CN113278723A - 合成芥菜中导入的白菜基因组片段或遗传多样性分析的组合物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种合成芥菜中导入的白菜基因组片段或遗传多样性分析的组合物及应用。本发明提供用于检测SNP分子标记的特异性引物组合，其包括第一正向引物、第二正向引物和反向引物。本发明基于KASP技术，开发了一套用于合成芥菜中导入的白菜基因组片段以及遗传多样性分析的通用SNP分子标记，从而实现高通量以及高精确的检测。同时本发明的基因导入方法，建立了合成的芥菜系，相比于传统芥菜，显著拓宽了芥菜的遗传多样性。此外，本发明的方法不仅能够有效评估新种质真实的遗传多样性，而且大大降低遗传多样性评估成本。
Description
技术领域
本发明涉及种质资源和分子育种技术领域，特别涉及追踪合成芥菜中导入的白菜基因组片段、新芥菜的创制方法以及基因组均匀分布良好的SNP标记，具体地涉及一种用于创制合成芥菜的方法、导入的基因组片段分析或遗传多样性分析的组合物及其应用。
背景技术
芥菜作为重要的油料作物、蔬菜作物和调料作物，被广泛种植。在长期自然与人为选择的共同作用下，芥菜已经进化成在根、茎、叶、薹的形态上有很大的变化的不同的亚种。包心芥菜(B.juncea var.capitata Hort)是叶用芥菜的变种之一，具有叶球性状。叶球作为重要的营养贮藏器官，富含维生素和膳食纤维。包心芥菜的叶柄短而宽，伴随着植株成形，心叶相互叠抱形成叶球。由于有些包心芥菜的叶柄较厚，形成叶球的过程中经常裂开，影响了商业价值。部分包心芥菜的遗传基础受到了多倍化、起源历史短等因素的制约，遗传基础狭窄，限制了该作物的遗传改良与产量。
基因渗入是通过杂交的方式将一个物种的基因转移到另一个物种中，是作物改良的重要途径，在芸薹属新种质的生成中发挥着积极的作用，如提高油菜的产量，扩大埃塞俄比亚芥菜的遗传多样性。二倍体祖先是重要的遗传资源，可用于导入优异基因以改善作物的性状。禹氏三角描述了芸薹属物种间的亲缘关系，芥菜的祖先种是白菜和黑芥。大白菜是中国乃至东亚地区消费最多的蔬菜之一，被培育成叶球紧实且产量高的蔬菜。大白菜在改良包心芥菜的叶球方面可能具有潜力。
杂交种中渗入片段的鉴定是分子育种中的关键环节。近年来，分子标记的广泛应用为育种家提供了一种简单而有力的工具，可以精确地选择所需的基因型。SNP标记具有基因组分布密度高、多态性高等优点，在白菜和油菜中得到了应用。但在芥菜中的应用较少。尤其是涉及芥菜中渗入片段的相关分子标记研究较少。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
鉴于现有技术中的现状，本发明基于KASP技术，开发了一套用于合成芥菜中导入的白菜基因组片段以及遗传多样性分析的通用SNP分子标记，从而实现高通量以及高精确的检测。同时，本发明的基因导入方法得到的合成芥菜显著增加自然芥菜的遗传变异。考虑到种间杂种的后代往往通过外来的基因渐渗而发生基因组改变和新的变异，而本发明的方法能够有效评价新种质真实的遗传多样性。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于合成芥菜中导入的白菜基因组片段或遗传多样性分析的组合物，其包括用于检测表3所示的SNP分子标记的引物或探针。
根据本发明的组合物，优选地，所述引物包括针对各SNP位点的第一正向引物、第二正向引物和反向引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.:1-396所示。
本发明的第二方面，提供根据第一方面所述的引物组合在合成芥菜中导入的白菜基因组片段分析或遗传多样性分析中的应用。
在某些实施方案中，根据本发明所述的特异性引物组合在检测合成芥菜中白菜渗入基因定位以及遗传多样性分析中的应用，包括以下步骤：
(1)提取合成芥菜的基因组DNA；
(2)基于KASP方法，以所述基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物组合进行SNP分子标记的检测，所述特异性引物进一步包括荧光标签；
(3)进行合成芥菜的基因分型和分型结果分析，从而得到导入的白菜基因组片段的结果或遗传多样性结果。
本发明的第三方面，提供用于创制合成芥菜的方法，所述合成芥菜的基因组的至少部分片段被外源基因片段替换，所述方法包括检测第一方面所述的SNP分子标记的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明所述的导入白菜基因组在改良芥菜或拓宽芥菜的遗传多样性中的方法，且所述芥菜的A基因组片段被至少60.44％的大白菜基因片段替换。
在某些实施方案中，根据本发明所述的导入白菜基因组在改良芥菜或拓宽芥菜的遗传多样性中的方法，包括以下步骤：
a.以芥菜为受体亲本，大白菜为供体亲本进行杂交，结合胚胎挽救的方法获得F1；
b.以F1为母本与所述亲本芥菜回交构建BC1；
c.将BC1植株进行自交并单株收种得到BC1S1群体。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，所述受体亲本为结球型、半结球Ⅰ型和半结球ⅠI型包心芥菜。
本发明的第四方面，提供包含第二方面所述的特异性引物组合的试剂盒。
本发明的第五方面，提供试剂盒在用于基因渗入合成芥菜中基因定位以及遗传多样性分析中的应用。
本发明通过深入研究，基于KASP技术，开发了一套用于合成芥菜中导入的白菜基因组片段分析以及遗传多样性分析的通用SNP分子标记，从而实现高通量以及高精确的检测。同时，本发明的基因导入方法，建立了合成的芥菜系，拓宽了芥菜的遗传多样性。另外，本发明的方法不仅能够有效评价新种质真实的遗传多样性，而且大大降低遗传多样性评价成本。
附图说明
图1为人工合成芥菜的技术路线。
图2为15份具有代表性的合成芥菜与它们的亲本形态图。
图3为132个标记在白菜基因组上的物理位置及对应的遗传距离图。
图4为芥菜A基因组和白菜特异的SNP标记的图形化分型结果图。
图5为132个标记对应的实际Ar基因型频率。
图6为合成芥菜中的白菜基因组片段占比图。
图7为三种包心类型的芥菜后代分别对应的三种基因型的占比，(图中每种类型的从左至右依次代表基因型A、B和H。
图8为基于标记分型结果的全基因SNP的替换示意图。
图9为基于1642个SNP的***发育树和群体遗传结构(K＝6)。
图10为154份参试材料与自然包心芥菜的遗传距离。
图11为基于ADMIXTURE得到的K值和CV值。
图12为基于132个SNP构建的154份参试材料的***发育树。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本文中，术语“基因渗入”是指两个基因库间的基因流动，特别是十字花科之间的基因库间的基因流动，更具体地是指大白菜和芥菜之间的基因库间的基因流动。上述基因流动经过种间杂交产生。
本文中，术语“基因分析”是指基因定位相关分析，基因定位是指基因所属连锁群或染色体片段或其基因在染色体上的位置的测定，其可以通过多种已知的方法进行研究。在本发明中，根据与目的基因连锁的分子标记来确定目的基因在遗传图上的位置或判断目的基因在杂交后代个体中的存在。在某些实施方案中，基因定位是指使用KASP技术追踪合成芥菜中外源渗入片段。本文中，术语“遗传多样性”包括植物个体在表型特征和遗传结构上的多样性的特征。在本发明中，通过分子标记对多样性进行标记区别，其优势在于分子标记不受季节、环境、器官以及植物发育阶段的限制。
术语“试剂盒”中还含有用于标记DNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
本文中，术语人工合成芥菜和术语新芥菜的创制可以互换使用。
[用于合成芥菜中基因渗入分析或遗传多样性分析的组合物]
本发明的第一方面，提供一种用于合成芥菜中导入的白菜基因组片段以及遗传多样性分析的SNP分子标记，本发明的SNP分子标记用于人工合成芥菜或杂交种的辅助基因定位以及遗传多样性分析，因此，本发明也可以称为“用于白菜-芥菜杂交新种质基因定位以及遗传多样性分析的SNP分子标记”。此外，本发明的SNP分子标记能够进行杂交后的合成芥菜的分型，在具体实施方案中，其能够对白菜、芥菜两者纯合基因型以及白菜-芥菜杂合基因型进行区分。基于此，对于确定是否导入外源白菜基因，以及外源白菜基因导入规律，本发明的通用SNP分子标记具有重要的意义，且本发明的标记为基因组均匀分布良好的SNP标记。
本发明的SNP分子标记包括侧翼序列，侧翼序列大小不特别限定，在具体实施方案中，侧翼序列包括大约100bp的核酸序列。需要说明的是，本发明的SNP分子标记前期筛选的标准是：a.能够准确区分白菜及芥菜；b.SNP分子标记在染色体上分布合理，即分子标记在每条染色体上均匀分布。在具体实施方案中，分子标记在10条染色体上均匀分布。在本发明中，通过上述分子标记在参考基因组上的物理位置及对应的遗传距离图，确定不同染色体多态性良好的SNP标记以及不同染色体上相邻的SNP标记之间的物理距离，遗传距离，从而最终确定在染色体上分布相对合理，不受基因紧密连锁的影响，能起到独立的筛选效果的SNP分子标记。
本发明还提供用于合成芥菜中基因渗入或遗传多样性分析的组合物，其包括用于检测表3所示SNP分子标记的引物或探针。
本发明的引物组合包括第一正向引物、第二正向引物和反向引物，所述引物组合包括SEQ ID NO.:1-396所示的引物。优选地，所述引物组合由SEQ ID NO.:1-396所示的引物的组成。
[特异性引物组合在检测合成芥菜中白菜渗入基因分析或遗传多样性分析中的应用]
本发明的应用优选地包括以下步骤：
(1)提取合成芥菜的基因组DNA，提取合成芥菜的DNA方法不特别限定，可以采取已知的方法或提取试剂盒进行。
(2)基于KASP方法，以所述基因组DNA为模板，利用特异性引物组合进行SNP分子标记的检测，所述特异性引物进一步包括荧光标签；
(3)进行合成芥菜的基因分型和分型结果分析，从而得到白菜渗入基因的结果或遗传多样性结果。
本发明的针对遗传多样性的评价方法基于KASP和SNP分子标记，不仅能够实现有效、精确的检测，而且检测步骤简单，避免了例如使用测序进行分析的较高的成本。
[用于创制合成芥菜的方法]
本发明中，芥菜的基因组的至少部分片段被外源基因片段替换，且所述外源基因选自十字花科基因。优选地，所述外源基因为大白菜基因，且所述芥菜的A基因组片段被至少60.44％的大白菜基因片段替换。在具体实施方案中，在合成芥菜10条染色体中，后代的平均白菜基因组片段的数量均大于芥菜片段数。
优选地，本发明的用于创制合成芥菜的方法包括以下步骤：
a.以芥菜为受体亲本，大白菜为供体亲本进行杂交，结合胚胎挽救的方法获得F1；
b.以F1为母本与所述亲本芥菜回交构建BC1；
c.将BC1植株进行自交并单株收种得到BC1S1群体。
优选地，所述受体亲本为结球型、半结球Ⅰ型和半结球ⅠI型包心芥菜。
本发明的方法能够在表型上丰富传统芥菜的多样性，增加变异类型，进而实现芥菜的改良并拓宽芥菜的遗传多样性。
实施例1
本实施例为白菜与芥菜杂交创制新种质相关研究。为了扩大芥菜的遗传多样性，本发明以6份结球或半结球的芥菜为受体亲本，一份大白菜B9008为供体亲本，通过杂交的方式将白菜A基因组导入芥菜。基于双亲的重测序数据，开发了132个可用于鉴定芥菜A基因组和白菜的多态性SNP标记。利用开发的KASP标记对合成芥菜中导入的大白菜染色体片段进行了鉴定。本研究丰富了包心芥菜的表型变异，为今后芥菜的改良提供了SNP标记，表明了利用大白菜在改良芥菜的新育种策略的意义。
1、材料与方法
1.1试验材料
本试验使用的BC1S1群体是由以下材料和方法构建的。亲本材料包括1份自交亲和的大白菜和6份包心芥菜(材料信息如表1中所示)。实验室前期以包心芥菜为受体亲本，大白菜为供体亲本进行杂交，结合胚胎挽救的方法获得F1后，以F1为母本与轮回亲本包心芥菜回交构建BC1群体。本试验将BC1植株进行自交并单株收种(技术路线如图1所示)。2020年秋季，将BC1S1群体内每个单株收获的种子和亲本各播种10粒至穴盘中，6周后将其移栽至中国农业科学院蔬菜花卉研究所的顺义试验田中进行生长，并给予正常田间管理。
表1-杂交组合中用到的亲本材料
注：根据亲本包心芥菜的表型，将包心芥菜分为结球、半结球Ⅰ、半结球Ⅱ三种类型
1.2BC1S1植株形态调查
在植株移栽试验田后3个月，使用相机对7份亲本和合成芥菜进行拍照记录。在拍照时，可将亲本和BC1S1群体内植株较大的外叶扒除(大约为7片叶子)，以清晰地观察到植株的结球形态。
1.3KASP标记的开发与遗传效应分析
近年来，分子标记的广泛应用提供了一种简单而有力的工具，可以精确地选择所需的基因型，深受育种家们的青睐。在芥菜中，分子标记被用于构建遗传图谱，定位与重要经济性状(早熟、抗病性、种子颜色)有关的数量性状位点，这些标记包括AFLP、RAPD、SRAP。SNP标记作为第三代分子标记，具有多态性高、分布广泛等优点，已在白菜、油菜中得到应用，在芥菜中的应用较少。KASP是目前国际上主流的SNP分型方法，能够对SNPs实现精准的双等位基因判别，具有高通量、高准确率等优点，已用于分子标记辅助选择育种、基因定位等。然而，很少有学者使用KASP标记鉴定十字花科作物的大规模外源渗入片段。从祖先二倍体物种到异源四倍体物种的基因渗入片段很大程度上是未知的。
遗传多样性是生存环境适应能力和进化的前提。形态学特征包括种子、茎、叶、花等可以用来评价芸薹属作物，但是表型经常会受到环境的影响，具有局限性。使用DNA探针进行核酸分子杂交可评估小麦A基因组和Am基因组的差异，但是小片段的识别受到限制。可使用分子标记进行遗传多样性的研究。
本节试验基于芥菜和白菜的重测序数据，开发了132个用于区分芥菜A基因组和白菜的多态性KASP标记，提高分子标记辅助芥菜育种的应用，加快芥菜新种质创制的进程。对白菜和芥菜创制的新芥菜材料进行基因分型，鉴定和分析了导入的白菜基因组片段。为了合理评价合成芥菜的遗传多样性，根据基因分型数据确定合成芥菜的片段类型及亲本来源，并使用鉴定的1642个亲本的SNP对分型结果进行替换产生多态性数据。全基因组均匀分布的1642个SNP的***发育树和群体遗传结构分析，表明自然芥菜的遗传多样性被显著提高。本研究为合成新种质遗传多样性的评价降低了测序成本和提供了有效的策略。
1.3.1试验材料
为了分析祖先二倍体物种到异源四倍体物种的渗入片段，所使用的材料为上述BC1S1群体中的107份导入白菜A基因组的新芥菜材料，简称合成芥菜
1.3.2基因组DNA的提取和Illumina测序
取合成芥菜和7份亲本的新鲜幼嫩叶片，使用磁珠法核酸提取试剂盒，提取基因组的DNA，所用仪器为KingFisher Flex自动核酸纯化仪(Thermo Fisher Scientific)。提取由5个步骤组成，包括磁珠与核酸的结合、两次清洗、干燥以及DNA的洗脱，提取时间为30min。利用Nanodrop 1000检测所提取DNA的浓度。对于每个亲本可提取三份DNA，确保筛选引物和重测序有足够量的DNA。本次试验中的7份亲本材料的重测序工作由诺禾致源生物科技有限公司使用Illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行。测序完成后交付原始测序数据。
1.3.3基于重测序数据检索SNP变异和设计引物
使用fastp(CHEN et al.,2018)对原始重测序数据过滤，过滤标准如下：
(1)去除含有接头的reads；
(2)去除未检出的碱基比例大于10％的reads；
(3)去除低质量(Q<＝5)碱基数大于50％的reads。
过滤后的所有亲本重测序数据通过软件Burrows-Wheeler Alignment Tool(BWA)比对到白菜参考基因组(Chiifu)3.0版本上(ZHANG et al.,2018)。利用SAMtools和bcftools软件检索SNP变异，任何一个亲本与参考基因组之间存在SNP变异时就输出该变异位点的相关信息，最终得到7份亲本与参考基因组之间SNP变异的vcf文件。编写Python脚本，从vcf文件中挑选出亲本B9008与参考基因组之间无多态性，与亲本包心芥菜之间有多态性的变异位点作为候选SNP。
观察候选SNP侧翼序列的变异情况，并截取其上下游各100bp的核酸序列，提交至网页版引物设计工具Primer3进行特异性KASP引物的设计。1.3.4基于KASP技术鉴定基因型
利用KASP技术筛选芥菜A基因组和白菜特异的SNP标记和鉴定人工合成芥菜的基因型。KASP基因分型试验同样参照LGC的方法。采用384孔板在成都翰辰光翼科技有限责任公司GeneMatrix***上进行基因分型。使用该***中的Matrix Arrayer进行反应板的加样和自动化分装，热循环扩增在***中的Matrix Cycler水浴热循环仪上进行，***中的Matrix Scanner荧光扫描仪用于进样、条形码读取、荧光检测、出样等操作。使用其配套软件输出基因型检测结果。
1.3.5数据分析和遗传多样性分析
利用R软件和白菜参考基因组中的binmarker信息(ZHANG et al.,2018)，绘制SNP标记在白菜基因组上的物理位置及对应的遗传距离图，同时标注着丝粒区域。使用excel2013对KASP基因分型结果进行统计分析，图形化展示结果所使用的软件为R、PhotoshopCS5、Adobe Illustrator CC 2014。
为了评估人工合成芥菜的遗传多样性，我们基于邻接法(Neighbor joining)进行***发育分析。计算标记之间的距离矩阵，利用PHYLIP软件(V3.69)构***发育树，使用iTOL(https://itol.embl.de/)美化进化树。进一步使用ADMIXTURE软件进行人工合成芥菜的群体遗传结构分析(ALEXANDER et al.,2009)，将K值设定为1到7，寻找最佳K值分析群体结构。
2结果与分析
2.1BC1S1群体中株***计
实验室前期通过胚挽救的方法获得了白菜和芥菜的F1杂种。白菜和芥菜杂交获得的F1为三倍体，高度不育，因此将开花后结籽率低的鉴定为真F1，共获得6个真实的F1植株。将F1与轮回包心芥菜亲本杂交获得的BC1植株套袋自交，并单株收种获得BC1S1群体，每个单株收获的种子为1个株系，总共获得101个株系(具体株系信息如表2所示)。由于每个株系中的植株差别和变异不大，根据植株在田间的表型及生长状况每个株系至少挑选1株，我们从中挑选出107份代表性材料进行后续的探究。
表2利用供体亲本B9008获得的后代数量
2.2合成芥菜表型变异丰富
根据芥菜亲本的结球表型，将芥菜亲本分为3类，分别命名为Heading、Semi-headingⅠ、Semi-headingⅡ。第一种类型芥菜的叶球近似球形(Heading)，亲本编号为20JS1536，20JS1538，20JS1540。另外两种芥菜亲本的叶球为半结球型，但表型存在差异，其中Semi-headingⅡ芥菜(20JS1537)的叶柄更宽且更厚。通过对合成芥菜的表型的采集及观察发现，与Heading芥菜杂交获得的后代维持了叶球形态并生长出叶子。我们挑选出15份具有代表性的植株进行展示。通过观察可以发现，与Semi-headingⅠ芥菜杂交获得的后代的叶球类型增加，具体表现为叶子开始继续向上向内折叠，形成了更加紧实的叶球。与Semi-headingⅡ芥菜杂交获得的后代的叶柄形态发生了变化。如图2所示，与Heading芥菜杂交获得的后代的叶球明显与亲本不同。因此，与传统的芥菜相比较，合成芥菜发生了丰富的表型变异，还出现了与白菜表型相似的类型(如图2所示)。
2.3获得染色体上均匀分布的SNP标记
为了开发白菜和芥菜A基因组的特异性SNP标记，我们对所有白菜和芥菜亲本进行了重测序，重测序的深度为5×。将过滤后的7份亲本的重测序数据与Chiifu参考基因组(V3.0)比对，共检索到287,343个SNP位点。利用Python脚本从中挑选出白菜亲本与参考基因组无多态性，而芥菜亲本与参考基因组有多态性且符合筛选要求的SNP共计971个。基于白菜和芥菜A基因组特异的971个SNP进行标记的开发，计划在白菜基因组的每条染色体上至少有10个能成功分型且分布合理的标记。
为了验证SNP标记的多态性，将亲本B9008和6份包心芥菜的DNA作为模板。利用KASP技术共筛选出132个多态性良好，且能区分白菜和芥菜A基因组的SNP标记。区分芥菜A基因组和白菜的KASP引物序列如表3所示。
表3
为了确保SNP标记不受其连锁基因的影响，有独立的筛选作用(参见Zhang,L.etal.Improved Brassica rapa reference genome by single-molecule sequencing andchromosome conformation capture technologies.Hortic Res.5,50(2018))，利用R软件和binmaker的位置绘制了132个标记在白菜基因组上的物理位置及对应的遗传距离图。如图3所示，图中每条染色体左柱(深色)长度代表每条染色体的物理距离，每条染色体右柱(浅色)代表每条染色体的遗传距离，黑色区域代表着丝粒区域。染色体4号、5号和8号上有10个多态性良好的SNP标记，3号染色体上的SNP标记数最多，为17个。染色体上相邻的2个SNP标记之间的平均物理距离为2.142Mb，最大物理距离为2.958Mb，最小物理距离为1.481Mb。染色体上相邻的2个SNP标记之间的平均遗传距离为6.724cM，最大遗传距离为10.658cM，最小遗传距离为4.113cM，每条染色体上标记的平均物理距离和遗传距离如表4所示。标记在染色体上分布相对合理，不受基因紧密连锁的影响，能起到独立的筛选效果。
表4-白菜基因组每条染色体上的标记数量
2.4合成芥菜偏向保留白菜基因组片段
为了评估合成芥菜中渗入的白菜片段，使用染色体上均匀分布的132个多态性SNP标记对107份人工合成芥菜进行KASP基因分型。基于合成芥菜的KASP基因分型结果绘制分型图，如图4所示，图中横轴代表6份包心芥菜亲本、B9008和按6份芥菜亲本分割的107份合成芥菜，纵轴代表132个多态性SNP标记，根据标记在白菜10条染色体上的物理位置分割为10组。将分型结果分为4种类型，与亲本大白菜分型一致的计为A(基因型为ArAr，用深色表示，与亲本芥菜分型一致的计为B(基因型为AjAj，用蓝色表示)，杂合基因型计为H(基因型为ArAj，用绿色表示)，缺失基因型计为D(用灰色标记)。在132个标记中，B9008的基因型均为ArAr，6份芥菜亲本的基因型均为AjAj，所有标记均能正确地区分亲本白菜和亲本芥菜且具有良好的多态性。从图中可以看出红色与绿色的片段之和大于蓝色片段，总共对14214个位点进行分型，经统计，A、B、H、D四种基因型的总数分别为1530、54116、6814和319。其中基因型A、B、H的所占比例分别为11.82％、39.56％、49.36％。经卡方检验，BC1S1群体中基因型A、B、H的实际分离比与期望分离比(1：5：2)具有极显著差异，χ2值为4461.25，P<0.005，这表明在白菜和芥菜的远缘杂交过程中，后代倾向保留白菜基因组，且以杂合的形式存在。
对合成芥菜的白菜基因组片段的占比进行分析并绘制小提琴图，如图6所示。合成芥菜中基因型A、B、H比例范围分别为0-30.3％、6.06％-70.45％、12.88-88.64％。基因型ArAr(A)和ArAj中均被认为包含白菜基因组片段，平均来看，合成芥菜的A基因组有60.44％已被大白菜基因组覆盖。
为了分析芥菜亲本的白菜片段的渗入率是否存在差异，将三种结球类型芥菜亲本的后代中的三种基因型占比进行了比较。如图7所示，Heading、Semi-headingⅠ、Semi-headingⅡ三种类型芥菜获得的后代对应的A基因型的平均占比分别为11.94％，9.75％和11.3％。以芥菜Semi-headingⅡ为亲本时，三种基因型的占比范围均为另外两种芥菜为亲本时小。Semi-headingⅠ和Semi-headingⅡ为亲本时，A基因型占比的最大值相同，均为30.03％。这表明，不同类型芥菜后代中的保留的白菜基因组片段存在差异。
2.5合成芥菜中标记受到偏向性选择
进一步计算了标记对应的实际Ar基因型频率，如图5，计算公式为：A*2+H/(A+B+H)*2。BC1S1群体中Ar基因型频率的理论值为25％。在132个标记中，有129个标记的实际Ar基因型频率大于理论值25％，说明97.73％的标记受到了强烈的正向选择。相反的是，有3个标记的实际Ar基因型频率小于20％，这3个标记和它们对应的基因型频率分别为A01_364,9％,A04_22,2％,A08_215,12％。从图4基因分型结果中，我们看到子代中这三个位置均出现了大量芥菜片段(AjAj)，这表明这三个标记附近的白菜片段较难导入。
2.6合成芥菜的遗传多样性分析
为了分析合成芥菜的变异情况，我们选择了代表性的白菜和芥菜材料在全基因组水平上进行多样性的评价。代表性芥菜材料包括包心芥、雪里蕻、根芥各10份，代表性白菜材料为10份结球白菜。实验室前期已对40份代表性材料完成测序，并获得了clean reads。
全基因组水平上的SNPs是基于所有亲本和40份代表性材料的clean reads与Chiifu参考基因组比对获得的。过滤的要求是当任何一个亲本为杂合基因型时，就过滤该SNP位点。我们将白菜基因组以大约148kb的间隔分隔成2000个区域，并从过滤掉亲本为杂合基因型的SNP位点集中，找出与2001个间隔点距离最相近的SNP位点。将40份代表性材料的clean reads同样比对到Chiifu参考基因组上以获得具有多态性的SNP位点。最终，在所有亲本和40份代表性材料中一共得到1642个在染色体A01号至A10号染色体上均匀分布的且为纯合基因型的SNP位点。随后，我们利用亲本的1642个SNP对107份合成芥菜的132个SNP标记的KASP基因分型结果进行替换。每一份合成芥菜的缺失基因型都先使用其邻近标记的分型结果替换，缺失基因型左右两侧同时存在两种纯合基因型，直接替换为杂合基因型。则使用其亲本的SNP替换。利用1642个亲本的SNP位点对107份合成芥菜的132个SNP标记的KASP基因分型结果进行替换(如图8所示)，其中红色，灰色和蓝色方块代表标记的分型结果，分别为Ar，缺失，和Aj，圆圈表示用于替换的亲本的SNPs。
利用154份参试材料的1642个SNP位点进行***发育分析，进化树如图9所示。结果显示，合成芥菜材料可以根据其三种类型的包心芥菜亲本聚为三类，这三类分别是introgression type I，II，III。自然的包心芥菜(Hm)材料之间几乎没有变异，并且其遗传变异比雪里蕻(Pm)和根芥(Rm)的遗传变异狭窄。***发育分析表明与正常包心芥菜材料相比，合成芥菜材料表现出丰富的遗传多样性。
利用ADMIXTURE软件分析154份参试材料的群体结构，群体结构如图9所示。在K＝6时，变异系数(ZHANG et al)的值最小，说明K的最合适值为6(如图11所示)。白菜和芥菜亲本材料用4种颜色表示，semi-headingⅠ(绿色)，semi-headingⅡ(粉色)，heading B.juncea(浅蓝色)，B9008(黄色)。K值为6时，芥菜亲本可以按照结球表型的不同分为3类，合成芥菜材料同样可以根据其芥菜亲本被分为三大类，这与***发育分析的结果一致。在合成芥菜中明显整合了芥菜亲本和B9008的遗传成分。
我们进一步对正常的包心芥菜与合成芥菜材料的遗传距离进行了分析，结果如箱线图10所示。自然包心芥菜之间(Hm)的最大遗传距离仅为0.03，然而，三种包心类型芥菜semi-headingⅠ、semi-headingⅡ、heading B.juncea的后代(introgression type I，II，III)的最大遗传距离分别为0.33、0.31、0.30。与自然包心芥菜之间的平均遗传距相比，三类合成芥菜与包心芥菜的最大遗传距离显著增加(如下表所示)。
表5-自然包心芥菜与不同类型参试材料的平均遗传距离
表6-自然包心芥菜与不同类型参试材料的最大遗传距离
3.讨论
本研究通过芥菜的祖先种白菜的渗入重新合成芥菜。人工合成芥菜的基因分型表明，新创制芥菜的A基因组片段大规模被白菜基因组片段替换。仅使用一份白菜本，合成芥菜便表现出扩大的形态变异和丰富的遗传多样性，说明白菜在拓宽芥菜的遗传基础方面具有很大的潜力。这些已知白菜遗传组分的合成芥菜是芥菜品种改良的宝贵资源。
本研究中开发的132个特异性SNP标记能够准确地区分芥菜A基因组和白菜基因组，且均匀地分布在白菜基因组的10条染色体上。利用特异性SNP标记对构建的BC1S1分离群体进行分析，为群体中渗入的白菜基因组片段的追踪提供了一种有效、高通量的方法。在衍生的后代中检测到不同比例的白菜基因组片段，这是由于受体亲本芥菜的表型具有差异。通过芥菜的测序分析，芥菜的A基因组是来源于同一个亚种，与白菜具有不同的起源，属于单系起源(YANG et al.,2016)。因此，这组SNP标记具有通用性，能够区分大多数的芥菜A基因组与白菜基因组，有助于将来检测合成芥菜中的其他类型白菜的渗入片段。
此外，在基因组区域发现了对芥菜亲本基因型的强烈选择。3个SNP标记(A01_364,A04_22,A08_215)明显与其他129个SNP标记存在显著差异，这3个标记的实际受体基因型频率小于BC1S1群体的理论基因型频率25％。这可能与标记在染色体端粒部分有关(A01_364,A04_22)。在构建BC1S1群体时，并没有对植株进行人工授粉，而是选择了产生种子数更多的植株，这显然是一种很强的自交亲和性选择。因此，我们推测这3个标记的偏向性与自交亲和性选择相关。已经报道的位于拟南芥4号染色体上的Al S-locus基因在白菜中有3个共线性片段，位于白菜三套亚基因组LF、MF1、MF2上的A01、A03和A08(CUI et al.,2020)。然而，白菜和芥菜亲本在白菜和芥菜亲本中没有发现变异，说明可能存在其他未知的自交亲和性相关基因，但是我们可能存在其他未知的因素。
本研究中使用的是三种不同结球表型的芥菜亲本，因此我们期望合成的芥菜可以根据受体亲本的不同而分为三类。在利用开发的132个KASP标记对合成芥菜进行分组时，白菜和芥菜之间有明显的分类，合成芥菜介于这两个亲本物种之间。但是合成芥菜之间相互交叉，没有明确的分类，与不同类型受体亲本没有对应(如图12所示)这表明，确保标记能区分白菜和芥菜的通用性的规则，会降低标记辨别两个物种间差异的能力。为了正确地评估合成芥菜的多样性，我们根据KASP标记确定合成芥菜的片段来源及其对应的亲本基因型，以148kb的间隔鉴定了1642个基因组均匀分布的SNP。基于1642个SNP的***发育树与群体遗传分析，合成芥菜后代能与三种不同包心表型的芥菜亲本相关联。同时，合成芥菜的品种多样性明显高于自然芥菜。开发的KASP标记具有很高的灵敏度，能够鉴定每份合成芥菜的纯合或者杂合基因型。利用KASP标记评估基因组多样性，可以避免对对107份合成芥菜进行测序。种间杂种的后代往往通过外来的基因渐渗而发生基因组改变和新的变异，该策略不仅为评价新种质真实的遗传多样性提供了新的思路，也降低了在全基因组水平上评估新种质多样性的成本。
研究表明，在遗传多样性的亲本之间进行杂交，对芥菜创造更多的多样性和扩大遗传基础具有重要意义(SHARMA et al.,2020；MASON and BATLEY,2015；GUPTA andBANGA,2016)。然而，没有研究在全基因组水平上对合成的新种质进行***评价。基于全基因组的SNPs，鉴定出包心芥菜的最大遗传距离由0.03提升至0.33，这表明芥菜的遗传多样性显著增加。除了遗传变异，我们也观察到合成材料丰富的表型变异。本研究通过对芥菜进行大量的基因导入，建立了合成的芥菜系，拓宽了芥菜的遗传多样性。这种再合成策略可以推广到其他芸薹属的异源四倍体植物。我们的策略为引入祖先二倍体物种的遗传变异来创造异源四倍体新种质提供了解决方案，也为新种质中大量外源渗入基因的评价提供了见解。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 合成芥菜中导入的白菜基因组片段或遗传多样性分析的组合物及应用
<130> BH2110183
<141> 2021-05-28
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tggttcgact tcgcgtactc g 41
<210> 186
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 186
gaggaggaaa gtgtctctac catc 24
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 187
gaaggtgacc aagttcatgc tccggcctga ttcaatttca aacc 44
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tccggcctga ttcaatttca aact 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtcctgccgg agttttcaaa tc 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tattgagatc cgagttgcat cagtt 45
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<213> Artificial Sequence
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ccgctataac tactagactg ctgg 24
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tagccactct gcaatgaaag agaac 45
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gactgatacc tactgcccaa tgta 24
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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ccgttacatt ttcatccaca acca 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc tcttaccacc ttctgggatt gttg 44
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<211> 44
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tcttaccacc ttctgggatt gttt 44
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atctattacg ggctttccag agag 24
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gctaggcaag tagctacaca aaga 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc tgaattgcaa cccagtctct actcc 45
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gaaggtcgga gtcaacggat tgaattgcaa cccagtctct actcg 45
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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tccatcttca gcagagagtt ttga 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc ttccacatca tcaaagaaat agggg 45
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat ttccacatca tcaaagaaat aggga 45
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gaaagcagct cgagaaagtt acaa 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat taaacacaca acttcacaac gaaac 45
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gattcttgat cattcacgag tggg 24
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gaaggtcgga gtcaacggat tgcatttctt tttatgttcc attgaaaata tcac 54
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cgtattcttt gcctaactgg aagt 24
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ccaaaccata accagaagca gaaa 24
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gaaggtgacc aagttcatgc tttatatccg aatatatacc ttgcgtatc 49
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gaaggtcgga gtcaacggat tttatatccg aatatatacc ttgcgtatt 49
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gcaagtctca gtcggaaaaa tcaa 24
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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taaaatggtg attcaaacgg accc 24
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gaaggtcgga gtcaacggat ttctaaagaa gacgggattt acttgtg 47
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tcccttttct tctggtttac catt 24
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<213> Artificial Sequence
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tgcagcagag ctaactaact gata 24
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<213> Artificial Sequence
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gagatccgaa atacctgatc cgaa 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc tacgacgaaa ctcaactttt tgtca 45
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<211> 45
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tacgacgaaa ctcaactttt tgtcc 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atttggtttg tacacaaaag gcca 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc ttgaaggttt ggatatatat taatctcaat ct 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat ttgaaggttt ggatatatat taatctcaat cc 52
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accagattct gatgggatgg aaat 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc tgcttcgaat tgaggagtcg ttc 43
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tgcttcgaat tgaggagtcg ttg 43
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<213> Artificial Sequence
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tctcagcatt acgatcatca ctct 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 48
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tagaggaata agaagctata aaaacaga 48
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<213> Artificial Sequence
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agaaaatatg ctttgaatgg gaatca 26
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tctagataag ccaagactgc gtgcc 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ttgtctgccg tttgttataa gagc 24
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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acaaaagcaa cacacttgta ggac 24
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<213> Artificial Sequence
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<211> 48
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atggtctgag gatgttaact tgct 24
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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cagttcacgg gctttaactt tcag 24
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<213> Artificial Sequence
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cacccaccac taagtaacaa ccta 24
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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taagcatccc aaatgagttt gtgg 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tcaagttgat cggtttcact aagga 45
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<213> Artificial Sequence
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ctgggcgagt cagacatttt attc 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc tagctgcatt gtattctcca agttt 45
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tagctgcatt gtattctcca agttc 45
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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tcagtgcgtg gtttctttca aatt 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 280
gaaggtgacc aagttcatgc tcaccaagtt agaaacaacg acaac 45
<210> 281
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 281
gaaggtcgga gtcaacggat tcaccaagtt agaaacaacg acaaa 45
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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catgctatgg tggggatctt tttc 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 283
gaaggtgacc aagttcatgc ttcaagaatg atagacaagg cagca 45
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<213> Artificial Sequence
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ggtgagtttc aattccttgc tgtt 24
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 286
gaaggtgacc aagttcatgc ttttgaagac caatcttttg agcat 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat ttttgaagac caatcttttg agcac 45
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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taactctaca ctttttcgct tcgc 24
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<213> Artificial Sequence
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tagccctcct atgaaaattc acgt 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc tgcaagaact tgagagatga aagagata 48
<210> 299
<211> 48
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tgcaagaact tgagagatga aagagatg 48
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<213> Artificial Sequence
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gatacgttcg ttatgcatat gggc 24
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc taccataata gcctcgtcta gtaacg 46
<210> 302
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 302
gaaggtcgga gtcaacggat taccataata gcctcgtcta gtaaca 46
<210> 303
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gctgtgagaa catcattggt gaat 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 304
gaaggtgacc aagttcatgc tctgttgttc tcggtggatc tcaa 44
<210> 305
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tctgttgttc tcggtggatc tcac 44
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaaaactca gaagcattca cgga 24
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<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc tcccctttta ataaataaca tattgggcct a 51
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<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tcccctttta ataaataaca tattgggcct g 51
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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aagggcctta taatgtgggt tctt 24
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gaaggtgacc aagttcatgc tcccattctg atgtatgtaa gcacac 46
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gaaggtcgga gtcaacggat tcccattctg atgtatgtaa gcacat 46
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ctactatccg gctcctgatt tcaa 24
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<211> 48
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<213> Artificial Sequence
<400> 313
gaaggtgacc aagttcatgc tacgcataat tcagccattt aatatttc 48
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<211> 48
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gaaggtcgga gtcaacggat tacgcataat tcagccattt aatatttt 48
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<211> 24
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tagatcatct gggctctagt cagt 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc tagactgact atcgtgttag gttcc 45
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tagactgact atcgtgttag gttca 45
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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gacaaagaag tagttgaagc acgt 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc tatcaagata taaagatcag aggagaatta g 51
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tatcaagata taaagatcag aggagaatta c 51
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<213> Artificial Sequence
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agcaacggtc atgaacaaat aagg 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 322
gaaggtgacc aagttcatgc tatctttgac ttaatcgtcg ttggg 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tatctttgac ttaatcgtcg ttggt 45
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 324
atgatttcac agaacaaacc cacc 24
<210> 325
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 325
gaaggtgacc aagttcatgc tttttataat aaacgccatt ccgcc 45
<210> 326
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tttttataat aaacgccatt ccgcg 45
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<213> Artificial Sequence
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tttcgatggg aaaagcaaac acac 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc tgttgcggtc agatcagccc 40
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<211> 40
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gaaggtcgga gtcaacggat tgttgcggtc agatcagccg 40
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agtcaccgaa gaactcacat gaat 24
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gaaggtgacc aagttcatgc tgtaggaact aggaaagctg gttttt 46
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gaaggtcgga gtcaacggat tgtaggaact aggaaagctg gttttg 46
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ccatgagagc agaagaaaca tcac 24
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gaaggtcgga gtcaacggat tatccccaca tagtcttgga aaaac 45
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tcacttcact tggtagagga aagg 24
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gaaggtgacc aagttcatgc ttgatgtgtc tagatgagtc tctttcc 47
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gaaggtcgga gtcaacggat ttgatgtgtc tagatgagtc tctttct 47
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aaggaattag accttgaatt caatca 26
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc tagcatttat ttggttttgt gtcttcta 48
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<211> 48
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tagcatttat ttggttttgt gtcttctg 48
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gataaggaga gagagattac ccgc 24
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gaaggtgacc aagttcatgc ttggtttacc attctagatt tcactg 46
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gaaggtcgga gtcaacggat ttggtttacc attctagatt tcacta 46
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ctctggatcc agtagtactg ttgg 24
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<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc ttctctttcc tctccatttt tacataattg 50
<210> 347
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 347
gaaggtcgga gtcaacggat ttctctttcc tctccatttt tacataattt 50
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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agggattatg gtaacgcact gtta 24
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtcgga gtcaacggat tagagagata cgaatcgaaa acggc 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tttatttacg ccgaacttcc caac 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaggtgacc aagttcatgc ttcagaggtg acggtatagg agaaa 45
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<213> Artificial Sequence
<400> 353
gaaggtcgga gtcaacggat ttcagaggtg acggtatagg agaac 45
<210> 354
<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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cgagcctaga ttctctttct cctc 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 355
gaaggtgacc aagttcatgc tcggtttagt tcctttcctg atcatg 46
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 356
gaaggtcgga gtcaacggat tcggtttagt tcctttcctg atcata 46
<210> 357
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 357
gtatagttta gtgatcggtg ggct 24
<210> 358
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 358
gaaggtgacc aagttcatgc tcaatgaaca tgacaacggt ttcg 44
<210> 359
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 359
gaaggtcgga gtcaacggat tcaatgaaca tgacaacggt ttca 44
<210> 360
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 360
agttgaatcc acctgtagaa gcat 24
<210> 361
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 361
gaaggtgacc aagttcatgc tccgagtcag aagccaaaac tcta 44
<210> 362
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 362
gaaggtcgga gtcaacggat tccgagtcag aagccaaaac tctc 44
<210> 363
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 363
gtcaggtctt actgcaacaa cttc 24
<210> 364
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 364
gaaggtgacc aagttcatgc tcagtaccgg cctcaatgaa ac 42
<210> 365
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 365
gaaggtcgga gtcaacggat tcagtaccgg cctcaatgaa aa 42
<210> 366
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 366
acttgttagt cctgttcctt tggt 24
<210> 367
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 367
gaaggtgacc aagttcatgc ttgattgcgg tctttctttc caaagt 46
<210> 368
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 368
gaaggtcgga gtcaacggat ttgattgcgg tctttctttc caaagc 46
<210> 369
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 369
tcgatagacc cctgaatcat gttt 24
<210> 370
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 370
gaaggtgacc aagttcatgc tagcttttac atactttaag tagtccact 49
<210> 371
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 371
gaaggtcgga gtcaacggat tagcttttac atactttaag tagtccaca 49
<210> 372
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 372
gcttttaagt gtatcgtccg tgtt 24
<210> 373
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 373
gaaggtgacc aagttcatgc ttgttacttg tttggttgtt gacatagta 49
<210> 374
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 374
gaaggtcgga gtcaacggat ttgttacttg tttggttgtt gacatagtt 49
<210> 375
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 375
tgcatcttct caacctcttc tcat 24
<210> 376
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 376
gaaggtgacc aagttcatgc tggtaattca tgttgtggta aatggttc 48
<210> 377
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 377
gaaggtcgga gtcaacggat tggtaattca tgttgtggta aatggtta 48
<210> 378
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 378
gaggatagca aacatgctga cttg 24
<210> 379
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 379
gaaggtgacc aagttcatgc tggatatcta tcacacgtcg cactc 45
<210> 380
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 380
gaaggtcgga gtcaacggat tggatatcta tcacacgtcg cactt 45
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 381
acttccttga tgttatcatt catatgca 28
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 382
gaaggtgacc aagttcatgc tacgtacacc actgaaagat aatctt 46
<210> 383
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 383
gaaggtcgga gtcaacggat tacgtacacc actgaaagat aatctc 46
<210> 384
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 384
tgactatgac cggaaacaag tttt 24
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 385
gaaggtgacc aagttcatgc tctagcaacc ttcgtcatag ccc 43
<210> 386
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 386
gaaggtcgga gtcaacggat tctagcaacc ttcgtcatag ccg 43
<210> 387
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 387
aacgtagagg agaagcaact gatg 24
<210> 388
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 388
gaaggtgacc aagttcatgc ttgtaaatat ggcttatgaa gttatgtcg 49
<210> 389
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 389
gaaggtcgga gtcaacggat ttgtaaatat ggcttatgaa gttatgtct 49
<210> 390
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 390
ggcaagaaga caacagaacc atag 24
<210> 391
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 391
gaaggtgacc aagttcatgc tatgagcgtg gggaaagcga 40
<210> 392
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 392
gaaggtcgga gtcaacggat tatgagcgtg gggaaagcgg 40
<210> 393
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 393
gaagctccct tctccttcat atca 24
<210> 394
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 394
gaaggtgacc aagttcatgc ttcataaacc tgcatgcatc caatc 45
<210> 395
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 395
gaaggtcgga gtcaacggat ttcataaacc tgcatgcatc caatt 45
<210> 396
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 396
tcgaagaaaa gttcataaca agagaa 26
Claims (10)
1.一种用于合成芥菜中导入的白菜基因组片段分析或遗传多样性分析的组合物，其特征在于，包括用于检测表3所示SNP分子标记的引物或探针。
2.根据权利要求1所述的用于合成芥菜中导入的白菜基因组片段分析或遗传多样性分析的组合物，其特征在于，所述引物包括针对各SNP分子标记的第一正向引物、第二正向引物和反向引物，所述引物的序列包括SEQ ID NO.:1-396所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的组合物在合成芥菜中白菜渗入基因分析或遗传多样性分析中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取合成芥菜的基因组DNA；
(2)基于KASP方法，以所述基因组DNA为模板，利用所述特异性引物组合进行SNP分子标记的检测，所述引物进一步包括荧光标签；
(3)进行合成芥菜的基因分型和分型结果分析，从而得到导入的白菜基因组片段的结果或遗传多样性结果。
5.一种用于创制得到合成芥菜的方法，其特征在于，所述合成芥菜的基因组的至少部分片段被外源基因片段替换，所述方法包括检测表3所述的SNP分子标记的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述合成芥菜的基因组中60.44％的A基因组片段被大白菜基因组片段替换。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.以芥菜为受体亲本，大白菜为供体亲本进行杂交，结合胚胎挽救的方法获得F1；
b.以F1为母本与所述亲本芥菜回交构建BC1；
c.将BC1植株进行自交并单株收种得到BC1S1群体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述受体亲本为结球型、半结球Ⅰ型和半结球ⅠI型包心芥菜。
9.包含根据权利要求1或2所述组合物的试剂盒。
10.根据权利要求9所述的试剂盒在用于合成芥菜中导入的白菜基因组片段以及遗传多样性分析中的应用。
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| CN (1) | CN113278723B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112322617A (zh) * | 2020-11-27 | 2021-02-05 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种可鉴定大麦籽粒糯性的kasp分子标记及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105918105A (zh) * | 2016-04-27 | 2016-09-07 | 西南大学 | 一种利用白菜拓宽芥菜a亚基因组遗传变异的方法 |
-
2021
- 2021-05-28 CN CN202110594827.XA patent/CN113278723B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105918105A (zh) * | 2016-04-27 | 2016-09-07 | 西南大学 | 一种利用白菜拓宽芥菜a亚基因组遗传变异的方法 |
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| Publication number | Publication date |
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| CN113278723B (zh) | 2021-11-26 |
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