CN113249421B - 一种金丝***蛋白多肽及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金丝***多肽及应用，金丝***多肽的制备方法包括：预处理；菊花蛋白质提取；菊花多肽制备。本发明以金丝***粉为原料，首先采用碱溶酸沉法提取其中的蛋白质，其次采用蛋白酶水解菊花蛋白，获取低分子量菊花多肽，生产过程绿色环保，产物具备较好α‑葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化等功能，可应用于功能性食品、药品、化妆品等领域，本发明可显著提高菊花利用价值。
Description
技术领域
本发明属于药源性蛋白深加工技术领域，涉及一种提取制备蛋白多肽的方法，尤其是一种从金丝***种提取制备蛋白多肽的方法及其应用。
背景技术
菊花自古以来就被作为重要的观赏植物和食用植物，而金丝***更是菊花中的精品，其所含的黄酮、多酚等物质被人们所熟知，而金丝***中的蛋白质约为12％，远高于其它花卉，而人们对金丝***中营养丰富的蛋白质仍缺少广泛认识和研究，菊花蛋白质含有人体必需的氨基酸，且比例均衡，机体利用率高。但是由于蛋白具有分子量大，不易吸收，或易水解为氨基酸丧失活性等问题，因此在很大程度上限制了它在食品、化妆品、保健品等领域的应用，而对于菊花蛋白水解为多肽的研究或应用尚未见报道。从产业和市场情况来看，金丝***深加工产品的开发利用也比较滞后，生产附加值低，没有形成产业链。而有研究显示，金丝***蛋白含量高达12.9％，所含氨基酸种类丰富，具有很高的开发利用价值。
金丝***蛋白多肽，是指金丝***蛋白经蛋白酶水解、分离纯化得到的小分子低聚肽混合物，将其进一步加工制成保健品、护肤品等产品，对提高金丝***的附加值和市场竞争力具有重要意义。
通过检索，尚未发现与本专利申请相关的公开专利文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种绿色简便，水解度高的金丝***蛋白多肽的制备方法及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
一种金丝***蛋白酶解多肽，制备步骤如下：
(1)菊花前处理：将菊花原料粉碎过筛，得到菊花粉碎料：
(2)菊花蛋白的提取：采用碱溶酸沉法提取菊花粉中的菊花蛋白；
(3)菊花多肽的制备：将步骤(2)制备得到的菊花蛋白粉配制成菊花蛋白水溶液，加入蛋白酶进行酶解；酶解结束后，8000r/min条件下离心10-20min，取上清液，脱色，真空冷冻干燥，得到菊花多肽粉；
所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、风味蛋白酶及两者组成的复合酶。
进一步地，所述步骤(2)中碱溶酸沉法是将菊花粉碎料配成菊花粉水溶液，调节pH值至8.0～9.5，50～60℃恒温提取5h后离心弃去沉淀；再调节上清液的pH值至3.5～4.5，离心取沉淀，水洗至中性；经真空冷冻干燥，得到菊花蛋白粉。
进一步地，所述菊花粉水溶液的质量浓度为1％～4％；或者，用0.5～1mol/LNaOH溶液调节pH值至8.0～9.5，50～60℃恒温反应5h，8000r/min离心10～15min，弃去沉淀；再用0.5～1mol/L的HCl溶液调节上清液的pH值至3.5～4.5，8000r/min离心10～15min，保留沉淀，水洗至中性；经真空冷冻干燥，粉碎得到菊花蛋白粉。
进一步地，所述步骤(3)中蛋白酶的添加量为10000-12000U/g；或者，当蛋白酶为木瓜蛋白酶、风味蛋白酶组成的复合酶时，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶酶添加质量比值为1:1-1:3。
进一步地，所述步骤(3)中菊花蛋白底物质量浓度为1％-3％。
进一步地，所述步骤(3)中酶解时pH值为7.5-8.5；或者，酶解温度为50-55℃；或者，酶解时间4-5h；或者，超滤离心后取分子量小于3kDa的酶解液；
或者，所述脱色为添加质量终浓度2％-5％活性炭，55℃下搅拌1-2h，脱色后浓缩。
利用如上所述的金丝***蛋白酶解多肽制得的金丝***蛋白多肽制剂。
进一步地，所述制剂为颗粒、片剂、胶囊或口服液。
如上所述的金丝***蛋白酶解多肽在营养食品、保健食品、运动员食品、化妆品或护肤品方面中的应用。
进一步地，所述营养食品是为病人或者婴儿提供的营养食品；所述保健食品是为老年人或者亚健康人群提供的保健食品；或者，所述营养食品为蛋白饮料；所述化妆品和护肤品是指保湿水、乳、面霜、精华、面膜、眼霜、粉底液或防晒霜。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明金丝***蛋白多肽是以干燥的金丝***花为原料，经过粉碎过筛、粗蛋白提取、冷冻干燥，得到金丝***蛋白；将金丝***蛋白用风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和二者不同复合方式的酶解得到不同的金丝***多肽样品，并通过条件优化获得了高水解度的多肽样品，得到的金丝***多肽具有降血糖和抗氧化等功效，生产过程绿色环保，产物具备较好α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化等功能，在食品工业、保健品、化妆品和医药等领域具有广泛的开发应用前景。本发明可显著提高菊花利用价值。
2、本发明菊花蛋白多肽色泽均一，呈白至浅黄色，分子量小，更容易被人体所吸收和利用，其制备方法简单、酶解程度易于控制、产品的质量和功效良好，产品得率高。
3、本发明要挖掘金丝***蛋白的潜在应用价值，将其利用酶解作用转化为多肽，通过绿色环保、产品得率高，操作简便的制备方法得到金丝***蛋白多肽，并将其应用于药品、保健品、营养品、食品及化妆品等领域。
4、本发明旨在通过对菊花多肽的制备和纯化，来进一步提高有效多肽的含量，可用于配制具有调节血糖代谢功能的特殊膳食、保健食品、食品添加剂、药物等领域和具有抗氧化功能的护肤品、化妆品等领域，适用于工业化生产。
5、本发明中蛋白酶的酶解方式为，单一木瓜蛋白酶酶解，单一风味蛋白酶酶解，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶组成的复合酶协同酶解，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶组成的复合酶分步酶解(先风味蛋白酶后木瓜蛋白酶)，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶组成的复合酶分步酶解(先木瓜蛋白酶后风味蛋白酶)。
6、本发明中超滤离心时在于将菊花多肽用超滤膜按分子量进行分级分离，得到不同分子量菊花多肽溶液，优选截留分子量3KDa以下。
附图说明
图1为本发明中多肽抗氧化活性结果图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种金丝***蛋白酶解多肽，制备步骤如下：
(1)菊花前处理：将菊花原料粉碎过筛，得到菊花粉碎料：
(2)菊花蛋白的提取：采用碱溶酸沉法提取菊花粉中的菊花蛋白；
(3)菊花多肽的制备：将步骤(2)制备得到的菊花蛋白粉配制成菊花蛋白水溶液，加入蛋白酶进行酶解；酶解结束后，8000r/min条件下离心10-20min，取上清液，脱色，真空冷冻干燥，得到菊花多肽粉；
所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、风味蛋白酶及两者组成的复合酶。
较优地，所述步骤(2)中碱溶酸沉法是将菊花粉碎料配成菊花粉水溶液，调节pH值至8.0～9.5，50～60℃恒温提取5h后离心弃去沉淀；再调节上清液的pH值至3.5～4.5，离心取沉淀，水洗至中性；经真空冷冻干燥，得到菊花蛋白粉。
较优地，所述菊花粉水溶液的质量浓度为1％～4％；或者，用0.5～1mol/LNaOH溶液调节pH值至8.0～9.5，50～60℃恒温反应5h，8000r/min离心10～15min，弃去沉淀；再用0.5～1mol/L的HCl溶液调节上清液的pH值至3.5～4.5，8000r/min离心10～15min，保留沉淀，水洗至中性；经真空冷冻干燥，粉碎得到菊花蛋白粉。
较优地，所述步骤(3)中蛋白酶的添加量为10000-12000U/g；或者，当蛋白酶为木瓜蛋白酶、风味蛋白酶组成的复合酶时，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶酶添加质量比值为1:1-1:3。
较优地，所述步骤(3)中菊花蛋白底物质量浓度为1％-3％。
较优地，所述步骤(3)中酶解时pH值为7.5-8.5；或者，酶解温度为50-55℃；或者，酶解时间4-5h；或者，超滤离心后取分子量小于3kDa的酶解液；
或者，所述脱色为添加质量终浓度2％-5％活性炭，55℃下搅拌1-2h，脱色后浓缩。
利用如上所述的金丝***蛋白酶解多肽制得的金丝***蛋白多肽制剂。
较优地，所述制剂为颗粒、片剂、胶囊或口服液。
如上所述的金丝***蛋白酶解多肽在营养食品、保健食品、运动员食品、化妆品或护肤品方面中的应用。
较优地，所述营养食品是为病人或者婴儿提供的营养食品；所述保健食品是为老年人或者亚健康人群提供的保健食品；或者，所述营养食品为蛋白饮料；所述化妆品和护肤品是指保湿水、乳、面霜、精华、面膜、眼霜、粉底液或防晒霜。
具体地，相关制备及检测如下：
实施例1
一种金丝***蛋白酶解多肽，制备步骤如下：
菊花预处理步骤：对干燥的金丝***用粉碎机粉碎，过60目筛后，获得菊花粉，备用。
菊花蛋白提取步骤：取菊花粉加水，加入NaOH进行碱溶处理后，在8000r/min的转速条件下离心处理10min，再将上清液的pH调至等电点后，再次在8000r/min的转速条件下离心处理10min，离心取沉淀，水洗至中性，真空冷冻干燥，获得菊花蛋白。其中，菊花粉取5.0g，加入去离子水150ml，反应温度为55℃，碱溶pH＝8，酸沉pH＝4，反应时长为5h。
菊花多肽制备步骤：取菊花蛋白用去离子水溶解，用1mol/LNaOH调节pH后加入蛋白酶于恒温下进行酶解处理，迅速升温至90℃灭酶20min，在8000r/min的转速条件下离心处理10min，取上清液以获得菊花多肽液，pH值和恒温酶解处理温度根据选择的蛋白酶确定，本实施例中，蛋白酶选择风味蛋白酶(2.5万U/g)。其中，取菊花蛋白0.5g,加入去离子水20ml,风味蛋白酶酶添量为10000U/g，pH为8.5，酶解温度为55℃。再采用膜过滤技术对酶解后的菊花粗多肽的分子量进行粗分，去除大分子蛋白，超滤膜的分子截留量为3kDa，收集分子量在3kDa以下的菊花多肽，2％-5％活性炭55℃下搅拌1-2h脱色后浓缩，真空干燥，即得菊花多肽粉60.2mg。
实施例2
一种金丝***蛋白酶解多肽，制备步骤如下：
菊花预处理步骤：对干燥的菊花用粉碎机粉碎，过60目筛后，获得菊花粉，备用。
菊花蛋白提取步骤：取菊花粉加水，加入NaOH进行碱溶处理后，在8000r/min的转速条件下离心处理10min，再将上清液的pH调至等电点后，再次在8000r/min的转速条件下离心处理10min，离心取沉淀，水洗至中性，真空冷冻干燥，获得菊花蛋白。其中，菊花粉取5.0g,加入去离子水150ml，反应温度为55℃，碱溶pH＝8，酸沉pH＝4，反应时长为5h。
菊花多肽制备步骤：取菊花蛋白用去离子水溶解，用1mol/LNaOH调节pH后加入蛋白酶于恒温下进行酶解处理，迅速升温至90℃灭酶20min，在8000rpm的转速条件下离心处理10min，取上清液以获得菊花多肽液，pH值和恒温酶解处理温度根据选择的蛋白酶确定，本实施例中，蛋白酶选择木瓜蛋白酶(80万U/g)。其中，取菊花蛋白0.5g，加入去离子水20ml，木瓜蛋白酶酶添量为10000U/g，pH为7.5，酶解温度为55℃。再采用膜过滤技术对酶解后的菊花粗多肽进行粗分，去除大分子蛋白，预设的超滤膜的分子截留量为3kDa，收集分子量在3kDa以下的菊花多肽，2％-5％活性炭55℃下搅拌1-2h脱色后浓缩，真空干燥，即得菊花多肽粉35.8mg。
实施例3
一种金丝***蛋白酶解多肽，制备步骤如下：
菊花预处理步骤：对干燥的菊花用粉碎机粉碎，过60目筛后，获得菊花粉，备用。
菊花蛋白提取步骤：取菊花粉加水，加入NaOH进行碱溶处理后，在8000r/min的转速条件下离心处理10min，再将上清液的pH调至等电点后，再次在8000r/min的转速条件下离心处理10min，离心取沉淀，水洗至中性，真空冷冻干燥，获得菊花蛋白。其中，菊花粉取5.0g，加入去离子水150ml，反应温度为55℃，碱溶pH＝8，酸沉pH＝4，反应时长为5h。
菊花多肽制备步骤：取菊花蛋白用去离子水溶解，用1mol/LNaOH调节pH后加入蛋白酶于恒温下进行酶解处理，90℃灭酶20min，在8000r/min的转速条件下离心处理10min，取上清液以获得菊花多肽液，pH值和恒温酶解处理温度根据选择的蛋白酶确定，本实施例中，蛋白酶选择风味蛋白酶与木瓜蛋白酶组成的复合酶。其中，取菊花蛋白0.5g，加入去离子水20ml，该复合酶酶解方式为协同酶解，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶添量比例为1:1，总酶添量为10000U/g，pH为8，酶解温度为55℃。再采用膜过滤技术对酶解后的菊花粗多肽进行粗分，去除大分子蛋白，预设的超滤膜的分子截留量为3kDa，收集分子量在3kDa以下的菊花多肽，2％-5％活性炭55℃下搅拌1-2h脱色后浓缩，真空干燥，即得菊花多肽粉78.5mg。
实施例4
一种金丝***蛋白酶解多肽，制备步骤如下：
菊花预处理步骤：对干燥的菊花用粉碎机粉碎，过60目筛后，获得菊花粉，备用。
菊花蛋白提取步骤：取菊花粉加水，加入NaOH进行碱溶处理后，在8000r/min的转速条件下离心处理10min，再将上清液的pH调至等电点后，再次在8000r/min的转速条件下离心处理10min，离心取沉淀，水洗至中性，真空冷冻干燥，获得菊花蛋白。其中，菊花粉取5.0g，加入去离子水150ml，反应温度为55℃，碱溶pH＝8，酸沉pH＝4，反应时长为5h。
菊花多肽制备步骤：取菊花蛋白用去离子水溶解，用1mol/LNaOH调节pH后加入一种蛋白酶于恒温下进行酶解处理，迅速升温至90℃灭酶20min，恢复至原恒温后，用1mol/LNaOH调节pH加入另一种蛋白酶于恒温下进行酶解处理，迅速升温至90℃灭酶20min，待恢复至室温在8000r/min的转速条件下离心处理10min，取上清液以获得菊花多肽液，pH值和恒温酶解处理温度根据选择的蛋白酶确定，本实施例中，蛋白酶选择风味蛋白酶与木瓜蛋白酶组成的复合酶。其中，取菊花蛋白0.5g，加入去离子水20ml,该复合酶酶解方式为分步酶解，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶添量比例为1:1，总酶添量为10000U/g，先加风味蛋白酶，后加木瓜蛋白酶，两阶段pH均为8，酶解温度为55℃。再采用膜过滤技术对酶解后的菊花粗多肽进行粗分，去除大分子蛋白，预设的超滤膜的分子截留量为3kDa，收集分子量在3kDa以下的菊花多肽，2％-5％活性炭55℃下搅拌1-2h脱色后浓缩，真空干燥，即得菊花多肽粉94.6mg。
实施例5
一种金丝***蛋白酶解多肽，制备步骤如下：
菊花预处理步骤：对干燥的菊花用粉碎机粉碎，过60目筛后，获得菊花粉，备用。
菊花蛋白提取步骤：取菊花粉加水，加入NaOH进行碱溶处理后，在8000r/min的转速条件下离心处理10min，再将上清液的pH调至等电点后，再次在8000r/min的转速条件下离心处理10min，离心取沉淀，水洗至中性，真空冷冻干燥，获得菊花蛋白。其中，菊花粉取5.0g，加入去离子水150ml，反应温度为55℃，碱溶pH＝8，酸沉pH＝4，反应时长为5h。
菊花多肽制备步骤：取菊花蛋白用去离子水溶解，用1mol/LNaOH调节pH后加入一种蛋白酶于恒温下进行酶解处理，迅速升温至90℃灭酶20min，恢复至原恒温后，用1mol/LNaOH调节pH加入另一种蛋白酶于恒温下进行酶解处理，迅速升温至灭酶20min，待恢复至室温在8000r/min的转速条件下离心处理10min，取上清液以获得菊花多肽液，pH值和恒温酶解处理温度根据选择的蛋白酶确定，本实施例中，蛋白酶选择风味蛋白酶与木瓜蛋白酶组成的复合酶。其中，取菊花蛋白0.5g，加入去离子水20ml，该复合酶酶解方式为分步酶解，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶添量比例为1:1，总酶添量为10000U/g，先加木瓜蛋白酶，后加风味蛋白酶，两阶段pH均为8，酶解温度为55℃。再采用膜过滤技术对酶解后的菊花粗多肽进行粗分，去除大分子蛋白，预设的超滤膜的分子截留量为3kDa，收集分子量在3kDa以下的菊花多肽，2％-5％活性炭55℃下搅拌1-2h脱色后浓缩，真空干燥，即得菊花多肽粉90.3mg。
将实施例1-5方法得到的菊花小分子多肽进行α-葡萄糖苷酶抑制活性检测，结果如表1所示：
表1.α-葡萄糖苷酶抑制活性测试结果
由上表看出，五种多肽均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中，先加入风味蛋白酶后加入木瓜蛋白酶所得到的菊花多肽具有更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
将实施例1-2方法得到的菊花小分子多肽进行抗氧化活性测试，结果如图1所示，可以看出，风味蛋白酶酶解多肽(ZQ-FW-9)和木瓜蛋白酶酶解多肽(ZQ-MG-5)均可以显著提高PC12细胞经双氧水氧化损伤后的存活率，具有抗氧化作用，其中风味蛋白酶酶解多肽的抗氧化作用更强。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (5)
1.一种金丝***蛋白酶解多肽，其特征在于：制备步骤如下：
(1)菊花前处理：将菊花原料粉碎过筛，得到菊花粉碎料：
(2)菊花蛋白的提取：采用碱溶酸沉法提取菊花粉中的菊花蛋白；
(3)菊花多肽的制备：将步骤(2)制备得到的菊花蛋白粉配制成菊花蛋白水溶液，加入蛋白酶进行酶解；酶解结束后，8000r/min条件下离心10-20min，取上清液，脱色，真空冷冻干燥，得到菊花多肽粉；
所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、风味蛋白酶及两者组成的复合酶；
所述步骤(2)中碱溶酸沉法是将菊花粉碎料配成菊花粉水溶液，调节pH值至8.0～9.5，50～60℃恒温提取5h后离心弃去沉淀；再调节上清液的pH值至3.5～4.5，离心取沉淀，水洗至中性；经真空冷冻干燥，得到菊花蛋白粉；
所述菊花粉水溶液的质量浓度为1%～4％；用0.5～1mol/L NaOH溶液调节pH值至8.0～9.5，50～60℃恒温反应5h，8000r/min离心10～15min，弃去沉淀；再用0.5～1mol/L的HCl溶液调节上清液的pH值至3.5～4.5，8000r/min离心10～15min，保留沉淀，水洗至中性；经真空冷冻干燥，粉碎得到菊花蛋白粉；
所述步骤(3)中蛋白酶的添加量为10000-12000U/g；当蛋白酶为木瓜蛋白酶、风味蛋白酶组成的复合酶时，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶酶添加质量比值为1:1-1:3；
所述步骤(3)中菊花蛋白底物质量浓度为1%-3%；
所述步骤(3)中酶解时pH值为7.5-8.5；酶解温度为50-55℃；酶解时间4-5h；超滤离心后取分子量小于3kDa的酶解液；
所述脱色为添加质量终浓度2%-5%活性炭，55℃下搅拌1-2h，脱色后浓缩。
2.利用如权利要求1所述的金丝***蛋白酶解多肽制得的金丝***蛋白多肽制剂。
3.根据权利要求2所述的金丝***蛋白多肽制剂，其特征在于：所述制剂为颗粒、片剂、胶囊或口服液。
4.如权利要求1所述的金丝***蛋白酶解多肽在营养食品、保健食品、运动员食品或化妆品方面中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述营养食品是为病人或者婴儿提供的营养食品；所述保健食品是为老年人或者亚健康人群提供的保健食品；所述营养食品为蛋白饮料；所述化妆品是指保湿水、乳、面霜、精华、面膜、眼霜、粉底液、防晒霜。
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Inventor after: Guo Na Inventor after: Sun Hua Inventor after: Zhang Qian Inventor after: Li Yu Inventor before: Guo Na Inventor before: Zhang Qian Inventor before: Li Yu |
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| GR01 | Patent grant | ||
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