CN113234642B

CN113234642B - 硫藤黄链霉菌St-79及其用途

Info

Publication number: CN113234642B
Application number: CN202110709631.0A
Authority: CN
Inventors: 蒋冬花; 马静静; 潘妍妍; 杨孙玉悦; 王炫栋
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2041-06-25
Also published as: CN113234642A

Abstract

本发明公开了一种硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St‑79，保藏编号为CCTCC NO：M 2020962。硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St‑79菌株的用途为：促进水稻种子萌发，防治水稻白叶枯病害、抑制植物病原细菌。

Description

硫藤黄链霉菌St-79及其用途

技术领域

本发明属于微生物生物防治领域，涉及拮抗水稻白叶病菌的硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St-79菌株及其在促进水稻种子萌发中的应用。

背景技术

水稻白叶枯病最早发生于日本，由于稻种的传播致使该病在亚洲各大稻区均有发生，其中以日本、中国、印度等地较为严重。现阶段，我国遭遇白叶枯病侵害的地区主要集中于华东、华中等水稻生产区，而西南、西北等地区较少见。该病菌经由水流传播，通过叶片上的小孔或伤口侵入水稻，一般在台风暴雨较多或发生洪涝的年份引起病害的流行。

水稻白叶枯病是由水稻黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的，发病时的典型症状为：水稻病株叶尖及边缘初生黄绿色斑点，后发展成波纹状的黄绿或灰绿色病状，并沿叶脉扩展成条斑，可达整张叶片，病部与健部界限明显。目前对于水稻白叶枯病的防治方法主要是化学防治，但化学防治具有显而易见的局限性和危害性，当前也并没有特别有效的农药可以应用在细菌性病害的防治上。放线菌是一类广泛用于农业生产的重要生防微生物。高嫚妮等(2019年)从银杏树林土壤中分离放线菌，并用生长速率法测得其对苹果腐烂病菌和苹果斑点落叶病菌的抑制率达到了98％以上，对苹果褐斑病菌、小麦赤霉病菌、稻瘟病等其它病原菌的抑制率均大于60％。张艳军等(2014年)从不同环境中分离纯化得到的88株菌株中，筛选得到了对水稻白叶枯病菌具有明显拮抗作用的12号菌株，经形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为Streptomyces gramineus。根据其抑菌圈直径为60.9mm，将其作为微生物农药具有一定的应用价值和开发前景。

近年来，众多学者已陆续筛选获得不同种类的拮抗放线菌，用于防治不同植物病害的报道不胜枚举。

CN101735961A的发明《一种放线菌菌株及其在制备芳香羟胺中的应用》涉及一株放线菌(Streptomyces thioluteus)菌株：CGMCC No.2725及其在还原硝基芳香类化合物获得相应的芳香羟胺类化合物的应用。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St-79及其在水稻白叶枯病害防治及促进水稻种子萌发中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种硫藤黄链霉菌(Streptomycesthioluteus)St-79，保藏编号为CCTCC NO：M 2020962。

本发明还同时提供了上述硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St-79菌株的用途，用于促进水稻种子萌发、防治水稻白叶枯病害、抑制植物病原细菌(菌株发酵滤液能抑制植物病原细菌)。

作为本发明用途的改进：

菌株发酵滤液的稀释液促进水稻种子萌发；菌株发酵滤液能抑制植物病原细菌，稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、大豆细菌性斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestrispv.campestris)。

针对水稻白叶枯病的农药防治日益暴露出来的问题，利用微生物及其次级代谢产物进行水稻白叶枯病的生物防治成为研究方向。本发明旨在提供1株对水稻白叶枯病菌具有高拮抗作用的硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St-79菌株及其用途。

本发明的菌株St-79，保藏名称为硫藤黄链霉菌St-79Streptomyces thioluteusSt-79，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2020962，保藏时间2020年12月24日。

本发明所涉及St-79菌株筛选自金钱松(Pseudolarix amabilis)根际土壤。依据形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为硫藤黄链霉菌(Streptomycesthioluteus)。

硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St-79菌株发酵滤液对水稻白叶枯病菌有显著抑制作用，可以用来防治水稻白叶枯病等。St-79菌株在高氏一号液体培液中发酵6d(温度为28℃)，0.22μm滤膜过滤得到发酵滤液，取200μL牛津杯法测定其对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的抑制作用，抑菌圈直径可达64±1.2mm(图5)。抗菌谱试验结果表明：链霉菌St-79菌株发酵滤液对3种代表性植物病原细菌如水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris pv.campestris)和大豆细菌性斑疹病菌(Xanthomonas axonopodispv.glycines)等有较强的抑制作用(见表3)。盆栽防效试验表明：St-79菌株发酵滤液对水稻白叶枯病的相对防效可达88％以上，病斑抑制率可达96.23％(见表4，图8)。链霉菌St-79菌株可为微生物源农药开发提供优良的菌株，在水稻、大豆、野油菜等作物病害生物防治上有较好的应用前景。

综上，本发明从不同生境土壤中分离得到140株放线菌，经初筛和复筛获得1株对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)具有较强抑制作用的拮抗菌株St-79，该菌株筛选自金钱松(Pseudolarix amabilis)根际土壤。以期为水稻白叶枯病的生物防治提供新的拮抗放线菌资源。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为10株代表性放线菌纯菌株的菌落形态(高氏一号培养基，7d)；

图2为链霉菌St-79菌株的菌落和显微形态特征(高氏一号培养基，7d)；

图3为链霉菌St-79菌株生理生化部分实验结果；

图4为基于16S rDNA序列构建的链霉菌St-79菌株进化树；

图5为链霉菌St-79菌株发酵滤液对水稻白叶枯病菌生长的抑制作用；

图6为链霉菌St-79菌株发酵滤液对水稻白叶枯病菌细胞影响的电镜照片；

图6中，A：磷酸缓冲液处理；B：链霉菌St-79菌株发酵滤液处理；

图7为链霉菌St-79菌株的抗菌谱；

图8为链霉菌St-79发酵滤液对水稻白叶枯病的防效实验结果；

图8中，A、B、C代表实验的三个重复；

CK₁：空白对照组；CK₂：Xoo处理对照；T₁：接种Xoo病菌6h后喷洒稀释4倍的St-79菌株发酵滤液；T₂：接种Xoo病菌6h后喷洒稀释5倍的St-79菌株发酵滤液；T₃：接种Xoo病菌6h后喷洒稀释6倍的St-79菌株发酵滤液；T₄：剪叶后喷洒稀释4倍的St-79菌株发酵滤液，6h后接种Xoo病菌；

图9为链霉菌St-79发酵滤液对水稻种子萌发的影响。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St-79菌株的筛选和鉴定

1菌株

(1)放线菌菌株：来自不同生境的土壤中分离、纯化、筛选和鉴定，保藏放线菌菌株。

(2)水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo，以下均缩写为Xoo)可由本实验室提供保藏。

2培养基

(1)高氏一号固体培养基：可溶性淀粉20g、KNO₃ 1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、NaCl 0.5g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、琼脂20g，水1000mL，pH 7.4。用于放线菌菌株的分离纯化和鉴定。

(2)高氏一号液体培养基：不加琼脂，其余配方同(1)，用于放线菌菌株的液体发酵培养。

(3)NA培养基：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.2。用于Xoo病菌的培养。

(4)NA液体培养基：不加琼脂，其余配方同(3)，用于Xoo的活化。

3实验方法

3.1放线菌菌株的分离纯化和保藏

用土壤梯度稀释涂布法分离。取干燥土样1g于99mL无菌水中，120r/min摇床上振荡30min。上清液进行梯度稀释(10^-2～10^-5)，选择合适的浓度(10^-4)取100μL均匀涂布于含50μg/mL重铬酸钾的高氏一号培养基平板上，28℃恒温箱培养7d，直到出现菌落。挑取具有典型放线菌菌落特征的单菌落转接到另一高氏一号培养基平板上，经3次划线纯化，得纯菌株。将纯菌株编号，置于4℃冰箱中保存，备用。

3.2拮抗Xoo放线菌菌株的筛选

3.2.1共培养法初筛

将Xoo接种于NA液体培养基中，摇床活化培养(160r/min、28℃)至OD600＝0.6时，取100μL菌液均匀涂布于NA培养基上制成含菌平板，备用。将采集到的放线菌菌株分别划线接种于高氏一号培养基平板上，28℃恒温培养4d，用无菌打孔器取直径为5mm的放线菌菌饼，放置于含Xoo的平板中间，28℃培养48h，观察抑菌圈。根据抑菌圈有无和大小初步筛选有拮抗作用的放线菌菌株，并用25％甘油保藏。

3.2.2牛津杯法复筛

(1)放线菌菌株的发酵培养：将有拮抗作用的放线菌接种到高氏一号培养基平板中，28℃培养3d，用直径5mm的无菌打孔器在放线菌平板上打孔取菌块，接种至装有50mL高氏一号液体培养液的250mL三角瓶中，于160r/min、28℃摇床培养6d后，将50mL发酵液12000r/min离心10min后，过0.22μm滤膜，获得发酵滤液备用。

(2)Xoo的培养：将Xoo接种于NA液体培养基中，摇床活化培养(160r/min、28℃)，当菌密度达到OD₆₀₀＝0.6时，取100μL菌液均匀涂布于NA固体培养基上。

取200μL放线菌菌株的发酵滤液，用牛津杯法测定各放线菌菌株发酵液对Xoo的抑制作用。根据抑菌圈大小选择出拮抗作用较强的放线菌菌株---St-79菌株。

3.2.3目标菌株发酵滤液处理后Xoo细胞形态变化的扫描电镜观察

(1)Xoo的培养：将Xoo接种于NA液体培养基中，摇床活化培养(160r/min、28℃)至菌密度为OD₆₀₀＝0.6。

(2)放线菌菌株的发酵培养：用3.2.2(1)的方法获得有拮抗作用放线菌的发酵滤液。

(3)扫描电镜观察：将1mL发酵滤液与9mLXoo菌液共同摇床培养4h(160r/min、28℃)，以加磷酸缓冲液处理的Xoo菌液为对照组，4h后12000r/min离心10min收集菌体。将收集的菌体用磷酸缓冲液轻轻冲洗3次，用2.5％戊二醛于4℃冰箱中固定过夜后，再用磷酸缓冲液浸泡清洗三次，每次10分钟；用30％、50％、70％、80％、90％、95％乙醇梯度脱水各一次，100％乙醇脱水2次，每次各15min；用叔丁醇浸泡三次，每次10分钟，然后放入真空冷冻干燥仪中抽真空干燥；样品喷金后进行扫描电镜观察。

3.3拮抗Xoo链霉菌St-79菌株的鉴定

3.3.1形态特征观察

取St-79菌株1菌饼(直径5mm)，接于高氏一号培养基平板上活化培养3d；取1菌饼(直径5mm)转接种于新的高氏一号培养基平板上，28℃培养7d，观察菌落大小、形态、质地、表面、色泽等特征。用插片法和埋片法培养St-79菌株，光学显微镜下观察St-79菌株的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝等形态特征，并拍照。

3.3.2生理生化特征实验

对St-79菌株进行淀粉水解、明胶液化、碳源氮源的利用等生理生化试验。

3.3.3 16S rDNA序列分析

提取St-79菌株的基因组DNA，扩增16S rDNA序列，送上海生物工程公司测序。将测序得到的16S rDNA序列提交至GenBank并利用BLAST比对后进行分析，采用MEGA-X软件中Neighbor-Joining法构建***发育树确定所属的放线菌种类。

4实验结果

4.1放线菌纯菌株的获得

通过分离纯化从不同生境土壤样品中分离纯化共获140株放线菌纯菌株，10株代表性放线菌纯菌株的在高氏一号培养基培养7d的菌落如图1所示。

4.2拮抗Xoo放线菌菌株的筛选

利用共培养法和牛津杯法对140株放线菌菌株进行Xoo抑制效果的初筛和复筛，不同放线菌菌株抑制Xoo作用存在较大差异。经筛选获得1株拮抗水稻白叶枯病菌效果较好的放线菌菌株，编号为St-79菌株，牛津杯法测定的抑菌圈直径达64±1.2mm(图5)，St-79菌株分离于金钱松(Pseudolarix amabilis)根际土壤。

4.3St-79菌株发酵滤液处理后Xoo细胞形态的变化

扫描电镜观察结果表明：链霉菌St-79菌株发酵滤液处理Xoo细胞后，Xoo细胞内含物外漏，菌体被溶解，进一步表明链霉菌St-79菌株发酵滤液对Xoo细胞有强烈的致死作用(图6)。

4.4St-79菌株的鉴定结果

St-79菌株形态特征：高氏一号培养基上28℃培养7d，菌落较大、呈粉红色，表面呈丝绒状；气生菌丝分化形成孢子丝，孢子丝呈一级或二级轮生(图2)。

生理生化试验结果表明：St-79菌株能水解淀粉、纤维素、脂肪、明胶(表1、图3)；可利用多种碳源，利用效果较佳的是葡萄糖、甘露醇、乳糖等(表2)；可利用多种氮源，较佳氮源是蛋白胨、(NH4)₂SO₄、赖氨酸、组氨酸；适宜酸碱度是pH 7.3，最适转速为160r/min，适宜培养温度是28℃。

表1、链霉菌St-79菌株生理生化试验结果

注：+++表示能力强，++表示能力中，+表示能力较弱，-表示无。

表2、链霉菌St-79菌株碳源、氮源利用试验结果

注：+++表示生长旺盛，++表示生长良好，+表示生长一般，-表示不生长。

16S rDNA序列分析核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。

与硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)的进化距离最近(图4)，相似性达99.9％。根据St-79菌株的形态特征、生理生化试验结果和16S rDNA序列分析，结合链霉菌属(Streptomyces)分种检索表和进化树分析，将St-79菌株鉴定为硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)。

本发明的菌株St-79的保藏信息如下：保藏名称为硫藤黄链霉菌St-79Streptomyces thioluteus St-79，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2020962，保藏时间2020年12月24日。

实施例2、硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St-79菌株抗菌谱测定

1菌株

(1)硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St-79菌株。

(2)4种代表性植物病原细菌：如水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)、番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)、大豆细菌性斑疹病菌(Xanthomonasaxonopodis pv.glycines)4种代表性植物病原细菌(见表3)，用于St-79菌株发酵滤液抗细菌谱测定。

2培养基

(1)NA液体培养基：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、水1000mL、pH 7.2(NA固体培养基加琼脂20g)。用于植物病原细菌的培养。

(2)高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g、KNO₃ 1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、NaCl 0.5g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、水1000mL，pH 7.2～7.4。用于St-79菌株的种子液和发酵液培养。

3实验方法

3.1St-79菌株的培养和发酵滤液的制备

用打孔器取St-79菌株1菌饼(直径5mm)，接种于高氏一号液体培养基中，装液量50/250mL、初始pH 7.3，160r/min，28℃恒温摇床培养72h，作为种子液。按照4％接种量将种子液接种于高氏一号液体培养基中，摇床发酵培养6d，得到St-79菌株发酵液。将其置于50mL离心管中12000r/min离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤，除去残余孢子，得到发酵滤液，备用。

3.2植物病原细菌的活化

将保藏于4℃的4种病原细菌分别接种于NA固体培养基中，于28℃活化培养2d。然后转接于新的NA固体培养基上于28℃培养2d，用于细菌抗菌谱测定。

3.3St-79菌株抗细菌谱的测定

将已经活化培养的4种植物病原细菌分别接种于NA液体培养基中，摇床培养(160r/min、28℃)，当菌密度达到OD₆₀₀＝0.6时，取100μL菌液均匀涂布于NA固体培养基上。另取200μLSt-79菌株的发酵滤液，用牛津杯法测定St-79发酵滤液对4种植物病原细菌的抑制作用。

4实验结果

对4种代表性植物病原细菌抗菌谱测定结果表明：链霉菌St-79菌株发酵滤液对3种植物病原细菌水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、大豆细菌性斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris pv.campestris)均有较强的抑制作用(见表3、图7)；对番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)抑制作用较弱。

表3链霉菌St-79菌株发酵滤液对4种代表性植物病原细菌的抑制效果

注：不同小写字母表示在P<0.05水平存在显著差异

实施例3、链霉菌St-79菌株发酵滤液对水稻白叶枯病的防效研究

1病菌和水稻品种

(1)用于防效的放线菌：硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St-79菌株。

(2)病原菌：水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)

(3)水稻品种：选用对水稻白叶枯病易感的甬优1540品种。

2培养基

(1)高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g、KNO₃ 1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、NaCl 0.5g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、水1000mL，pH 7.4(固体培养基加琼脂20g)，用于St-79菌株的培养发酵滤液制备。

(2)NA固体培养基：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.2(液体培养基不加琼脂)。用于Xoo病菌的培养。

3实验方法

3.1水稻的培育

将大小均一饱满的水稻种子于75％酒精中表面消毒15min，无菌水冲洗5次以上，将种子放在湿润的纸巾上，置于25℃培养箱中直到种子发芽，将发芽的种子播种到土壤中，置于培养箱培养至水稻叶片长度超过20cm，备用。培养条件：光照16h、温度30℃，黑暗8h、温度25℃，湿度65％，两天浇一次水，一周喷营养液一次。

3.2 Xoo病菌的培养

将保藏于4℃的Xoo病菌接种于NA培养基平板上，于28℃活化培养3d；挑取单菌落接入至有3mL NA液体基的10mL试管中，活化至OD₆₀₀＝0.6；取1mL菌液加入至100mL NA液体培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6；取Xoo病菌NA培养液，12000r/min离心5min，去上清加入无菌水，配制成OD₆₀₀＝0.6的Xoo病菌清水悬液，用于防效试验。

3.3 St-79菌株发酵滤液的制备

用打孔器取St-79菌株1菌饼(直径5mm)，接种于高氏一号培养液中，装液量50/250mL、初始pH 7.3，160r/min，28℃恒温摇床培养72h，作为种子液。按照4％接种量将种子液接种于高氏一号液体培养基中，摇床发酵培养6d，得到St-79菌株发酵液。将其置于50mL离心管中12000r/min离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤，除去残余孢子，得到发酵滤液。用无菌水稀释发酵滤液至原液的4倍、5倍、6倍备用。

3.4盆栽防效初步研究

(1)无菌水空白对照组(CK₁)：无菌剪刀45°剪叶，并时刻保持接种处湿润，不做其他处理；

(2)Xoo处理对照(CK₂)：无菌剪刀蘸取OD₆₀₀＝0.6的Xoo病菌清水悬液后剪叶，并使接种部分时刻保持湿润，不做其他处理；

(3)处理1(T₁)：无菌剪刀蘸取OD₆₀₀＝0.6的Xoo病菌清水悬液剪叶接种6h后，喷洒稀释4倍的St-79菌株发酵滤液(发酵滤液喷至液体从叶片滴落，共喷洒3次，每次间隔1h，下同)，并对接种部位做好保湿措施；

(4)处理2(T₂)，无菌剪刀蘸取OD₆₀₀＝0.6的Xoo病菌清水悬液剪叶接种6h后，喷撒稀释5倍的St-79菌株发酵滤液，并对接种部位做好保湿措施；

(5)处理3(T₃)，无菌剪刀蘸取OD₆₀₀＝0.6的Xoo病菌清水悬液剪叶接种6h后，喷撒稀释6倍的St-79菌株发酵滤液，并对接种部位做好保湿措施；

(6)处理4(T₄)：无菌剪刀45°剪叶后立即喷洒稀释4倍的St-79菌株发酵滤液，6h后用无菌棉棒接种OD₆₀₀＝0.6的Xoo病菌清水悬液至叶片伤口处，并对接种部位做好保湿措施。

以上各组处理后均保湿12h，每个处理6株，每株5片叶(同位叶)，每个处理重复3次。

待病情发展趋于稳定后，记录并统计发病情况。以叶片为单位调查病情，水稻白叶枯病病情分0～9级标准如下：

0级：剪口处无病斑；

1级：病斑面积为叶面积10％以下；

3级：病斑面积为叶面积11％～25％；

5级：病斑面积为叶面积26％～45％；

7级：病斑面积为叶面积46％～65％；

9级：病斑面积为叶面积65％以上。

根据病害严重程度，按以下公式计算病情指数及防治效果：

病情指数＝∑(各级病叶数×相应级数值)/(调查总叶数×最高级代表值)×100

相对防治效果(％)＝[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]×100

病斑抑制率＝(CK₂病斑长度-处理病斑长度)/CK₂病斑长度×100

4实验结果

实验结果如表4(图8)所示：St-79菌株发酵滤液处理可显著降低水稻白叶枯病的病情指数。处理1(T₁)对水稻白叶枯病的相对防效为82.49％，病斑抑制率为84.92％；处理2(T₂)对水稻白叶枯病的相对防效为73.94％，病斑抑制率为78.75％；处理3(T₃)对水稻白叶枯病的相对防效为67.32％，病斑抑制率为72.54％；处理4(T₄)对水稻白叶枯病的相对防效为88.32％，病斑抑制率为96.23％，具有较好的防治效果。从处理1(T₁)、处理2(T₂)、处理3(T₃)防效结果可看出，St-79菌株发酵滤液浓度越高，防治效果越好。实验结果还表明先喷St-79菌株发酵滤液防治效果优于先接种Xoo病菌再喷发酵滤液，即对水稻白叶枯病的防治效果预防效果优于治疗效果。

表4链霉菌St-79菌株发酵滤液对水稻白叶枯病的相对防效

注：不同小写字母表示在P<0.05水平存在显著差异

实施例4、链霉菌St-79菌株发酵滤液对水稻种子萌发的影响

1水稻品种：甬优1540品种。

2培养基

高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g、KNO₃ 1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、水1000mL，pH 7.4(固体培养基加琼脂20g)，用于St-79菌株的培养和发酵滤液制备。

3实验方法

3.1 St-79菌株发酵滤液的制备

用打孔器取St-79菌株1菌饼(直径5mm)，接种于高氏一号培养液中，装液量50/250mL、初始pH 7.3，160r/min，28℃恒温摇床培养72h，作为种子液。按照4％接种量将种子液接种于高氏一号液体培养基中，摇床发酵培养6d，得到St-79菌株发酵液。将其置于50mL离心管中12000r/min离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤，除去残余孢子，得到发酵滤液。

将发酵滤液用无菌水稀释10倍(1/10)、50倍(1/50)、100倍(1/100)、500倍(1/500)置于4℃冰箱备用。

3.2水稻种子催芽处理

挑选饱满的水稻种子，于28℃下用无菌水浸种催芽24h。

3.3发酵滤液浸种处理对水稻种子萌发的影响

用发酵滤液原液及其无菌水稀释的10倍(1/10)、50倍(1/50)、100倍(1/100)、500倍(1/500)溶液分别对催芽后的水稻种子进行浸种处理；以无菌水对高氏一号培养液作上述倍数稀释为对照(CK₁)；以无菌水处理作为两者的共同对照(CK₂)，每个处理3次重复，每次重复50粒种子。将种子放入培养皿中，培养皿中分别加入各处理液20mL，每隔2d更换1次对应的处理液，自种子浸种之日起每天观察种子发芽情况，以种子露白作为发芽标准。

种子萌发率＝(水稻发芽种子数/供试水稻种子总数)×100。

4实验结果

链霉菌St-79菌株发酵滤液对水稻种子萌发率的影响实验结果如表5(图9)所示，发酵滤液原液和培养基原液处理组都没有种子萌发。在所有稀释倍数中，1/100倍发酵滤液处理的种子萌发率最高，并显著高于1/100倍高氏一号培养液处理(P<0.05)；无菌水稀释的发酵滤液浸种的水稻种子萌发率比同样稀释倍数的高氏一号培养液浸种的水稻种子萌发率高；1/50倍、1/100倍、1/500倍发酵滤液浸种的水稻种子萌发率都显著高于无菌水浸种后的种子(P<0.05)。

表5链霉菌St-79菌株发酵滤液对水稻种子萌发率的影响(％)

注：不同小写字母表示在P<0.05水平存在显著差异

说明：12号菌株(张艳军等2014年)按照实施例2所述实验方法进行植物病原细菌的抑制实验，所得结果为：野油菜黄单胞菌、大豆细菌性斑疹病菌的抑菌圈均小于10mm。CGMCC No.2725的植物病原细菌的抑制实验效果甚至不如12号菌株。

12号菌株(张艳军等2014年)按照实施例4所述实验方法进行菌株发酵滤液对水稻种子萌发率实验，所得结果为：处理10天，1/50发酵滤液、1/100发酵滤液、1/500发酵滤液与H₂O不存在显著差异。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江师范大学

<120> 硫藤黄链霉菌St-79及其用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccttcggggt ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg ccctgcactc 60

tgggacaagc cctggaaacg gggtctaata ccggatatga ccttcgagcg catgcttgaa 120

ggtggaaagc tccggcggtg caggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt ggtggggtga 180

tggcctacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cactgggact 240

gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa 300

gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac ctctttcagc 360

agggaagaag cgaaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta cgtgccagca 420

gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agagctcgta 480

ggcggcttgt cgcgtcggat gtgaaagccc ggggcttaac cccgggtctg cattcgatac 540

gggcaggcta gagttcggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag 600

atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccgatactga cgctgaggag 660

cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgttggg 720

aactaggtgt gggcgacatt ccacgtcgtc cgtgccgcag ctaacgcatt aagttccccg 780

cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagca 840

gcggagcatg tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct tgacatacac 900

cggaaacggc cagagatggt cgcccccttg tggtcggtgt acaggtggtg catggctgtc 960

gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcctgt 1020

gttgccagca tgcccttcgg ggtgatgggg actcacagga gactgccggg gtcaactcgg 1080

aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg tcttgggctg cacacgtgct 1140

acaatggccg gtacaatgag ctgcgatacc gcgaggtgga gcgaatctca aaaagccggt 1200

ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt tggagttgct agtaatcgca 1260

gatcagcatt gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacgtcac 1320

gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc 1350

Claims

1.硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St-79，其特征是：保藏编号为CCTCC NO：M 2020962。

2.如权利要求1所述的硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)St-79菌株的用途，其特征是：促进水稻种子萌发。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征是：防治水稻白叶枯病害。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征是：菌株发酵滤液的稀释液促进水稻种子萌发。

5.根据权利要求2～4任一所述的用途，其特征是：抑制植物病原细菌。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征是：所述植物病原细菌为：水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、大豆细菌性斑疹病菌(Xanthomonas axonopodispv.glycines)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)。