子标记的试剂在评估猪眼肌面积中的应用,其特征在于,
所述SNP分子标记的SNP位点为国际猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804个核苷酸位点,所述SNP位点具有C/T多态性;
所述SNP位点的基因型为CC的猪的眼肌面积大于基因型为TC或TT的猪的眼肌面积;
所述猪的品种为长白母猪。
2.一种猪眼肌面积性状的遗传改良方法,其特征在于,所述方法包括确定种猪位于国际猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804个核苷酸位点的基因型,
所述猪的品种为长白母猪,
所述种猪的继代选育国际猪参考基因组10.2版本4号染色体第135,071,804个核苷酸位点的基因型为CC的个体,淘汰该位点基因型为TC和TT的个体。
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Assignee: SHENZHEN YUANQIN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

Assignor: AGRICULTURAL GENOMICS INSTITUTE, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

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Denomination of invention: A SNP marker for evaluating pig eye muscle area and its application method

Granted publication date: 20220708

License type: Common License

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Application publication date: 20210813

Assignee: Shenzhen Keyi Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: AGRICULTURAL GENOMICS INSTITUTE AT SHENZHEN, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2023980033884

Denomination of invention: A SNP Marker for Evaluating the Eye Muscle Area of Pigs and Its Application Method

Granted publication date: 20220708

License type: Common License

Record date: 20230321