CN113244233A

CN113244233A - 荜茇酰胺在制备角膜移植免疫排斥反应防治药物中的应用

Info

Publication number: CN113244233A
Application number: CN202110698767.6A
Authority: CN
Inventors: 范祥雨; 张婧; 徐建江
Original assignee: Eye and ENT Hospital of Fudan University
Current assignee: Eye and ENT Hospital of Fudan University
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2021-08-13

Abstract

本发明涉及荜茇酰胺在制备角膜移植免疫排斥反应防治药物中的应用。本发明通过研究证明天然化合物荜茇酰胺在移植排斥动物模型中，可有效缓解角膜移植免疫排斥反应，延长角膜植片生存时间，可能的机制包括抑制免疫细胞的生成和局部浸润，以及减少其相关炎症细胞因子的分泌。本发明证明了天然化合物荜茇酰胺治疗角膜移植术后免疫排斥反应的有效性，表明将其用作角膜移植术后抗排斥新药具有极大的发展潜力和研究价值。

Description

荜茇酰胺在制备角膜移植免疫排斥反应防治药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地说，涉及荜茇酰胺在制备角膜移植免疫排斥反应防治药物中的应用。

背景技术

角膜移植术是治疗终末期角膜疾病的常用方式，虽然成功率较其它器官移植高，但是术后排斥仍然是手术失败的主要原因。目前临床上应用于治疗角膜移植术后免疫排斥反应的药物主要包括糖皮质激素、环孢素和他克莫司等常规免疫制剂。

糖皮质激素：糖皮质激素是目前应用最广的抗排斥药物，但其对高危角膜移植患者疗效不佳，且长期使用副反应明显。

环孢素：环孢素全身用药能有效防治术后排斥反应的发生，但长期用药具有肾毒性、肝毒性、神经毒性，增加肿瘤和感染等严重并发症的发生率；环孢素脂溶性高，相对分子质量大，角膜渗透性差，因而其局部用药的有效性依旧存在争议，且其长期局部用药可发生角膜上皮病变和眼睑皮肤浸渍。

他克莫司：他克莫司全身用药不良反应较环孢素少，主要有肾毒性、神经毒性和高血压等；其局部用药渗透性较环孢素好，但仍存在眼表刺激症状。

荜茇酰胺(piperlongumine，PL)是一类从长柄胡椒的根中提取的小分子生物碱类化合物，分子式为C₁₇H₁₉NO₅，分子量为317.34，具有顺式和反式两种异构体，其中反式荜茇酰胺是荜茇酰胺在自然界存在的主要形式，也是其活性形式。结构式如下：

近年来相关研究发现，荜茇酰胺具有抗肿瘤、抗炎、抗血管生成、抗血小板聚集、抗真菌、抗抑郁、抗糖尿病等多种药理活性，而对正常的细胞、组织、器官无明显的毒副作用。此外，专利文献CN107441087A还公开了其在治疗老年性痴呆中的应用，具体公开了一种具有治疗老年性痴呆作用的复方药物组合物，由质量比为1:10～1:500的荜茇酰胺和番茄红素组成；专利文献CN109260203A还公开了荜茇酰胺类化合物在治疗痛风性关节炎中的应用，具体公开了一种包含以下质量百分比的组合物：荜茇宁酰胺(1.2～8.5％)，胡椒碱(5.0～45％)、胡椒诺宁碱(3～12.5％)、十八碳三烯酰胺(3.5～14.5％)、二十碳三烯酰胺(5.0～25％)，其中荜茇酰胺类化合物占荜茇酰胺类总部位的60％以上，以及该组合物在制备抗痛风性关节炎药物中的应用。

然而，目前尚未发现利用荜茇酰胺治疗角膜移植免疫排斥反应的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供荜茇酰胺或其药学上可接受的盐的新制药用途。

本发明采取的技术方案如下：

荜茇酰胺或其药学上可接受的盐在制备角膜移植免疫排斥反应防治药物中的应用。

作为本发明的一种具体实施方案，所述药学上可接受的盐是其有机酸盐或无机酸盐。

可选地，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸；所述有机酸为乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸或草酸。

作为本发明的另一种具体实施方案，所述药物的剂型为注射剂或口服剂型。

可选地，所述注射剂通过静脉注射、动脉注射、肌肉注射或腹腔注射的方式给药。

可选地，所述口服剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或合剂。

作为本发明的另一种具体实施方案，所述药物包含药学上可接受的载体。

可选地，所述药学上可接受的载体选自稀释剂、防腐剂、填充剂、流动调控剂、促渗透剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、增甜剂、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂。

作为本发明的另一种具体实施方案，所述药物还包含其他任一种或几种防治角膜移植免疫排斥反应的活性成分。

可选地，所述活性成分为糖皮质激素、环孢素或他克莫司。

本发明优点在于：

本发明通过研究证明天然化合物荜茇酰胺在移植排斥动物模型中，可有效缓解角膜移植免疫排斥反应，延长角膜植片生存时间，可能的机制包括抑制免疫细胞的生成和局部浸润，以及减少其相关炎症细胞因子的分泌。本发明证明了天然化合物荜茇酰胺治疗角膜移植术后免疫排斥反应的有效性，表明将其用作角膜移植术后抗排斥新药具有极大的发展潜力和研究价值。

附图说明

图1为角膜移植术后各组小鼠的同种异体免疫排斥反应临床症状和病理学改变的评估。

图2为角膜移植术后各组小鼠引流***中CD4⁺ T细胞和巨噬细胞的流式图。

图3为角膜移植术后各组小鼠角膜植片中CD4⁺ T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的免疫组织化学染色结果。

图4为各组小鼠的角膜植片中炎症细胞因子的mRNA水平检测结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1、分析荜茇酰胺对角膜移植同种异体免疫排斥反应的影响

1)小鼠角膜移植模型的建立：

以6-8周的雄性C57BL/6小鼠为角膜供体，随机取4-6周的雄性BALB/c小鼠为受体，行穿透性角膜移植手术(penetrating keratoplasty,PKP)。具体方法如下：采用4％水合氯醛腹腔注射麻醉(10mL/kg)，术前10min用盐酸奥布卡因滴眼液行眼表麻醉，复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，用眼科环钻取C57BL/6小鼠中央全层角膜，植片直径2mm，置于受体角膜植床上，植床直径1.5mm，用11-0缝线行间断缝合8针，术后注入粘弹剂恢复前房。术毕，给移植眼结膜囊内涂妥布霉素沙星眼膏。术后一周内小鼠若出现前房感染、出血、消失，虹膜嵌顿等明显的并发症及死亡，则剔除后重新造模。由于已有研究证实小鼠角膜移植术后14天是评估同种异体免疫排斥反应的最佳时间点，我们于移植术后14天取材，获取小鼠的角膜及引流***组织(图1A)。

2)实验分组及治疗方案：

将小鼠分组，分别为环孢菌素A治疗组(CsA组)，PBS溶剂对照组(含有1％DMSO的PBS)，荜茇酰胺治疗组(PL组)。PL首先在无菌DMSO中溶解，然后在PBS中稀释至2mg/mL(DMSO终浓度<1％)。CsA在PBS中稀释至4mg/mL。将小鼠分组，分别为CsA组(20mg/kg/d)，PBS溶剂对照组，和PL组(10mg/kg/d)。从角膜移植术前三天开始至移植术后第14天，对三组小鼠每天行腹腔内注射药物及相同体积的赋形剂PBS溶液。

3)检测指标：

取上述各组小鼠的角膜组织，采用裂隙灯检查评估小鼠角膜移植同种异体免疫排斥反应的临床症状(角膜水肿混浊程度及新生血管长入情况)，从术后第一天开始，每隔一天观察一次，共持续30天，并绘制角膜植片Kaplan-Meier生存曲线。对术后第14天的移植物采用HE染色，观察角膜病理学改变。

4)实验结果：

我们发现在炎症反应最为明显的术后第14天，荜茇酰胺治疗后的小鼠的角膜植片的水肿混浊程度明显降低、新生血管生成减少、免疫细胞的浸润程度明显减轻，植片结构的完整性得到改善，植片生存时间显著延长(图1B,C)。

2、检测荜茇酰胺对免疫细胞生成和浸润的影响

1)检测荜茇酰胺治疗对小鼠体内免疫细胞生成的影响：

按上述分组，于术后14天取各组小鼠术眼侧颈部及颌下腺***，制备成单细胞悬液，通过流式细胞术检测小鼠外周免疫器官中CD4⁺T细胞和巨噬细胞的生成情况。细胞计数达到10⁷/ml后，将每组细胞平均分为2个部分并转入流式管。一部分加入抗小鼠CD45-APC-CY7(ebioscience)，抗小鼠CD3-AF700(ebioscience)和抗小鼠CD4-FITC(ebioscience)混匀；另一部分加入抗小鼠CD45-APC-CY7(ebioscience)，抗小鼠CD11B-APC(ebioscience)和抗小鼠F4/80-PE(ebioscience)混匀，4℃避光孵育30min，洗涤并重悬细胞后上流式细胞仪检测。

2)检测荜茇酰胺治疗对小鼠角膜植片免疫细胞局部浸润的影响：

依照上述实验分组，于术后14天取各组小鼠眼球，多聚甲醛固定、石蜡包埋后切片，采用免疫组化染色检测小鼠角膜组织CD4⁺ T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的浸润情况。

3)实验结果：

经过流式细胞学分析，我们发现经过环孢菌素A和荜茇酰胺治疗的小鼠***中CD4⁺ T细胞、巨噬细胞的细胞频率，与PBS溶剂对照组小鼠相比，可显著降低(图2)。与此同时，角膜植片的免疫组织化学染色结果显示，经过环孢菌素A和荜茇酰胺干预后，小鼠角膜植片中的CD4⁺ T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的浸润情况得到明显缓解(图3)。

(3)检测荜茇酰胺对各类炎症细胞因子的mRNA表达水平的影响

1)检测指标：

在角膜移植术后14天，分别取三组小鼠的角膜组织，将三组角膜组织分别放于1.5ml离心管中剪碎、研磨，采用Trizol法提取总mRNA，通过逆转录为cDNA后，对待检测样本行RT-qPCR检测包括IL-2、IFN-γ、IL-17、TNF-α、IL-1β和IL-1α在内的各类炎症细胞因子的mRNA表达水平。

2)实验结果：

移植术后14天，我们通过实时荧光定量PCR检测了三个组之间包括IL-2、IFN-γ、IL-17、TNF-α、IL-1β和IL-1α在内的各类炎症细胞因子的表达情况。我们发现，与PBS溶剂对照组小鼠相比，经过环孢菌素A和荜茇酰胺治疗的小鼠的炎症细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05，图4A-E)。而对于巨噬细胞分泌的IL-1家族的另一重要促炎细胞因子IL-1α，PL组与PBS组相比差异并不明显，无统计学意义(P>0.05，图4F)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.荜茇酰胺或其药学上可接受的盐在制备角膜移植免疫排斥反应防治药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐是其有机酸盐或无机酸盐。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸；所述有机酸为乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸或草酸。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂或口服剂型。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述注射剂通过静脉注射、动脉注射、肌肉注射或腹腔注射的方式给药。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述口服剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或合剂。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包含药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自稀释剂、防腐剂、填充剂、流动调控剂、促渗透剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、增甜剂、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包含其他任一种或几种防治角膜移植免疫排斥反应的活性成分。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述活性成分为糖皮质激素、环孢素或他克莫司。