CN113234852A - 一种鉴定小麦白粉病抗性的分子标记、引物组及应用 - Google Patents

一种鉴定小麦白粉病抗性的分子标记、引物组及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定小麦白粉病抗性的分子标记、引物组及应用。所述分子标记是利用抗白粉病基因位点QPm.saas‑4AS两翼SNP探针AX‑110406692和AX‑109926787开发两对KASP特异连锁标记，所述连锁标记为KASP‑AX‑110406692的KASP标记和KASP‑AX‑109926787的KASP标记。本发明提供的鉴定小麦白粉病抗性的分子标记、引物组及应用，开发出可用于小麦白粉病抗性辅助选择的分子标记，可以快速筛选含有该基因的高抗白粉病的小麦品种或品系用于小麦的抗病育种利用，获得含有小麦白粉病抗性基因的小麦品种，不仅节约了生产成本而且大大提高了具有白粉病抗性小麦材料的选择效率，极大地缩短小麦抗病品种的选育周期；且其检测方便快速，不受环境影响。

Description

一种鉴定小麦白粉病抗性的分子标记、引物组及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴定小麦白粉病抗性的分子标记、引物组及应用。
背景技术
小麦白粉病是由禾本科布氏白粉菌引起、发生在小麦上的病害。主要为害叶片，严重时叶鞘、茎秆、穗部均会受到侵染。发病初期病部可见黄色小点，随着病情加重病点逐渐发展为病斑，呈椭圆形或圆形，表面有一层白粉状霉层，发展至中期呈白灰色，后期呈浅褐色，并产生闭囊壳。病情较轻时霉斑呈分散分布，随着病情加重霉斑也逐渐扩大成片，最终覆盖全叶；病斑下部及周围组织褪绿，病叶发黄、早枯，如发病累及茎及叶鞘，则会导致植株整株倒伏；植株矮小细弱，穗小粒少，千粒重有显著下降，最终影响小麦产量。因此发掘和利用新的小麦抗白粉病基因，对小麦抗白粉病育种具有重要意义。
现有技术中对小麦白粉病抗性基因的研究尚不深入；关于鉴定小麦白粉病抗性的分子标记尚未见报道，也没有利用分子标记对小麦白粉病抗性的育种选择也未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定小麦白粉病抗性的分子标记、引物组及应用，以解决现有技术中缺少利用分子标记对小麦白粉病抗性的育种选择的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种基于QPm.saas-4AS基因的鉴定小麦白粉病抗性的分子标记，所述QPm.saas-4AS位于染色体4AS端部上1.06Mb的区间内，所述分子标记是利用QPm.saas-4AS基因两翼SNP探针AX-110406692和 AX-109926787开发两对KASP特异连锁标记，所述连锁标记为KASP-AX-110406692的KASP标记和KASP-AX-109926787的KASP标记；所述KASP-AX-110406692和KASP-AX-109926787的引物组核苷酸序列分别为，
第一组，KASP-AX-110406692引物序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTGAATAGTCTTTTTGGTGACAAA，
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGAATAGTCTTTTTGGTGACAAG，
COM：TTACATGTACCCATCCCATGAACC；
第二组KASP-AX-109926787引物序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCTC，
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCTT，
COM：AAAATCAGAGGAAATGAAAACATC。
进一步的，所述KASP-AX-110406692和KASP-AX-109926787是分别根据AX-110406692和 AX-109926787的探针序列进行设计，所述AX-110406692和 AX-109926787的探针序列分别为：
AX-110406692：
CTGTAGTTGTAACTGAATAGTCTTTTTGGTGACAA[A/G]GGTTCATGGGATGGGTACATGTAATTGATCACACG；
AX-109926787：
TATCAGTTTTTATCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCT[C/T]GATGTTTTCATTTCCTCTGATTTTTTGGTTTTGTT。
本发明提供的鉴定小麦白粉病抗性的分子标记的制备方法，包括下述步骤：
（1）构建高代重组自交系遗传群体
采用高抗白粉病的普通栽培小麦品种川麦104与高感白粉病小麦品种白毛麦构建高代重组自交系遗传群体F8代；
（2）构建遗传连锁图谱
利用50K高密度SNP芯片对群体进行了全基因组扫描，构建遗传连锁图谱，对遗传群体及亲本进行多年多点白粉病抗性鉴定，定位抗白粉病基因QPm.saas-4AS；
（3）遗传定位
对抗白粉病基因QPm.saas-4AS进行遗传定位，其探针区间为AX-110406692和 AX-109926787；
（4）获得鉴定小麦抗白粉病基因的分子标记
利用QPm.saas-4AS位点侧翼探针AX-110406692和 AX-109926787开发两对KASP特异连锁标记，所述连锁标记为KASP-AX-110406692和KASP-AX-109926787；
所述AX-110406692和 AX-109926787的探针序列分别为：
AX-110406692：
CTGTAGTTGTAACTGAATAGTCTTTTTGGTGACAA[A/G]GGTTCATGGGATGGGTACATGTAATTGATCACACG；
AX-109926787：
TATCAGTTTTTATCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCT[C/T]GATGTTTTCATTTCCTCTGATTTTTTGGTTTTGTT。
进一步的，所述步骤（3）中，对抗白粉病基因QPm.saas-4AS进行遗传定位的方法为QTL定位方法。
本发明提供的用于鉴定上述分子标记的引物组，所述引物组的核苷酸序列分别为：
第一组，KASP-AX-110406692引物序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTGAATAGTCTTTTTGGTGACAAA，
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGAATAGTCTTTTTGGTGACAAG，
COM：TTACATGTACCCATCCCATGAACC；
第二组KASP-AX-109926787引物序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCTC，
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCTT，
COM：AAAATCAGAGGAAATGAAAACATC。
本发明提供的一种鉴定小麦白粉病抗性基因的方法，包括下述步骤：
（1）提取待鉴定的小麦基因组DNA；
（2）采用KASP-AX-86175290和KASP-AX-86172908的引物组对步骤（1）提取的DNA进行定量PCR扩增；
（3）对扩增产物进行鉴定。
进一步的，所述步骤（2）中，进行定量PCR扩增时：
PCR反应体系：DNA 2μl； KASP Master mix 5μl；KASP引物组3μl，且引物组3条引物等浓度，按照体积比FAM:HEX:COM=1:1:2的比例混合；总反应体积 10μl；
PCR反应程序：94℃ 预变性 15min ；94℃ 变性 20sec ，61-55℃梯度复性/延伸60sec、每循环降低0.6℃，共10个循环；94℃ 变性 20sec ，55℃复性/延伸60sec，共26个循环；40℃以下进行KASP分型的荧光数据读取。
本发明提供的上述分子标记在鉴定小麦白粉病抗性中的应用。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
本发明提供的鉴定小麦白粉病抗性的分子标记、引物组及应用，开发出可用于小麦白粉病抗性辅助选择的分子标记，大大提高了这一种重要基因资源的利用效率，进而可以快速筛选含有该基因的高抗白粉病的小麦品种或品系用于小麦的抗病育种利用，获得含有小麦白粉病抗性基因的小麦品种，不仅节约了生产成本而且大大提高了具有白粉病抗性小麦材料的选择效率，极大地缩短小麦抗病品种的选育周期；且其检测方便快速，不受环境影响。
附图说明
图1是本发明实施例的技术路线图；
图2是实施例1中选用的高感白粉病材料白毛麦与高抗白粉病品种川麦104对小麦白粉病的抗性反应；
图3是本发明实施例2中利用荧光定量PCR仪进行特异分子标记KASP- AX-110406692检测的分型图；
图4是本发明实施例2中利用荧光定量PCR仪进行特异分子标记KASP- AX-109926787检测的分型图。
具体实施方式
如图1-图4所示：
本发明中的抗白粉病基因QPm.saas-4AS公开在Liu Z , Wang Q , Wan H , etal. QTL mapping for adult-plant resistance to powdery mildew in Chinese elitecommon wheat Chuanmai104[J]. Cereal Research Communications, 2020, 49(12):1-10中。
实施例1：
本发明提供的鉴定小麦白粉病抗性的分子标记的制备方法，包括下述步骤：
（1）构建高代重组自交系遗传群体
采用高抗白粉病的普通栽培小麦品种川麦104与高感白粉病小麦品种白毛麦构建高代重组自交系遗传群体F8代；
（2）构建遗传连锁图谱
利用50K高密度SNP芯片对群体进行了全基因组扫描，构建遗传连锁图谱，对遗传群体及亲本进行多年多点白粉病抗性鉴定，定位抗白粉病基因QPm.saas-4AS；
（3）遗传定位
对抗白粉病基因QPm.saas-4AS 通过QTL定位方法进行遗传定位，其探针区间为AX-110406692和 AX-109926787；
（4）获得鉴定小麦抗白粉病基因的分子标记
利用QPm.saas-4AS位点侧翼探针AX-110406692和 AX-109926787开发两对KASP特异连锁标记，所述连锁标记为KASP-AX-110406692和KASP-AX-109926787。
实施例2：
验证实施例1中的KASP-AX-110406692和KASP-AX-109926787， KASP标记引物检测试剂采用艾吉析科技（上海）有限公司的mix试剂，定量PCR仪使用BIO-RAD公司的CFX384Real-Time System；白粉病抗性的表型鉴定是通过对各材料叶片被病菌侵染程度进行分级鉴定；特异标记的检测是通过“荧光定量PCR仪进行分型检测；具体包括下述步骤：
（1）提取待鉴定的小麦基因组DNA并分装到定量PCR反应板上；
（2）采用KASP-AX-86175290和KASP-AX-86172908的引物组对步骤（1）提取的DNA进行定量PCR扩增；
所述引物组的核苷酸序列分别为：
第一组，KASP-AX-110406692引物序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTGAATAGTCTTTTTGGTGACAAA，
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGAATAGTCTTTTTGGTGACAAG，
COM：TTACATGTACCCATCCCATGAACC；
第二组KASP-AX-109926787引物序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCTC，
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCTT，
COM：AAAATCAGAGGAAATGAAAACATC；
定量PCR扩增的方法为：利用BIO-RAD公司生产的荧光定量PCR仪，进行PCR扩增反应和数据观察分析，利用LGC生物技术公司提供的用于KASP标记检测的Master mix反应液进行PCR扩增。
PCR反应体系：DNA 2μl； KASP Master mix 5μl；KASP引物组3μl，且引物组3条引物等浓度，按照体积比FAM:HEX:COM=1:1:2的比例混合；总反应体积 10μl；
PCR反应程序：94℃ 预变性 15min ；94℃ 变性 20sec ，61-55℃梯度复性/延伸60sec、每循环降低0.6℃，共10个循环；94℃ 变性 20sec ，55℃复性/延伸60sec，共26个循环；40℃以下进行KASP分型的荧光数据读取。
（3）对扩增产物进行鉴定。
按照小麦白粉病抗性分级鉴定标准，具体分级标准分为0级，0；级，1级，2级，3级，4级；其中0级为叶片无任何侵染痕迹，表现为免疫，0；级为叶片无新鲜孢子但有少量坏死斑，1级为叶片具有少量新鲜孢子但表现高抗白粉病，2级为叶片有一定比例的新鲜孢子但表现中抗白粉病，3级为有较多新鲜孢子，表现中感白粉病，4级为叶片被全部侵染，表现高抗白粉病。亲本叶片的被侵染程度进行表型分级鉴定检测结果如图2所示，根据表型分析和定位结果表明，KASP标记检测结果稳定可靠，可用于基因位点QPm.saas-4AS的分子检测。

Claims (8)

1.一种基于基因位点QPm.saas-4AS的鉴定小麦白粉病抗性的分子标记，所述QPm.saas-4AS位于染色体4AS端部上1.06Mb的区间内，其特征在于：所述分子标记是利用QPm.saas-4AS基因两翼SNP探针AX-110406692和 AX-109926787开发两对KASP特异连锁标记，所述连锁标记为KASP-AX-110406692的KASP标记和KASP-AX-109926787的KASP标记；所述KASP-AX-110406692和KASP-AX-109926787的引物组核苷酸序列分别为，
第一组，KASP-AX-110406692引物序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTGAATAGTCTTTTTGGTGACAAA，
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGAATAGTCTTTTTGGTGACAAG，
COM：TTACATGTACCCATCCCATGAACC；
第二组KASP-AX-109926787引物序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCTC，
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCTT，
COM：AAAATCAGAGGAAATGAAAACATC。
2.根据权利要求1所述的鉴定小麦白粉病抗性的分子标记，其特征在于：所述KASP-AX-110406692和KASP-AX-109926787是分别根据AX-110406692和 AX-109926787的探针序列进行设计，所述AX-110406692和 AX-109926787的探针序列分别为：
AX-110406692：
CTGTAGTTGTAACTGAATAGTCTTTTTGGTGACAA[A/G]GGTTCATGGGATGGGTACATGTAATTGATCACACG；
AX-109926787：
TATCAGTTTTTATCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCT[C/T]GATGTTTTCATTTCCTCTGATTTTTTGGTTTTGTT。
3.根据权利要求1或2所述的鉴定小麦白粉病抗性的分子标记的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
（1）构建高代重组自交系遗传群体
采用高抗白粉病普通栽培小麦品种川麦104与高感白粉病小麦品种白毛麦构建高代重组自交系遗传群体F8代；
（2）构建遗传连锁图谱
利用50K高密度SNP芯片对群体进行了全基因组扫描，构建遗传连锁图谱，对遗传群体及亲本进行多年多点白粉病抗性鉴定，定位抗白粉病基因QPm.saas-4AS；
（3）遗传定位
对抗白粉病基因QPm.saas-4AS进行遗传定位，其探针区间为AX-110406692和 AX-109926787；
（4）获得鉴定小麦抗白粉病基因的分子标记
利用QPm.saas-4AS位点侧翼探针AX-110406692和 AX-109926787开发两对KASP特异连锁标记，所述连锁标记为KASP-AX-110406692和KASP-AX-109926787。
4.根据权利要求3所述的鉴定小麦白粉病抗性的分子标记的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，对抗白粉病基因QPm.saas-4AS进行遗传定位的方法为QTL定位方法。
5.用于鉴定权利要求1或2所述分子标记的引物组，其特征在于：所述引物组的核苷酸序列分别为：
第一组，KASP-AX-110406692引物序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTGAATAGTCTTTTTGGTGACAAA，
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGAATAGTCTTTTTGGTGACAAG，
COM：TTACATGTACCCATCCCATGAACC；
第二组KASP-AX-109926787引物序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCTC，
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCCCTTCTCCTTTTGTTTTCCTT，
COM：AAAATCAGAGGAAATGAAAACATC。
6.一种鉴定小麦白粉病抗性基因的方法，其特征在于：包括下述步骤：
（1）提取待鉴定的小麦基因组DNA；
（2）采用KASP-AX-86175290和KASP-AX-86172908的引物组对步骤（1）提取的DNA进行定量PCR扩增；
（3）对扩增产物进行鉴定。
7.根据权利要求6所述的鉴定小麦白粉病抗性基因的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，进行定量PCR扩增时：
PCR反应体系：DNA 2μl； KASP Master mix 5μl；KASP引物组3μl，且引物组3条引物等浓度，按照体积比FAM:HEX:COM=1:1:2的比例混合；总反应体积 10μl；
PCR反应程序：94℃ 预变性 15min ；94℃ 变性 20sec ，61-55℃梯度复性/延伸60sec、每循环降低0.6℃，共10个循环；94℃ 变性 20sec ，55℃复性/延伸60sec，共26个循环；40℃以下进行KASP分型的荧光数据读取。
8.如权利要求1或2所述的分子标记在鉴定小麦白粉病抗性中的应用。
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