CN113249376A - 一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法及该方法的应用 - Google Patents
一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法及该方法的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分子生物学，尤其涉及一种基于CRISPR‑Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法及该方法的应用。所述方法包括：提取包含甜瓜线粒体基因组的甜瓜基因组核酸试样；将标记失活的Cas蛋白或其变体蛋白加入至缓冲液中，缓冲液中至少含有甜瓜线粒体保守基因的gRNA或其衍生物或sgRNA，混合孵育形成CRISPR‑Cas***组合物；将核酸试样与CRISPR‑Cas***组合物混合，于缓冲液中反应并利用包被有链霉亲和素的磁珠对蛋白‑RNA‑DNA复合物进行捕获，形成磁珠‑蛋白‑RNA‑DNA复合物，磁吸分离得到磁珠‑蛋白‑RNA‑DNA复合物，即实现对甜瓜线粒体基因组的捕获。本发明方法步骤简单，无酚‑氯仿刺激性气味污染，操作方便，根据基因序列捕获，特异性好，杜绝核基因组污染，所获得的线粒体基因组具有高纯度、低污染的特点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学或生物化学领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，以及该方法的应用。
背景技术
葫芦科作物线粒体是目前已知植物线粒体基因组中最大、最复杂的。基于动力学再结合率测量的实验程序预测了甜瓜线粒体基因组2400kb，是植物中最大的一个，其大小与许多细菌的基因组相当。因此，如何实现对甜瓜线粒体基因组的测序，一直是本领域的难题。
高通量测序平台是基因组学领域中新兴的一种测序方法，其与传统方法相比，允许对整个基因组进行重新测序和重新测序，成本和时间大大减少。然而，到目前为止，只有少数几个质体基因组下一代测序的例子已经发表，没有植物线粒体基因组被这样测序，其直接用于线粒体基因组测序目前被认为存在极高的污染率。
目前提取线粒体是通过差速离心或梯度离心来完成。完整的细胞器经裂解后,通过 CsCl离心或酚-氯仿抽提获得DNA。在裂解细胞器之前用DNase清除非细胞器的DNA。, 再使线粒体发生裂解,释放出DNA、蛋白质等,经酚抽提后得到线粒体DNA(mtDNA)。该方法步骤繁琐，而且不能得到百分百纯的线粒体DNA,会有核基因组DNA污染残留，导致后续测序数据污染，难以实现后面数据分析任务。
如CN106520830B、利用CRISPR/Cas9对线粒体基因组进行靶向编辑的方法所公开的技术方案中，实际公开了利用CRISPR-Cas技术对植物线粒体基因组进行捕获分离的方法，但是其实际捕获分离过程仍存在较大的污染，无法实现低污染分离线粒体基因组的目的。
发明内容
为解决现有的植物线粒体基因组分离捕获方法过程繁琐、核基因组残留污染较大，并且针对甜瓜这种极大的线粒体基因组分离并未有特定的方法等问题，本发明提供了一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，以及该方法的应用。
本发明的目的在于：
一、能够实现特异性捕获甜瓜线粒体基因组；
二、能够完整获得甜瓜线粒体的基因组；
三、能够有效减少核基因污染；
四、能够有效用于甜瓜线粒体基因组的构建。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，
所述方法包括：
1)提取甜瓜基因，获得包含甜瓜线粒体基因组的甜瓜基因组核酸试样；
2)将标记且催化失活的Cas蛋白或其变体蛋白加入至缓冲液中，缓冲液中至少含有甜瓜线粒体保守基因的gRNA或其衍生物或sgRNA，混合孵育形成CRISPR-Cas***组合物；
3)将步骤1)所制得试样与步骤2)所制得的CRISPR-Cas***组合物混合，于缓冲液中反应得到蛋白-RNA-DNA复合物，利用包被有链霉亲和素的磁珠对蛋白-RNA-DNA复合物进行捕获，形成磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物，磁吸分离得到磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物，即实现对甜瓜线粒体基因组的捕获。
在本发明技术方案中，利用CRISPR-Cas技术原理设计对应的甜瓜线粒体基因组探针，结合并高效特异性捕获甜瓜线粒体基因组，能够得到纯的线粒体DNA，方便下游高通量测序数据纯净无核基因组DNA污染，从而实现数据分析得到完整的甜瓜线粒体基因组。
本发明所述线粒体保守基因为ATP9或Cob基因，Cob基因序列如SEQ ID NO.1所示，ATP9基因序列如SEQ ID NO.2所示。线粒体ADP/ATP载体参与线粒体中的ADP和ATP转运。磷酸腺苷核苷酸水平，包括通用能量载体腺苷5′-三磷酸盐(ATP)及其代谢物腺苷 5′-二磷酸盐(ADP)和腺苷5′-单磷酸盐(AMP)，定义活细胞中的能量状态，主要依赖线粒体功能。而ATP9合成该蛋白质是线粒体ATPase非酶膜组件(F0)的链条之一。COBRA (COB)基因编码一个通过C端与葡萄糖基磷酸肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)连接到质膜细胞外空间的蛋白，偏向在迅速延伸的根细胞纵向轴侧表达，在迅速延伸区的起始区表达急剧上调。该基因的缺失也会导致细胞延伸的无向。因此选用上述基因作为线粒体保守基因能够确保准确实现特异性提取。CRSIPR-Cas***包括两个及以上gRNA 或其衍生物、以及带有生物素标记的核酸内切酶活力缺失的Cas蛋白或其变体蛋白。gRNA或其衍生物的序列与甜瓜线粒体保守基因ATP9或Cob基因序列互补，借此引导核酸内切酶活力缺失的Cas蛋白或其变体结合在线粒体基因组DNA上，再通过加入包被有链霉亲和素的磁珠捕获CRISPR-Cas***和其结合的线粒体基因组DNA，以此达到捕获甜瓜线粒体基因组的目的。
上述方法能够特异性、高效地捕获完整的甜瓜线粒体基因组。
作为优选，
步骤1)所述提取甜瓜基因通过试剂盒进行；
所述提取过程采用新鲜或冷冻的组织样本，并且选用甜瓜的幼叶或须根或嫩枝组织，单次提取样本量≤200mg。
新鲜或冷冻的组织样本较为纯净，能够减少其他分子杂质或基因污染，并且选用幼叶或须根或嫩枝组织，其所含线粒体基因组更多，有利于捕获的进行。此外，由于植物的水分和多糖含量的差异巨大，控制样本量也有利于减少污染。
作为优选，
步骤2)所述gRNA为crRNA或tracrRNA。
作为优选，
步骤2)的孵育过程为：
将标记且催化失活的Cas蛋白或其变体与gRNA混合，于25±1℃条件下孵育，Cas蛋白或其变体与gRNA的摩尔比为1:(0.95～1.05)。
作为优选，
步骤2)所述甜瓜线粒体保守基因为Cob基因组；
所述Cob基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
经试验分析测试，结果表明上述的Cob基因序列用于甜瓜线粒体的捕获时，能够获得污染最低、纯度最高的线粒体基因组。
作为优选，
步骤3)中，CRISPR-Cas***组合物与试样混合时，CRISPR-Cas***组合物与试样的体积比为3:(9～11)；
混合后置于PCR仪中于30±1℃条件下反应55～65min。
作为优选，
步骤3)还包括：
所述磁吸分离后，利用转座酶打断磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物，依次进行末端修复、加A尾和连接接头，随后进行PCR扩增。
进行末端修复、加A尾和连接接头能够有效减小核基因组的污染，进行PCR扩增能够有效减小后续数据分析处理的绝对误差，提高测序精度。
作为优选，
步骤3)所述PCR扩增后还包括磁吸分选；
所述磁吸分选包括：
将DNA清洁珠加入PCR产物中混匀孵育，分离得到上清液，向上清液中再加入清洁的DNA清洁珠，混匀孵育后分离去除上清得到吸附有甜瓜线粒体基因组的磁珠，利用乙醇溶液对磁珠进行漂洗，去除漂洗液后依次进行干燥和洗脱，洗脱后静置至溶液澄清，分离溶液中的上清部分即得到分选纯化后的甜瓜线粒体基因组。
磁吸分选能够进一步纯化甜瓜线粒体基因组，减少核基因组的污染。并且上述的分选方式能够非常有效地去除杂质和污染基因组，提高后续甜瓜线粒体的测序精度，同时避免甜瓜线粒体基因组受损，保障甜瓜线粒体基因组的高完整度。
一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的应用，
所述方法用于甜瓜线粒体基因组的构建。
本发明的有益效果是：方法步骤简单，无酚-氯仿刺激性气味污染，操作方便，根据基因序列捕获，特异性好，杜绝核基因组污染，所获得的线粒体基因组具有高纯度、低污染的特点。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例所用原料均为市售或本领域技术人员可获得的原料；如无特殊说明，本发明实施例所用方法均为本领域技术人员所掌握的方法。
实施例
一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，
所述方法包括：
1)提取甜瓜基因，获得包含甜瓜线粒体基因组的甜瓜基因组核酸试样，具体过程为：
1-1)研杵、研钵、药匙用牛皮纸包好，高压灭菌后烘箱干燥，取甜瓜根中的须根部分放入预冷好的研钵中，用液氮研磨成干粉，
1-2)将研磨好的组织干粉转移到无核酸酶的1.5mL微离心管中。
1-3)加入600μLP1缓冲液，旋涡充分混合，确保涡旋分散所有团块组织。
1-4)在65℃水浴锅中孵育10分钟，在孵育过程中，上下颠倒将样品混合两次。
1-5)添加140μL的P2缓冲液，随即漩涡使之充分混合。
1-6)在10,000xg下离心10分钟。
1-7)将离心后得到的上清液转移至新的1.5ml离心管中，并记录所取上清液体积。
1-8)在上清液离心管中添加0.7倍100％异丙醇，漩涡并沉淀DNA。
1-9)立即14000xg离心2分钟，将DNA收集。
1-10)仔细吸出上清或脱色，并丢弃上清液，该过程避免打散DNA。
1-11)将离心管倒置在纸巾上1分钟，使残留的液体排出，可不干燥DNA沉淀。
1-12)加入300μl无菌去离子水加热至65℃，每5分钟涡旋重新一次悬浮DNA沉淀，总计进行30min的孵育。
1-13)加入4μLRNaseA，涡旋充分混合。
1-14)加入150μLP3缓冲液和300μL100％乙醇。涡旋立即获得均匀混合物，通过移液器枪头对沉淀吹打10-15次。
1-15)将一个
DNA吸附柱***一个2mL收集管。
1-16)将整个样品，包括可能形成的任何沉淀转移到
DNA吸附柱中。
1-17)在10,000xg下离心1分钟。
1-18)丢弃滤液和2mL收集管。
1-19)将
DNA吸附柱转移到一个新的2mL收集管中。
1-20)加入650μLDNA洗涤缓冲液，所述DNA洗涤缓冲液用100％乙醇稀释至1X。
1-21)在10,000xg下离心1分钟。
1-22)弃滤液，回用收集管。
1-23)重复步骤1-20～1-22进行第二次DNA洗涤缓冲液洗涤步骤。
1-24)将空的
DNA吸附柱在10000xg下离心2分钟，使过滤柱干燥，去除乙醇。
1-25)将
DNA吸附柱转移到一个新的1.5mL微离心管中。
1-26)加入加热至65℃的50-100μLElutionbuffer。
1-27)使之在室温下静置3-5分钟。
1-28)在10,000xg下离心1分钟，完成包含有甜瓜线粒体基因的完整基因组的提取，获得包含甜瓜线粒体基因组的甜瓜基因组核酸试样。
1-29)将包含甜瓜线粒体基因组的甜瓜基因组核酸试样储存在-20℃条件下备用。
对原始获得的试样进行预检测和编号，编号对应下述所用的sgRNA。
Qubit检测数据表。
| 试样编号 | 浓度ng/ul |
| MR3(CK) | 39.4 |
| MR3-cob-CAS9 | 45.8 |
| MR3-ATP9-CAS9 | 60.2 |
| MR3-cob444 | 37.9 |
2)将标记且催化失活的Cas蛋白或其变体蛋白加入至缓冲液中，本实施例Cas蛋白或其变体蛋白采用Sigma-Aldrich的dCas9-3*FLAGTM-Biotin蛋白(货号：DCAS9PROT)，dCas9-3xFLAG-Biotin是一种重组的催化失活Cas9(dCas9)蛋白，所述dCas9蛋白携带D10A和H840A突变，在不损害目标DNA结合的情况下使核酸酶结构域失活，仅能至多切割靶DNA双链中的一条链，使得CRISPR-Cas***组合物保持结合靶DNA的能力，该蛋白来源于II-A型化脓性链球菌Cas9，在大肠杆菌中表达。并且该Cas蛋白，其蛋白N端或 C端带有生物素受体肽段标签(BAP)，如AviTag标签，以便进行生物素化标记。AviTag标签蛋白是含15个氨基酸的短肽(GLNDIFEAQKIEWHE)，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。与目标蛋白融合表达后，可被生物素连接酶将该标签短肽生物素化，从而实现生物素标记目标蛋白。在C端，该蛋白被标记为SV40大T抗原核定位信号(NLS)、3xFLAG表位和生物素，用于基于ANTI-FLAG-或基于链霉亲和素的捕获和分子检测。因此，该dCas9蛋白可用于多种应用，包括靶向DNA分离和检测。
缓冲液中至少含有甜瓜线粒体保守基因的gRNA或其衍生物或sgRNA，混合孵育形成CRISPR-Cas***组合物，具体过程为：
2-1)用重建溶液重悬冻干的dCas9蛋白，采用250ug小瓶，每小瓶添加50uL重建溶液，保持约5mg/mL(25pmol/uL)的浓度。
2-2)轻轻敲打试管以完全溶解冻干的粉末，在冰上孵育10分钟，然后短暂旋转试管以使物料到达试管底部。
2-3)通过sgRNA设计网站进行引物设计，获得以下引物：
| 名称 | 序列(5'to3') | 碱基数 | 编号 |
| ATP9 | AATGTGGTTCCTCTACACCT | 20 | SEQ ID NO.3 |
| Cob | ATATTATGACCGCCTCAATG | 20 | SEQ ID NO.4 |
| Cob444 | CCAGGGGTCTCACGCGCGTG | 20 | SEQ ID NO.5 |
2-4)ATP9sgRNA干粉瞬时离心后，加入15ul无菌水或10mMTris缓冲液(pH为7～8)，涡旋震荡，瞬时离心后得到100uM浓度溶液，取5ul100uM溶液至新1.5ml离心管，加入20ul无菌水或10mMTris缓冲液(pH在7至8之间)，涡旋震荡，瞬时离心后得到20uM浓度溶液(使用浓度)，得到ATP9sgRNA溶液，CobsgRNA干粉和Cob444 RNA干粉进行与ATP9sgRNA干粉相同的操作，分别得到CobsgRNA溶液和Cob444sgRNA 溶液。
2-5)在装有3ul20uMATPsgRNA的PCR管中加入2.4ul25pmol的dCas9蛋白，轻轻地上下吸移混合，在室温下孵育10分钟以形成复合物，标记为CRISPR-Cas-ATP；
在装有3ul20uMCobsgRNA的PCR管中加入2.4ul25pmol的dCas9蛋白，轻轻地上下吸移混合，在室温下孵育10分钟以形成复合物，标记为CRISPR-Cas-cob；
在装有3ul20uMCob444sgRNA的PCR管中加入2.4ul25pmol的dCas9蛋白，轻轻地上下吸移混合，在室温下孵育10分钟以形成复合物，标记为CRISPR-cob444；
即完成CRISPR-Cas***组合物的孵育制备。
3)将步骤1)所制得试样与步骤2)所制得的CRISPR-Cas***组合物混合，于缓冲液中反应得到蛋白-RNA-DNA复合物，利用包被有链霉亲和素的磁珠对蛋白-RNA-DNA复合物进行捕获，形成磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物，磁吸分离得到磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物，即实现对甜瓜线粒体基因组的捕获，具体过程如下：
向步骤2-5)所制得的各个中CRISPR-Cas***组合物分别加入链霉亲和素磁珠50ul 吸打混匀后于室温反应15min，随即放入磁力架静置5min，去上清，80％无水乙醇洗两次，待磁珠干燥，加20ul无菌水洗脱，即得到捕获的甜瓜线粒体DNA。
对上述步骤3)所获得的甜瓜线粒体DNA进行检测，使用Qubit进行浓度测定。
| 名称 | 浓度ng/ul |
| MR3(空白对照组，标记CK) | 39.4 |
| MR3-cob-CAS9 | 1.46 |
| MR3-ATP9-CAS9 | 1.3 |
| MR3-cob444 | 0.658 |
4)利用转座酶打断磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物，依次进行末端修复、加A尾和连接接头，随后进行PCR扩增，PCR扩增后磁吸分选，具体过程为：
4-1)取5×TTBL，上下颠倒混匀后备用。
4-2)在灭菌PCR管中配制如下反应体系：
| 组分 | 用量 |
| 5×TTBL | 4μl |
| 步骤3)所获得的DNA | 5ng |
| TTEMixV5 | 5μl |
| ddH2O | To20μl |
4-3)使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
4-4)将反应管置于PCR仪中，运行如下反应程序：
| 温度 | 程序/时间 |
| 105℃ | 热盖 |
| 55℃ | 10min |
| 10℃ | Hold |
4-5)反应完成后立即向产物中加入5μl5×TS，使用移液器轻轻吹打充分混匀，置于室温放置5min。
4-6)将PCR管置于冰上，配制如下反应体系：
4-7)使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管置于PCR仪中，运行如下反应程序：
4-8)涡旋振荡混匀VAHTSDNA清洁珠并吸取R1体积至50μl步骤4-7)所得的PCR 产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min，将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(5min)小心转移上清至新的灭菌 PCR管中，丢弃磁珠，涡旋振荡混匀VAHTSDNA清洁珠并吸取R2体积至上清中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min，将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心移除上清；
4-9)保持反应管始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠室温孵育30sec，小心移除上清，重复该步骤两次；
4-10)保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠约5min，将反应管从磁力架上取出，加入22μl灭菌超纯水洗脱，涡旋振荡或使用移液器吹打10次，充分混匀，室温孵育5min，将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心
吸取20μl上清至新的灭菌PCR管中，即完成甜瓜线粒体基因组的磁吸分选，分选后的甜瓜线粒体基因组于-20℃条件下保存。
测试
对上述步骤4-10)所得的甜瓜线粒体基因组进行Qubit检测，检测结果如下表所示。
| 试验组标记编号 | 浓度ng/ul |
| MR3(CK) | 12.98 |
| MR3-cob-CAS9 | 7.98 |
| MR3-ATP9-CAS9 | 7.96 |
| MR3-cob444 | 6.52 |
对比上表与步骤1-29)Qubit检测表，可以明显看出采用特异性的sgRNA能够有效实现对基因组进行特异性的捕获，并且相较而言，CobsgRNA具有更有的特异性捕获效果。
利用Agilent2100生物分析仪进行分析,并根据甜瓜线粒体文库数据上机测序后数据分析后得出如下表结果。
| 试验组标记编号 | 总序列 | 比对宿主基因组序列 | 比对率 |
| MR3(CK) | 28918122 | 27951441 | 0.966571792 |
| MR3-cob-CAS9 | 11724476 | 9455789 | 0.806499924 |
| MR3-ATP9-CAS9 | 11177784 | 6983667 | 0.624780994 |
| MR3-cob444 | 40047376 | 12321052 | 0.307661905 |
上表数据可以明显看出，Cob基因是比较适合的一个基因编辑靶点，并且Cob444sgRNA具有非常好的特异性，能够降低污染率到31％左右，而没有处理的对照组有97％的宿主污染。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，其特征在于，
所述方法包括：
1)提取甜瓜基因，获得包含甜瓜线粒体基因组的甜瓜基因组核酸试样；
2)将标记且催化失活的Cas蛋白或其变体蛋白加入至缓冲液中，缓冲液中至少含有甜瓜线粒体保守基因的gRNA或其衍生物或sgRNA，混合孵育形成CRISPR-Cas***组合物；
3)将步骤1)所制得试样与步骤2)所制得的CRISPR-Cas***组合物混合，于缓冲液中反应得到蛋白-RNA-DNA复合物，利用包被有链霉亲和素的磁珠对蛋白-RNA-DNA复合物进行捕获，形成磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物，磁吸分离得到磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物，即实现对甜瓜线粒体基因组的捕获。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，其特征在于，步骤1)所述提取甜瓜基因通过试剂盒进行；
所述提取过程采用新鲜或冷冻的组织样本，并且选用甜瓜的幼叶或须根或嫩枝组织，单次提取样本量≤200mg。
3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，其特征在于，步骤2)所述gRNA为crRNA或tracrRNA。
4.根据权利要求1或3所述的一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，其特征在于，步骤2)的孵育过程为：
将标记且催化失活的Cas蛋白或其变体与gRNA混合，于25±1℃条件下孵育，Cas蛋白或其变体与gRNA的摩尔比为1:(0.95～1.05)。
5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，其特征在于，步骤2)所述甜瓜线粒体保守基因为Cob基因组；
所述Cob基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，其特征在于，步骤3)中，CRISPR-Cas***组合物与试样混合时，CRISPR-Cas***组合物与试样的体积比为3:(9～11)；
混合后置于PCR仪中于30±1℃条件下反应55～65min。
7.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，其特征在于，步骤3)还包括：
所述磁吸分离后，利用转座酶打断磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物，依次进行末端修复、加A尾和连接接头，随后进行PCR扩增。
8.根据权利要求7所述的一种基于CRISPR-Cas捕获甜瓜线粒体基因组的方法，其特征在于，步骤3)所述PCR扩增后还包括磁吸分选；
所述磁吸分选包括：
将DNA清洁珠加入PCR产物中混匀孵育，分离得到上清液，向上清液中再加入清洁的DNA清洁珠，混匀孵育后分离去除上清得到吸附有甜瓜线粒体基因组的磁珠，利用乙醇溶液对磁珠进行漂洗，去除漂洗液后依次进行干燥和洗脱，洗脱后静置至溶液澄清，分离溶液中的上清部分即得到分选纯化后的甜瓜线粒体基因组。
9.一种如权利要求1至8任意一项所述方法的应用，其特征在于，
所述方法用于甜瓜线粒体基因组的构建。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210813 |