CN113249403B - 一种具有spvd抗性甘薯的育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术及植物保护学领域，更具体的说属于一种具有SPVD抗性甘薯的育种方法。本申请通过提交的构建方法，提供了一种用于培育SPVD抗性甘薯的育种方法，基于上述方法构建对应的CRISPR/Cas13载体及利用农杆菌株系EHA105侵染甘薯愈伤并诱导分化，获得了具有SPVD抗性的转基因甘薯株系，通过材料混种、毒源嫁接实验、带毒昆虫侵染等方法对转基因甘薯的抗性进行了***验证。实验结果表明，利用该种方法可以创制出具有SPVD甘薯复合病毒病抗性的转基因甘薯，该技术也可用于其他品种、类型的栽培种甘薯用于创制具有SPVD抗性的新种质。

Description

一种具有SPVD抗性甘薯的育种方法
技术领域
本发明属于分子生物学及植物育种领域，具体设计利用分子生物学技术进行甘薯分子育种工作，从而创制出具有甘薯复合病毒病(SPVD)抗性的转基因甘薯新品种的育种方法。
背景技术
甘薯病毒病是甘薯产业面临的最为严重的病害。近年来，甘薯病毒病在全国乃至全球范围内的爆发流行造成甘薯大幅减产及难以估量的经济损失，严重影响和制约了我国乃至世界甘薯产业的发展。SPV D由两种RNA病毒共同侵染所引起，即毛形病毒属(Crinivirus)的甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)和马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)。SPVD是甘薯最为严重的病害之一，SPVD可以造成50％-98％的甘薯减产甚至绝收，是全球范围内甘薯产业的主要问题。其具体表现在当两种病毒(SPFMV/SPCSV)单独侵染甘薯时植株发病的表型并不明显或是仅仅发生轻微症状，而当SPFMV和SPCSV共同侵染甘薯后则产生了明显的病毒协生效应，进而使甘薯植株表现出严重的叶片扭曲、畸形、褪绿、明脉以及植株矮化等症状；而从病毒复制的情况来看，在协生侵染导致植株出现严重表型的过程中，SPFMV病毒拷贝数急速上升，和单独侵染甘薯时相比其拷贝上升了约600倍，SPCSV病毒拷贝数变化不明显或是略微下降。在此过程中，SPFMV是明显的受益者，SPCSV作为“辅助者”发挥功能，这和已知的绝大多数由马铃薯Y病毒参与的病毒协生现象完全不同。
SPCSV-RNase3是甘薯复合病毒病(SPVD)发病的关键原因。SPCSV除了能够与SPFMV发生病毒协生效应之外，还能与多种自然侵染甘薯的病毒发生协生作用，如黄瓜花叶病毒(CMV)、甘薯轻斑驳花叶病毒(SPMMV)等，造成严重的甘薯病毒症状和产量损失。因此，这种由SPCSV介导的病毒协生作用是SPVD导致甘薯出现严重病症及产量损失的关键因素。SPCSV-RNase3是SPCSV基因组中编码的一个Ⅲ型RNA内切酶(RNase3)，该酶与拟南芥和水稻Class 1RNAⅢ同源，具有dsRNA特异的核酸内切酶活性。Cuellar等发现包括SPFMV在内的多种RNA病毒侵染RNase3转基因甘薯后，病毒积累量与侵染野生型甘薯相比显著上升，并表现出更加严重的甘薯病症。这与自然条件下SPFMV或其它病毒与SPCSV共侵染引起的病毒协生效应极其相似。实验结果表明SPCSV介导病毒协生效应的关键机制在于其中的RNase3抑制了宿主RNA沉默机制，使甘薯清除病毒能力丧失或显著降低，从而造成SPFMV或其它病毒在细胞中过度积累，最终导致严重病症的发生。SPCSV-P22是来自于SPCSV病毒的沉默抑制子，其中SPCSV-P22仅在部分SPCSV分离物中被发现且实验结果证明虽然SPCSV-P22同样具有抑制转录后沉默的能力，但是P22在SPVD的发病过程中主要作用于增强SPCSV-RNase3抑制甘薯转录后沉默(PTGS)的能力，这表明SPCSV-P22同样不是引起SPVD病毒病的直接原因。因此，RNase3是SPCSV介导的病毒协生效应及SPVD致病的关键因子。
尚未有效防治甘薯复合病毒病SPVD的技术手段。SPVD对甘薯的种植和生产造成了极其重大的经济损失，是整个甘薯产业迫切需要解决的重大问题。但是由于SPVD病毒病研究的难度高进展慢，至今尚未发现高效的防治手段以及具有显著抗性的栽培种种质资源，抗性资源的缺失直接限制了SPVD抗性甘薯材料的育种过程。
而利用常规生物技术育种提高甘薯SPVD抗性均依赖于外源病毒片段诱导激活甘薯植株自身的RNA沉默***的方法，且甘薯的以薯块繁殖及扦插的无性繁殖导致其感染SPVD后植株体内的病毒逐年积累，病毒编码的一系列的沉默抑制子会抑制已经被激活的RNA沉默***从而导致SPVD的最终爆发，所以基于植物RNAi机制的抗SPVD技术并不适用于抑制RNase3介导的病毒协生作用，无法从根本上提高甘薯对于SPVD抗性。
目前尚没有合适的种质资源与技术手段用于SPVD抗性遗传改良。因此，开发一种新技术来抑制RNase3介导的病毒协生作用并用于SPVD抗性遗传改良显得极为迫切。
发明内容
本发明利用RfxCas13d(CRISPR-Cas13变体)及靶向SPCSV-RNase3的特异性序列设计了一种用于提高栽培种甘薯对甘薯复合病毒病(SPVD)的病毒抗性的分子育种方案。其内容为：基于RfxCas13d蛋白及靶向病毒核心蛋白SPCSV-RNase3的核酸序列设计并构建了一种靶向SPCSV-RNase3的甘薯稳定遗传转化载体，通过胚性愈伤细胞转化法对徐薯29进行了遗传转化并成功获得了阳性转化株系。通过自然培养条件、温室环境下的虫媒接种病毒和培养室嫁接接种病毒等不同的验证方式，验证了靶向SPCSV-RNase3的RfxCas13d阳性甘薯转化植株在相同的病毒侵染条件下显著抑制了SPVD发病过程中的关键病毒SPFMV的复制，从而实现了对甘薯SPVD病毒病的防治，并且本发明创制出了具有甘薯SPVD抗性的转基因甘薯。
具体技术方案如下：
一种具有SPVD抗性甘薯的育种方法，包括如下步骤：
(1)获得转基因甘薯的植物表达载体，采用在常规三元植物表达载体pCambia1380中***RfxCas13d序列及对应靶向SPCSV-RNase3的靶标序列；
(2)将步骤(1)构建获得的载体通过化学法进行农杆菌菌株EHA105的转化；
(3)将步骤(2)转化获得的转基因阳性甘薯进行分选扩繁；
(4)对所获得的转基因甘薯的病毒抗性进行鉴定；
其中，所述常规三元植物表达载体pCambia1380载体中已预先构建了表达HYG(潮霉素)的表达框用于对转基因阳性的植物进行筛选和转基因阳性鉴定。
进一步的，所述的步骤(1)构建方法包含了2段不同的序列表达框；分别为使用pNbU4启动子驱动RfxCas13d蛋白基因表达，使用pAtU6启动子驱动靶向SPCSV-RNase3的Spacer表达。
进一步的，所述的构建方法采用了分段克隆的方式对植物表达载体体pCambia1380进行构建。
进一步的，所述构建方法在于，先将pCambia1380载体分别使用HindIII/EcoRI；KpnI/BamHi限制性内切酶进行切开，后分别***包含有RfxCas13d的序列表达框及包含gRNA片段的表达框；所述的gRNA包含靶向SPCSV-RNase3基因的Spacer及Poly T的DNA片段；所述的gRNA片段的表达框使用pAtU6启动子驱动表达；最后利用同源重组的连接方式进行载体克隆连接以获得对应的用于遗传转化的甘薯表达载体。
进一步的，所述的包含有RfxCas13d的序列表达框利用软件OptimumGene进行了密码子偏好性优化并进行对于核酸片段合成；优选的所述的偏好性优化采用双子叶植物。
进一步的，所述的pAtU6启动子驱动表达采用了优化的引导序列，所述的引导序列核苷酸序列如SEQ ID NO:2。
进一步的，所述步骤(2)包括如下步骤：
将步骤(1)构建完成的载体加入农杆菌EHA105感受态细胞中，经过冰浴、液氮冷冻、热激、摇菌和涂布平板的步骤，在28度培养箱培养48h，挑选PCR鉴定为阳性的的单克隆菌落；使用YEB液体培养基进行过夜摇菌，将获得的浓度OD600＝0.6的农杆菌菌液侵染已预先制备完成的甘薯愈伤细胞。
进一步的，步骤(3)具体为：将步骤(2)转化获得的抗HYG胚性愈伤细胞(20mg/LHYG)转化至甘薯分化培养基MS后培养60天，并利用PCR鉴定法对获得的转基因甘薯植株进行抗性阳性鉴定。
进一步的，所述步骤(4)采用虫媒传播及嫁接传播的方式进行抗性验。实验结果表明，和对照组相比，该种转基因甘薯可以有效抑制长期(90d)虫媒传播和短期嫁接(15d)后导致的病毒(SPFMV/SPCSV)积累。
有益效果：
本申请利用CRISPR Cas13技术创造性的开发了一种有效创制具有甘薯病毒病(SPVD)抗性甘薯的分子育种方法，该方法通过使用CRISPR Cas13技术这一***赋予转基因甘薯对于SPVD病毒病的抗性，有效的规避了常规RNAI技术因为病毒沉默抑制子存在导致的沉默失效从而无法有效抑制病毒复制的问题，本发明创造同样可以用于进行不同类型、品种的甘薯栽培种的SPVD病毒病的抗性改良工程。本申请可以有效的实现对于甘薯复合病毒病SPVD的抗性，实验结果表明，利用该方法获得的转基因甘薯植株其病毒积累水平远远低于对照组的病毒积累程度，本发明创造也创制出了一种具有SPVD抗性的转基因甘薯。
附图说明
图1是甘薯遗传转化载体设计、构建及分子检测图。
图2是CRISPR Cas13对于SPVD的防治策略图。
图3利用自然传播法(虫媒)验证转化对照甘薯NT及靶向RNase3的RfxCas13d转化甘薯对于SPVD病毒病的抗性图，其中，
利用农杆菌侵染甘薯愈伤并诱导分化；
转化后的转基因甘薯NT、L1的表型；
利用PCR对转基因甘薯进行分子检测；
利用qRT-PCR对转基因甘薯的RfxCas13d进行分子检测；
利用WB技术对转基因甘薯的RfxCas13d的蛋白积累水平进行检测。
图4利用虫媒传播方式验证转化对照甘薯NT及靶向RNase3的RfxCas13d转化甘薯对于SPVD病毒病的抗性图，其中，
A.在自然环境下利用虫媒传播方式验证转化对照甘薯NT及靶向RNas e3的RfxCas13d转化甘薯对于SPVD病毒病的抗性；
B.在温室环境下利用虫媒传播方式验证转化对照甘薯NT及靶向RNas e3的RfxCas13d转化甘薯对于SPVD病毒病的抗性。
图5利用嫁接法验证转基因甘薯NT及靶向RNase3的RfxCas13d转化甘薯对于SPVD病毒病的抗性图，其中，
A.筛选及检测严重感染SPVD病毒病的甘薯作为毒源进行后续嫁接；
B.对嫁接后的NT及靶向RNase3 RrxCas13d的2种转基因甘薯进行病毒分子检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1获得转基因甘薯的植物表达载体
如图1、图2所示，本发明首先使用了常见的植物表达载体pCambia1380进行了载体的设计和改造工作。
为了获得用于甘薯遗传改量的植物重组载体，分别按照设计分步获得序列：其中Rfx Cas 13d序列参考自NC BI g en e bank网上公开的序列，并利用密码子优化软件(OptimumGene)对序列的偏好性进行了优化，并采用了偏向双子叶植物密码子的设计碱基方案；pAtU6启动子序列为常规序列，gRNA序列为特异性序列，其设计遵循RfxCas13d的gRNA设计要求并按照SPCSV-RNase3-JS(本实验室克隆自取自于徐州区域的染病甘薯样本)的序列，进行设计，SPCSV-RNase3-J序列S如SEQ ID NO:1。该重组载体的开发过程如下：
首先将pCambia1380载体利用限制性内切酶HindIII/BamHI切开，具体步骤如下：向200μL离心管中加入载体质粒20μL，Buffer 5μL，内切酶各1μL，无菌水23μL，形成50μL的反应体系，37℃孵育1h。将酶切产物利用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳分析，选择明亮、特异性条带，利用凝胶回收试剂盒进行纯化并测浓度，获得了线性化的骨架载体。然后利用引物pNbU4-1F/pNbU4-1R和tHSP-1F/tHSP-1R分别对片段一的启动子pNbU4和终止子tHSP进行克隆；利用引物pAtU6-1F/pAtU6-1R和Poly T-1F/Poly T-1R分别对片段二的启动子pAtU6和终止子Poly T进行克隆。克隆PCR条件为
将克隆获得的片段利用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，选择明亮、特异性条带，利用凝胶回收试剂盒进行纯化并测浓度。利用诺为赞C113多片段同源重组试剂盒将纯化获得的片段整合到预先酶切制备的植物表达载体pCambia1380中，将获得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选抗性为卡那霉素(Kan)，终浓度为50mg/L。将平板倒置放置于37℃恒温培养箱中，培养8-10h后挑选单菌落进行PCR检测，对应核酸Marker挑选正确长度的阳性克隆。将PCR检测正确的单克隆菌液吸取到包含2ml LB液体培养基(50mg/L Kan)的离心管中，放入37℃摇床中培养12小时，转速为200rpm。将浑浊的菌液吸取100μL送至南京擎科生物科技公司进行测序，将测序结果和参考序列比对，并对序列正确的质粒再次进行酶切验证，将正确质粒命名为中间载体pCambia1380-mid。
接下来利用限制性内切酶SacI/EcoRI对中间载体pCambia1380-mid进行酶切，方法与上述骨架载体pCambia1380酶切方法类似。使用引物RfxCas13d-1F/RfxCas13d-1R和gRNA-1F/gRNA-1R对片段RfxCas13d与合成的gRNA进行克隆，条件与上述克隆启动子片段条件一致。利用诺为赞C112双片段同源重组试剂盒整合到预先酶切制备的植物表达中间载体pCambia1380-mid中，利用与上述类似的方法获得正确质粒，命名为p1380-RfxCas13d。
其中在pNbU4-RfxCas13d-tHSP这一表达框中，pNbU4启动子为本实验室克隆并已验证具有高效外源基因表达效率的植物内源基因启动子，具体序列见专利文献(发明名称为一种异源蛋白表达的滚环复制重组载体构建方法及其应用，申请号202010156017.1)，同时，为了获得RfxCas13d蛋白的最佳表达效率，我们还对RfxCas13d的密码子偏好性进行了宿主(甘薯)优化，采用了双子叶植物，使得其表达效率达到了理论的最优值；
对于pAtU6-gRNA-Poly T这一序列表达框，按照RfxCas13d的gRNA设计要求(挑选长度30bp，GC40％-60％左右的核酸序列作为靶标，对应短重复序列(DR)的序列为：CAAGTAAACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTGAAAC)针对RNase3的序列进行了优化设计，，对上述克隆获得的RNase3的核酸序列进行分析，并选取潜在的合适切割位点，使其设计的特异性序列分别靶向靶标RNase3的各个核心区域，使得由gRNA介导的沉默效应具有较好的特异性及沉默效率，对应的gRNA结构及引导序列如下:
caagtaaacccctaccaactggtcggggtttgaaactagaatccaatctatgacgacttccgaa gacaagtaaacccctaccaactggtcggggtttgaaacaccagattgaaaaatcttcataaaatcttg caagtaaacccctaccaactggtcggggtttgaaac，如SEQ ID NO:2
将完成组装的2个DNA片段pNbU4-RfxCas13d-tHSP以及pAtU6-gRNA-Poly T利用同源重组的方式整合到预先酶切制备的植物表达载体pCambia1380中，通过大肠杆菌转化并利用菌落PCR筛选潜在阳性菌落并获得阳性质粒。具体构建方法为：将预先纯化获得的两个连接片段与酶切且纯化的线性化骨架载体pCambia1380使用诺为赞C113三片段同源重组试剂盒进行连接。将获得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选抗性为卡那霉素(Kan)，终浓度为50mg/L。将平板倒置放置于37℃恒温培养箱中，培养8-10h后挑选单菌落进行PCR检测，对应核酸Marker挑选正确长度的阳性克隆。将PCR检测正确的单克隆菌液吸取到包含2ml LB液体培养基(50mg/L Kan)的离心管中，放入37℃摇床中培养12小时，转速为200rpm。将浑浊的菌液吸取100μL送至南京擎科生物科技公司进行测序，将测序结果和参考序列比对，并对序列正确的质粒再次进行酶切验证。
实施例2利用化学转化法转化农杆菌感受态EHA105并侵染已经预先制备获得的甘薯徐薯29胚性愈伤。
EHA105农杆菌感受态转化具体操作如下：
取-80℃冷冻保存的农杆菌感受态进行冰浴；
在感受态细胞融化后分装成每管33μL，每33μL感受态加入0.1μg质粒DNA，用枪头轻柔吹吸以混匀感受态与质粒DNA；
将步骤②的样品依次进行以下操作：冰浴5min、液氮急冻5min、37℃孵育5min、冰浴5min；
加入600μL的无菌无抗的LB液体，28℃恒温摇床220rmp孵育3h；
6000rpm离心2min，留取50μL菌液，用枪头吹打菌斑和菌液，涂布于含有50mg/mLKan和20mg/mL Rif的YEB固体平板。置于28℃培养箱培养60h。将获得的对应农杆菌单菌落使用YEB培养基小摇并扩繁
完成侵染后，将筛选获得的阳性愈伤(R:HYG)放置于分化培养基上进行诱导分化，其操作的具体流程为：
选取健康甘薯植株，消毒后，剥离茎尖，诱导产生胚性愈伤组织。扩繁后，制备成甘薯胚性悬浮细胞团。选取继代培养后的胚性细胞团作为遗传转化受体。悬浮于制备好的根癌农杆菌菌液中，黑暗环境培养3d后，转移至含有Hyg，Carb和2，4-D的固体培养基进行选择培养。将存活且成熟的体细胞胚转移至M S固体培养基，诱导生成完整的再生转基因植株
对组培再生的甘薯幼苗取下部分组织样本进行DNA提取，并对获得的各个株系DNA使用转化检测引物进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的转基因甘薯进行炼苗并转移至基质中培养，一段时间提取RNA进行反转录，利用qRT-PCR引物对不同阳性株系的RfxCas13d相对表达水平进行鉴定，从中各筛选出三棵表达水平较为一致的转基因甘薯进行保种和扩繁并用于后续试验。
实施例3:利用自然传播法(虫媒)验证转化对照甘薯NT及靶向RNase3的RfxCas13d转化甘薯对于SPVD病毒病的抗性
将带有目的基因根癌农杆菌菌液接种培养于含有Kan和Rif的LB液体培养基中。离心后重悬于含2，4-D的MS液体培养基中，备用。
选取健康甘薯植株，消毒后，剥离茎尖，诱导产生胚性愈伤组织。扩繁后，制备成甘薯胚性悬浮细胞团。选取继代培养后的胚性细胞团作为遗传转化受体。悬浮于制备好的根癌农杆菌菌液中，黑暗环境培养3d后，转移至含有Hyg，Carb和2，4-D的固体培养基进行选择培养。将存活且成熟的体细胞胚转移至MS固体培养基，诱导生成完整的再生转基因植株。
对组培再生的甘薯幼苗取下部分组织样本进行DNA提取，并对获得的各个株系DNA使用转化检测引物进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的转基因甘薯进行炼苗并转移至基质中培养，一段时间提取RNA进行反转录，利用qRT-PCR引物对不同阳性株系的RfxCas13d相对表达水平进行鉴定，从中各筛选出三棵表达水平较为一致的转基因甘薯进行保种和扩繁并用于后续试验。
按照甘薯愈伤细胞的转化流程将上述农杆菌菌液分别侵染徐薯29的愈伤细胞，并按照筛选流程及阳性愈伤再生流程等进行操作。现阶段我们已经获得了鉴定为阳性的1380-NLS RfxCas13d-EV(NT)、1380-NLS RfxCas13d-pre gRNA RNase3(S2)转基因甘薯植株，利用PCR技术对上述转基因甘薯的DNA进行鉴定，分别各获得4株阳性植株。将上述转基因甘薯阳性植株炼苗后，分别转移至基质中进行扩繁增殖。培养一段时间后，提取样本RNA并进行qRT-PCR鉴定，从中选取RfxCas13d mRNA表达水平较为一致的3棵独立株系进行后续实验。实验结果表明转化1380-NLS RfxCas13d-EV、1380-NLS RfxCas13d-pre gRNA RNase3的转基因甘薯的RfxCas13d mRNA表达水平大约为IbUBI的15％。如图3所示，其中，A.利用农杆菌侵染甘薯愈伤并诱导分化；B.转化后的转基因甘薯NT、L1的表型；C.利用PCR对转基因甘薯进行分子检测；D.利用qRT-PCR对转基因甘薯的RfxCas13d进行分子检测；E.利用WB技术对转基因甘薯的RfxCas13d的蛋白积累水平进行检测。
实施例4:利用虫媒传播方式验证转化对照甘薯NT及靶向RNase3的RfxCas13d转化甘薯对于SPVD病毒病的抗性
对从徐州附近甘薯田地采集的明显带有SPVD症状的甘薯植株提取RNA及DNA,分别对待测样本进行鉴定。将筛选获得的仅感染SPVD 2种病毒(SPFMV/SPCSV)的带毒植株保留扩繁，并用于后续试验。将仅感染SPVD 2种病毒的带病甘薯及转基因阳性植株S1、S2、及徐薯29脱毒苗植株共同种植在有虫媒(蚜虫、烟粉虱)传播的密闭空间中，对虫媒不进行控制，利用虫媒自然侵染传播的方式对上述转基因甘薯及野生型甘薯进行病毒侵染及传播，一段时间后(60d)对上述材料中的病毒含量进行定量检测并分析转基因植株的SPVD抗性，该实验生物学重复为6组。
将带毒甘薯及转基因甘薯采用混种进行借助虫媒自然侵染的方法进行SPVD抗性验证，实验结果表明，在混种一段时间后(90天)，野生型徐薯29叶片出现轻微黄化，转基因甘薯的叶片并未出现明显的表型变化，利用qRT-PCR技术对上述三种植株的病毒积累水平进行鉴定，实验结果表明，野生型徐薯29细胞内的2种病毒(SPFMV/SPCSV)的相对表达水平较高，而转基因Rfx-pre-RNase3甘薯的叶片细胞内的SPFMV、SPCSV的病毒相对表达水平极低，远远低于野生型徐薯29的病毒积累水平。我们在温室环境下利用相同的方法对遗传转化质粒RfxCas13d-EV(NT)、RfxCas13d-Pre-RNase3的转基因对于SPVD的抗性进行了鉴定，实验结果表明，混种一段时间后(60d),RfxCas13d-EV(NT)、RfxCas13d-Pre-RNase3转基因甘薯叶片细胞内的病毒含量发生了显著的改变，其中，RfxCas13d-EV(NT)转基因甘薯叶片细胞内的SPFMV-CP、SPCSV-RNase3的表达水平要显著高于RfxCas13d-Pre-RNase3转基因甘薯。如图4，其中，A.筛选及检测严重感染SPVD病毒病的甘薯作为毒源进行后续嫁接；B.对嫁接后的NT及靶向RNase3 RrxCas13d的2种转基因甘薯进行病毒分子检测。
实施例5利用嫁接法验证转基因甘薯NT及靶向RNase3的RfxCas13d转化甘薯对于SPVD病毒病的抗性
对获得的仅感染SPVD病毒的带病甘薯长期保种(90天)直至该保种材料的单一植株生长扩繁至具有多条较为粗壮的藤蔓后用于嫁接验证实验：将该带病材料作为砧木进行嫁接，分别在其藤蔓的上下使用插接法嫁接转化1380-NLS RfxCas13d-EV、1380-NLSRfxCas13d-pre gRNA RNase3质粒的转基因甘薯植株。为了保证嫁接位置不影响病毒积累水平的变化，每棵砧木材料仅嫁接2种实验材料并轮换交替嫁接位置已保证去除实验干扰，嫁接14、21天后分别记录表型变化并采样进行qRT-PCR来计算上述嫁接材料中的SPVD(SPFMV/SPCSV)2种病毒的拷贝积累水平变化。该实验生物学重复为3棵。
使用嫁接法对两种转基因植株对于SPVD的抗性进行验证，将2种转基因植株仅保留顶芽的幼嫩茎端后按照插接法的嫁接方式分别作为接穗嵌入已预先切开的病毒苗砧木中，其中上述2种接穗分别在来源于同一毒源植株不同藤蔓的上下位置处，以轮替的形式进行嫁接。7-21天内，观察实验表型并取样进行病毒拷贝数鉴定。实验结果表明，嫁接侵染的第14天，两组实验处理材料形态上并没有发现差异，但是利用qRT-PCR技术对实验样本进行分析可知，转化靶向RNase3的RfxCas13a沉默载体的转基因甘薯植株NT细胞内仅能检测出微量的病毒拷贝，而转化无靶标RfxCas13d的转基因甘薯NT检测出明显的病毒积累。转化1380-NLS RfxCas13d-pre gRNA RNase3质粒的转基因甘薯植株获得了对于SPVD病毒病的抗性。如图5，其中，A.筛选及检测严重感染SPVD病毒病的甘薯作为毒源进行后续嫁接；B.对嫁接后的NT及靶向RNase3 RrxCas13d的2种转基因甘薯进行病毒分子检测。
序列表
<110> 江苏师范大学
<120> 一种具有SPVD抗性甘薯的育种方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 688
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgatgattc cgatcttttc tgatgtttct gaagaaagta aacttactat cttcggaagt 60
cgtcatagat tggattctat catacaatcc atttgtactt cagaagacag agacaaatat 120
gaaattttgg gtgattgggc tatcacaaca tacgttacta gtatgttgac tgatcttttt 180
aaacatgacg cagatgccga atctctgtct tacttcgtgc tcataatatt tcaaatttta 240
tgttcgcgaa agctatggtg gagtcaagat tttatgaaga tttttcaatc tggttgacgc 300
cgaccaattg cagttatgta gaatgacttt cggtggtggg aaaaatgttt atgaagttaa 360
tgttaaattc ttggctaact actttgagag agttgttggt tggttagtca taaatgatag 420
ttcggaaagt attaagaagt ttcttgattt gttcttgaag cctcttatgt ctttccgtat 480
taagaaacct gctcgttcta tccttcaaga atgggctgta aagaataaca agagacttga 540
catttatacg ggtgagtata atgtcaacaa tgtagtctat gtcctagtcg acggaaaaga 600
gatcagtcga gctaatgatt tgattagtaa gaaaagagca atctcaaagg cagtaatttt 660
tgctgtcgaa gctctaaatt tgaattga 688
<210> 2
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caagtaaacc cctaccaact ggtcggggtt tgaaactaga atccaatcta tgacgacttc 60
cgaagacaag taaaccccta ccaactggtc ggggtttgaa acaccagatt gaaaaatctt 120
cataaaatct tgcaagtaaa cccctaccaa ctggtcgggg tttgaaac 168

Claims (8)

1.一种具有SPVD抗性甘薯的育种方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）获得转基因甘薯的植物表达载体，采用在常规三元植物表达载体 pCambia1380中***RfxCas13d序列及对应靶向SPCSV-RNase3的靶标序列；
（2）将步骤（1）构建获得的载体通过化学法进行农杆菌菌株EHA105的转化；
（3）将步骤（2）转化获得的转基因阳性甘薯进行分选扩繁;
（4）对所获得的转基因甘薯的病毒抗性进行鉴定；
其中，所述常规三元植物表达载体 pCambia1380载体中已预先构建了表达HYG潮霉素的表达框用于对转基因阳性的植物进行筛选和转基因阳性鉴定;
所述的步骤（1）构建方法包含了2段不同的序列表达框；分别为使用pNbU4启动子驱动RfxCas13d蛋白基因表达，使用pAtU6启动子驱动靶向SPCSV-RNase3的Spacer表达；
其中，所述的pAtU6启动子驱动表达采用了优化的引导序列gRNA，所述的引导序列gRNA核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的具有SPVD抗性甘薯的育种方法，其特征在于，所述的构建方法采用了分段克隆的方式对植物表达载体 pCambia1380进行构建。
3.如权利要求2所述的具有SPVD抗性甘薯的育种方法，其特征在于，所述构建方法在于，先将pCambia1380载体分别使用HindIII/EcoRI;KpnI/BamHi限制性内切酶进行切开，后分别***包含有RfxCas13d的序列表达框及包含gRNA片段的表达框；所述的gRNA包含靶向SPCSV-RNase3基因的Spacer及Poly T的DNA片段；所述的gRNA片段的表达框使用pAtU6启动子驱动表达；最后利用同源重组的连接方式进行载体克隆连接以获得对应的用于遗传转化的甘薯表达载体。
4.如权利要求3所述的具有SPVD抗性甘薯的育种方法，其特征在于，所述的包含有RfxCas13d的序列表达框利用软件OptimumGene进行了密码子偏好性优化并进行对于核酸片段合成。
5.如权利要求4所述的具有SPVD抗性甘薯的育种方法，其特征在于，所述的偏好性优化采用双子叶植物。
6.如权利要求1所述的具有SPVD抗性甘薯的育种方法，所述步骤（2）包括如下步骤：
将步骤（1）构建完成的载体加入农杆菌EHA105感受态细胞中，经过冰浴、液氮冷冻、热激、摇菌和涂布平板的步骤，在28度培养箱培养48h，挑选PCR鉴定为阳性的单克隆菌落；使用YEB液体培养基进行过夜摇菌，将获得的浓度OD600=0.6的农杆菌菌液侵染已预先制备完成的甘薯愈伤细胞。
7.如权利要求1所述的具有SPVD抗性甘薯的育种方法，其特征在于，步骤（3）具体为：将步骤（2）转化获得的抗HYG胚性愈伤细胞转化至甘薯分化培养基MS后培养60天，并利用PCR鉴定法对获得的转基因甘薯植株进行抗性阳性鉴定；所述的抗HYG胚性愈伤细胞中HYG浓度为20mg/L。
8.如权利要求1所述的具有SPVD抗性甘薯的育种方法，其特征在于，所述步骤（4）采用虫媒传播及嫁接传播的方式进行抗性验，实验结果表明，和对照组相比，该种转基因甘薯可以有效抑制长期虫媒传播和短期嫁接后导致的病毒积累；所述的长期为90d;所述的短期为15d；所述的病毒为SPFMV/SPCSV。
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