CN111996140B - 水牛瘤胃源解淀粉芽胞杆菌的筛选及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业微生物应用技术领域，涉及水牛瘤胃源解淀粉芽胞杆菌的筛选及其应用。本发明与饲料添加剂制剂制备领域和反刍动物瘤胃消化开发利用领域相关。涉及一种对饲料中纤维素有降解作用的解淀粉芽胞杆菌的菌株分离鉴定、安全性评定及对青贮饲料纤维降解能力的鉴定以及作为促进饲料青贮发酵添加剂的开发和应用。本发明的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SN‑C菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2020137。所述菌株具有生长速度快，能显著提高玉米青贮饲料中纤维素降解率，与对照组相比能降低3.10％的纤维素和1.75％半纤维素含量，抗逆性强,安全，可制备促进青贮发酵添加剂。

Description

水牛瘤胃源解淀粉芽胞杆菌的筛选及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物应用技术领域，具体涉及水牛瘤胃源解淀粉芽胞杆菌的筛选及其应用。本发明的领域与饲料添加剂制剂制备领域和反刍动物瘤胃消化生物添加剂领域相关，本发明提供了一种对饲料中纤维素有降解作用的解淀粉芽胞杆菌的菌株的分离鉴定、安全性评定及对青贮饲料纤维降解能力的鉴定，可以作为为促进饲料青贮发酵添加剂的开发与利用。
背景技术
我国是农业大国，农业副产品秸秆年产量约6.3亿吨，而每年用作草食动物饲料的秸秆量仅占总产量的15％～24％，高达70％以上的秸秆被闲置或焚烧，造成巨大的浪费和环境污染。在反刍动物饲料主要以玉米、稻草、小麦秸秆等木质化高的粗饲料为主，即使是在肉牛饲养中，玉米秸秆、稻草秸秆等粗饲料占比也不低于50％。秸秆富含纤维素缺少蛋白质、且木质化程度高、适口性差，不利于动物的消化吸收，即使是消化能力较高的反刍动物如牛，也只能消化利用食物中一半左右的纤维素，也就是说反刍动物饲料中近一半量的纤维素没有得到有效利用。可见，反刍动物粗饲料中纤维素的利用效率还有50％的提升空间，对纤维素利用有改进的新型菌株将会创造巨大的经济效益和社会效益。
为了最大限度保鲜和利用秸秆，人们采用青贮发酵的方法来处理新鲜秸秆。青贮发酵产生小分子糖类、乳酸等能提高秸秆的适口性，青贮还有利于分解秸秆中的纤维素，提高饲料的消化率。然而，天然的青贮过程，纤维素的分解是有限的，为了提高青贮效果，人们发展出青贮添加剂。青贮添加剂主要分三大类：细菌制剂(如植物乳杆菌、芽胞杆菌等)、化学添加剂(如甲酸、山梨酸、苯甲酸等)和酶制剂(纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶等)(MuckR.E.etal，2018)。实践证明青贮添加剂是有效的，Zahiroddin将纤维素酶与淀粉酶混合制剂加入大麦青贮饲料中，用该青贮饲料饲喂牛，牛的日增重有显著提高(ZahiroddinH.i，2004)。Li等将能产生阿魏酸酯酶的植物乳杆菌和纤维素酶作为青贮添加剂，加入玉米青贮中，发现该植物乳杆菌与纤维素酶能够降低饲料中纤维的含量(Li etal，2019)。郭海明等报道同时添加青贮菌、纤维分解酶和碳源能更好地提升稻秸青贮品质。
反刍动物瘤胃微生物能分解植物细胞壁中的部分纤维素供自身繁殖，同时产生大量短链脂肪酸供宿主利用，当其到达宿主消化道后段时，又成为宿主主要的蛋白质营养来源。虽然瘤胃是严格厌氧环境，许多细菌在体外环境中不容易被分离，但有些细菌在体外仍能生长(ChristopherJ.etal，2014)。
虽然牛瘤胃都能利用粗饲料，但不同品种的牛对于饲料消化效率是不同的。有研究表明，水牛相比其他品种的牛而言，具有更强的耐粗性。Chanthakhoun发现水牛瘤胃对于木质纤维素的降解更强，并且水牛瘤胃中木质纤维素分解细菌数量明显高于肉牛(ChanthakhounaV.etal，2012)。
发明内容
本发明的目的是针对现有青贮饲料发酵中纤维素降解不足的问题，本发明受水牛耐粗饲料及水牛瘤胃对于木质纤维素的降解更强的启发，从水牛瘤胃中筛选降解纤维素能力强的菌株，筛选得到一株能显著提高玉米青贮饲料中纤维素降解率(与对照组相比能降低3.10％的纤维素含量和降低1.75％半纤维素含量)的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，本发明筛选得到的纤维素酶活性高的菌株可用于提高青贮饲料发酵中纤维素的降解率。经过纤维素碳源筛选方案优化，并对其进行了安全性检测，主要进行了毒力基因的检测、常用抗菌药物敏感试验、试验动物饲喂试验。针对芽胞杆菌常见的毒力基因：非溶血性肠毒素NHE(nheA、nheB、nheC)、溶血素Hbl(hblA、hblC、hblD)、细胞毒素CytK、肠毒素T(BceT)和肠毒素FM(EntFM)进行检测，结果发现解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株仅含有nheA和nheC两个毒力基因；且药敏试验表明该菌株对常用的青霉素类、头孢类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类等抗生素均十分敏感，不存在散布耐药基因的问题。小鼠饲喂试验也进一步证实该菌株安全无毒。
申请人将筛选得到的一株解淀粉芽胞杆菌，命名为解淀粉芽胞杆菌SN-C,Bacillus amyloliquefaciens SN-C，该菌株已于2020年5月21日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2020137。
附图说明
图1：本发明初筛瘤胃液培养物在羧甲基纤维素钠唯一碳源平板上的生长状态。附图标记说明：瘤胃液培养物呈现表面湿润光滑，针尖大小，菌落为白色。
图2：是本发明筛选的解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株产纤维素酶的检测结果。附图标记说明：图2中标记为C的即为筛选到的解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株。
图3：是本发明筛选的解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株在含纤维素酶驯化培养基平板上生长状态。附图标记说明：解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株菌圈直径为3-4mm，外观白色，不透明，表面干燥平整，边缘呈毛刺状。
图4：本发明分离筛选的解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株革兰氏染色阳性反应(×1000)。
图5：本发明的解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株16S rDNA基因PCR扩增检测结果的电泳图。
图5中各泳道说明：M：2000bp Marker；泳道1、泳道2：解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株；
图6：本发明的解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株的生长曲线。
图7：蜡样芽胞杆菌毒力基因扩增阳性结果的电泳图。
图7中各泳道说明：M：2000bp Marker；泳道1：nheA；泳道2：nheB；泳道3：nheC；泳道4：EntFM；泳道5：hblA；泳道6：hblC；泳道7：hblD；泳道8：CytK；泳道9：BceT；泳道10：阴性对照。
图8：解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株毒力基因扩增结果的电泳图。附图标记说明：
图8A：解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株nheA毒力基因扩增结果的电泳图。
图8A中各泳道说明：M：2000bp Marker；泳道1：nheA阳性对照；泳道2：解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株；泳道3：阴性对照；
图8B：解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株nheC毒力基因扩增结果的电泳图。
图8B中各泳道说明：M：2000bp Marker；泳道1：nheC阳性对照；泳道2：解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株；泳道3：阴性对照。
图9：解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株药敏试验结果。附图标记说明：
图9A、图9B：解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株药敏试验结果。图9A：左上：复方新诺明，左下：呋喃妥因；右下：克林霉素。
图9B：左上：卡那霉素，左下：四环素；右下：庆大霉素。
图10：添加解淀粉芽胞杆菌SN-C菌液玉米微量青贮试验结果。
图10A、图10B为添加解淀粉芽胞杆菌SN-C菌液的玉米微量青贮试验。
图11：添加解淀粉芽胞杆菌SN-C菌液玉米微量青贮试验部分操作及材料。
图11A；利用滤袋法测定添加解淀粉芽胞杆菌SN-C菌液的青贮玉米粗纤维样品粉碎。
图11B：利用滤袋法测定饲料粗纤维所用滤袋。
图12：添加淀粉芽胞杆菌SN-C菌液的青贮玉米中性洗涤纤维(NDF)测定步骤(用中性洗涤剂消煮)。
图13：分别添加SN-C、A、E、CO4菌株的青贮玉米，中性洗涤纤维(NDF)测定结果，其中：A、E、CO4为同期分离到的其它菌株，纵坐标为中性洗涤纤维NDF占干物质含量百分比，横坐标为菌株种类。
图14：分别添加SN-C、A、E、CO4菌株青贮玉米酸性洗涤纤维(ADF)测定结果，纵坐标为ADF占干物质含量百分比，横坐标为菌株种类。
图15：分别添加SN-C、A、E、CO4菌株青贮玉米纤维素测定结果，纵坐标为纤维素占干物质含量百分比，横坐标为菌株种类。
图16：分别添加SN-C、A、E、CO4菌株青贮玉米半纤维素测定结果，纵坐标为半纤维素占干物质含量百分比，横坐标为菌株种类。
具体实施方式
对序列表的说明：
SEQ ID NO:1是本发明的解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株的16S rDNA基因序列。
实施例1：菌株的分离和鉴定
一、培养基的配制：
表1缓冲液A
Figure BDA0002635553600000041
注：此缓冲液用于配制富集培养基。
表2缓冲液B
Figure BDA0002635553600000042
注：此缓冲液用于配制富集培养基。
表3富集培养基
Figure BDA0002635553600000043
Figure BDA0002635553600000051
注：刃天青为蓝色，灭菌后培养基的颜色会变成粉红色，培养基中不含氧气时溶液呈无色。
按照表4配方配制抗真菌剂，配制完成后用0.45μm滤器过滤除菌，分装为1.0mL，置于4℃保存。
表4抗真菌剂的配置
Figure BDA0002635553600000052
注：放线菌酮为剧毒品，抑制酵母菌、霉菌和原虫；制霉菌素所用溶剂为DMSO，取少量DMSO溶解后再与剩下的溶液混合。
取用配置好的抗真菌剂以1/100比例(10μL加入1mL)加入7.0mL富集培养基中(此时富集培养基并未进行驱除氧气处理，粉红色)。
表5利用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为唯一碳源的平板
Figure BDA0002635553600000053
注：此平板用于瘤胃细菌样品培养，将瘤胃细菌样品稀释后在此培养基上涂布或划线分离培养。
表6纤维素酶鉴别平板
Figure BDA0002635553600000054
注：此平板用于纤维素酶产生菌株的鉴定；产生纤维素酶的菌株点接与该平板上培养2-3d后，经由0.1％刚果红染色液染色，用1.0mol/L NaCl溶液洗涤后会产生淡黄色的水解圈。
表7纤维素酶驯化培养基(体积1.0L)
Figure BDA0002635553600000061
注：用于驯化培养点样鉴别产生水解环的菌株。
0.1％刚果红染色液：用精度万分之一分析天平称量0.1g刚果红粉末，溶于100mL蒸馏水中，室温密封保存；
1.0mol/L NaCl溶液：用精度万分之一分析天平称量5.85g NaCl，溶于100mL蒸馏水中，室温密封保存；
瘤胃样品采集：
材料准备：350mL(三菱MGC，日本)厌氧产气袋，10.0mL灭菌EP管，灭菌纱布(四层)，39℃恒温培养箱(车载)，医用消毒酒精，大、小号自封袋。
采样点为荆州市沙洋县湖北劲牛牧业有限公司，3头健康的安装有瘤胃瘘管的水牛。
采样方法：于清晨饲喂之前进行第一次采样，戴好防护手套和防护服，酒精消毒后，打开瘤胃瘘管，将瘘管塞子浸泡于约80℃的热水中消毒，然后取部分瘤胃内容物用四层纱布过滤后，将滤液接收于10mL灭菌EP管，取1.0mL滤液及少量瘤胃内容物于7.0mL的富集培养基中，盖上后用封口膜封口后，置于EP管架上，将管架和厌氧产气袋一同装入大号自封袋后密封，置于39℃车载小型恒温箱中培养带回试验室。
无细胞瘤胃液的采集：取瘤胃内容物包进四层纱布后挤压出瘤胃液，用大号自封袋装存，置于冰上存储。回试验室后用四层纱布再次过滤后，10000rpm/min离心10min，取上清即为无细胞瘤胃液，置于-20℃冻存。(此瘤胃液用于配制培养基，在培养基中会进行灭菌处理，因此-20℃保存不必除菌，无细胞瘤胃液加入培养基主要使外部培养基更接近瘤胃真实情况)
二、菌株的分离
将采集后的样品置于39℃厌氧培养箱中培养1d后，取样品10-1-10-6倍比稀释(取100μL培养液加入900μL灭菌水中进行倍比稀释)，用10-4、10-5、10-6三个稀释度涂布羧甲基纤维素钠唯一碳源平板，置于39℃厌氧箱中培养3d后挑取单菌落，菌株生长结果见图1；
用10.0μL灭菌枪头挑取羧甲基纤维素钠唯一碳源平板上的疑似单菌落，刺接到纤维素酶点样平板上，置于39℃厌氧箱中培养3d，随后用0.1％刚果红染色液(每个直径9cm的细菌培养皿中滴加1.0-1.5mL染色液，保证染色液覆盖平板一薄层，不能浸没菌苔)染色10-15min，再用1.0mol/L NaCl溶液洗涤2次，观察是否产生淡黄色水解圈，菌株刚果红染色结果见图2和表8；
表8菌株染色圈直径
Figure BDA0002635553600000071
用灭菌的1.0mL枪头挑取产生淡黄色水解圈的菌苔在纤维素酶驯化平板上进行三次划线纯化，置于39℃厌氧箱中培养3d，SN-C在纤维素酶驯化平板划线纯化生长状态见图3(单菌落形态为3-4mm直径，白色、不透明，表面干燥有皱褶，边缘呈毛刺状)；
经过菌株的鉴定，一共得到4株产生淡黄色水解圈的菌株，经由革兰氏染色鉴定均为革兰氏阳性菌，其革兰氏染色特性见图4。申请人将其命名为A、SN-C、E、CO4；菌株C呈现两端钝圆、短杆状、蓝紫色染色特性。
三、菌株种属的鉴别
在上述鉴定的基础上，进一步对上述分离菌株SN-C进行16S rDNA基因序列检测和种特异性基因检测，对菌株所属的种进行确证鉴定。
(一)分离株基因组提取：
(1)取1mL培养菌液，10000rpm离心30s，尽可能的吸弃上清，收集菌体。
(2)加入200μL缓冲液RB重悬，10000rpm离心30s，弃上清。
(3)加入120μL溶菌酶(20mg/mL in 10mM Tris-HCl，pH 8.0)颠倒混匀，37℃温育30-60min。12000rpm离心2min，弃上清后吹打重悬于180μL缓冲液RB中。
(4)加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB，立即涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min。
(5)冷却后加入100μL异丙醇，立即涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
(6)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。
(7)加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。
(8)加入700μL漂洗液WB(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉废液。
(9)加入500μL漂洗液WB(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉废液。
(10)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(11)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在67-70℃水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
(12)DNA贮存于-20℃贮存备用。
(二)16S rDNA基因的扩增：
用16S rDNA通用引物扩增分离株16S rDNA序列，引物由武汉天一辉远生物技术有限公司合成，引物的DNA序列如下：
正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，
反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
表9 16S rDNA序列扩增PCR体系
Figure BDA0002635553600000081
扩增条件：95℃预变性5min，95℃50s，55℃35s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。取PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳检测，扩增的片段大小与预期相符，约1500个碱基对(见图5)
(二)细菌进化树分析：
将扩增得到的16S rDNA送武汉擎科生物有限公司进行测序，测序结果在NCBI进行Blast，选取并下载前十个同源性高的菌株序列，用MEGA7.0软件构建细菌***进化树，得到菌株SN-C与多株解淀粉芽胞杆菌序列同源性达99％。一般16S rDNA序列相似度达到97％即可认为两株菌是同一种的微生物，相似度达到95％即可认为是同一属的微生物，经由16SrDNA测序结果构建***进化树分析得知，确定本发明分离的菌株SN-C为解淀粉芽胞杆菌菌株。
申请人将所得的菌株SN-C命名为解淀粉芽胞杆菌SN-C，Bacillusamyloliquefaciens SN-C，于2020年5月21日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2020137。
四、解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株生长曲线测定
将活化好的解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株按1％(v/v)的接种量接入LB中，37℃200rpm/min摇床培养，每隔2h取样测定OD600；以时间为横坐标，细菌的OD600为纵坐标绘制生长曲线。
结果表明，本发明分离的SN-C生长迟缓期约1h，很快进入对数增长期(0h～4h)，8h后进入稳定期，细菌数可达1011-1012CFU/mL。该菌株繁殖能力很强，有利于工业化的大规模发酵生产，其生长曲线见图6和表10。
表10解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株在不同时间的生长情况
Figure BDA0002635553600000091
五、解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株菌株的冻存
将SN-C(鉴别具有纤维素降解能力的单菌落)菌液，转接到纤维素酶驯化培养基中，置于39℃厌氧箱中培养36h后，按V菌液:V甘油＝3:2加50％甘油配置成1.0mL于1.5mL EP管中密封，标记日期时间和菌种后，置-80℃冻存。
实施例2：解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株的安全性评价
一、毒力基因扩增(一)毒力基因阳性菌株鉴定
取用非溶血性肠毒素NHE(nheA、nheB、nheC)、溶血素Hbl(hblA、hblC、hblD)、细胞毒素CytK、肠毒素T(BceT)和肠毒素FM(EntFM)基因引物，对毒力基因阳性蜡样芽胞杆菌进行扩增，检测其所含毒力基因，用1％琼脂糖凝胶电泳(120V，90mA)，毒力基因阳性鉴定为所给蜡样芽胞杆菌含有nheA、nheB、nheC、EntFM、hblA、hblC、hblD、CytK、BceT共9个毒力基因；基因引物序列见表11，扩增结果见图7。
表11毒力基因PCR引物序列
Figure BDA0002635553600000101
(二)解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株毒力基因扩增
选用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司生产)，提取解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株及蜡样芽胞杆菌(毒力基因阳性对照菌株)的基因组，用nheA、nheB、nheC、hblA、hblB、hblC、hblD、CytK、BceT毒力基因引物，对SN-C的毒力基因种类进行扩增鉴定。
表12毒力基因PCR扩增体系
Figure BDA0002635553600000111
扩增条件：95℃预变性3min，95℃30s，58℃30s，72℃35s，30个循环，72℃延伸10min。扩增之后用1％琼脂糖凝胶电泳(120V，90mA)检测结果。
经过毒力基因PCR扩增，鉴定出解淀粉芽胞杆菌SN-C只含有毒力基因nheA和nheC，结果见图8A和图8B。
二、解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株的药敏试验
取过夜培养的解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株(种子液按照1％接入TSB培养)菌液，用15.0ml灭菌玻璃试管稀释，用麦氏比浊管3号管(9.0x108个/mL)对照，稀释至9.0x106个/mL，取130μL用灭菌棉签涂布在TSA平板上；待平板晾干后，用灭菌镊子夹取药敏试纸放在培养板上(一个直径9cm的平板大致可以放三到四片药敏试纸)，正放置于37℃培养箱培养12h后观察结果。
经药敏试验可见解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株对常用的青霉素类、头孢类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类抗生素均敏感。解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株药敏试验结果见图9和表13。
表13解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株的抗生素敏感性试验结果
Figure BDA0002635553600000112
Figure BDA0002635553600000121
三、小鼠安全试验
选取三周龄雌性昆明小鼠进行解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株毒力饲养试验，试验周期为三天预饲适应期和两周的正式试验期。按照体重进行分组，试验组分两组每组5只小鼠，试验组于试验期每天上午9：00-10:00灌胃用生理盐水重悬菌液109CFU/只，空白对照组灌胃与试验组等体积的生理盐水，每3天进行称重，每天观察记录小鼠精神状态及健康状况；灌胃结束时抽取小鼠进行剖检，内部脏器均正常。
表14小鼠安全试验
Figure BDA0002635553600000122
经由小鼠饲养试验，与空白对照比较，试验组在整个试验期的的体重增长无显著差异，同时小鼠精神状态正常、被毛及外观良好、无腹泻、死亡等现象，证明解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株虽有少许毒力基因，但对小鼠无毒害作用，可推断解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株是安全可用的益生菌。
实施例2：本发明的解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株在玉米青贮中应用
一、玉米青贮试验步骤
将编号A、SN-C、E、CO4菌液置于37℃200rpm/min摇床培养24h后，活菌计数(约为2.3x108CFU/mL)，用真空封口机包装不带棒玉米青贮样品500g/袋，空白对照不加菌液，试验组菌液加入量10mL/袋(即添加量109CFU/袋)，每个菌三个重复，置于室温进行贮藏发酵45d后检测青贮饲料粗纤维剩余含量。玉米青贮试验包装见图10
二、粗纤维测量方法(滤袋法)
表15NDF试剂：中性洗涤剂(3％十二烷基硫酸钠)
Figure BDA0002635553600000131
注：准确称取18.61g Na2EDTA和6.81g四硼酸钠放入1.0L烧杯中，加入少量蒸馏水，加热溶解后再加入30.0g十二烷基硫酸钠和10.0mL乙二醇***，准确称量4.56g无水Na2HPO4于另一个烧杯，加入少量蒸馏水微热溶解后，倾入第一个烧杯中，混匀后于1000.0mL容量瓶中定容至1.0L。
ADF试剂：酸性洗涤剂(2％十六烷基三甲基溴化铵)的配制
称取20.0g十六烷基三甲基溴化铵溶于1000.0mL 1.0mol/L的硫酸溶液中，搅拌溶解，必要时加热。
(一)开袋处理：
剪刀开封，混合均匀后取大约5.0g饲料样品于100mL烧杯，加入45.0mL水搅拌均匀，浸泡5min后用pH计测量溶液的pH值。所测pH值均在3.78-4.2之间，证明此次微量青贮效果良好；预留100g样品置于-80℃冰箱。
取一定质量的青贮样品置于500g烧杯，置于65℃烘箱烘干至恒重称量总质量，减去烧杯的质量即可得到干物质的质量。取65℃烘干后的全部样品，置于粉碎机中粉碎，粉碎后全部过40目筛，收集样品于自封袋，以进行下一步测量。
(二)中性洗涤纤维(NDF)测定
烘干滤袋：铅笔标记，105℃烘干1h，取出后放置于干燥器中冷却30min后称重(万分之一天平)；
称量样品：称取0.5g样品于滤袋(样品已经在65℃烘箱中烘干至恒重)，每个样品称取两包做测量重复，准确记录质量后，用真空封口机封口(不立即测定可室温保存)；
除脂：将滤袋放入丙酮或石油醚中浸泡约3h除脂，放入1h后可以更换液体，更换一次即可；
烘干：取出后自然晾干(通风橱中约1h)，然后放入105℃烘箱烘干至恒重；
烘干后取出，放置于烧杯中，每只滤袋加入100mL NDF(中性洗涤纤维)洗涤剂，每100mL溶液加入1000单位高温α-淀粉酶，加入正辛醇3-5滴，后置于电炉上使其10min内沸腾，随后微沸1h(注：用平皿压住滤袋是其全部浸没于溶液下)；
取出，用70℃蒸馏水洗涤约5-6次，直至pH约为7.0；
洗后，置于丙酮溶液中浸泡3-5min，自然晾干后，105℃烘箱烘干至恒重，冷却后准确称量记录质量，即得到NDF质量。
(三)酸性洗涤纤维(ADF)测定
将NDF测量之后的滤袋放入烧杯中，每个烧杯加入4个滤袋，每个滤袋加100mL ADF(酸性洗涤纤维)洗涤剂，加入正辛醇3-5滴，置于电炉上使其10min内沸腾，使其微沸1h；
取出，用70℃蒸馏水洗涤约3-4次，直至pH约为7.0；
洗后，置于丙酮溶液中浸泡3-5min，自然晾干后，105℃烘箱烘干至恒重，冷却后准确称量记录质量，即得到ADF质量。
(四)半纤维素、纤维素含量计算方法
纤维素含量在10％以内，允许的相对偏差为0.4％，纤维素含量10％以上，允许的相对偏差为4％。
A和B的相对平均偏差计算公式为|A-(A+B)/2|/(A+B)/2；
半纤维素含量计算：
半纤维素(％)＝NDF(％)-ADF(％)
纤维素含量计算：
纤维素＝ADF(％)-经72％硫酸处理后的残渣重(％)
经过玉米青贮测定纤维素和半纤维素剩余量，结果见图13-16。SN-C添加入玉米青贮后，NDF剩余量与空白组差异显著(P<0.05)，降低NDF含量约为5.1％(见图13)；ADF剩余量与空白组差异极显著(P<0.01)，降低ADF含量约为3.5％(见图14)；纤维素剩余量与空白组差异极显著(P<0.01)，降低纤维素含量约为3.1％(见图15)；半维素剩余量与空白组差异不显著，可能由于组间差异导致半纤维素降低不显著，但仍可见半纤维素降低趋势，降低量约为1.75％(见图16)。以此结果分析可知SN-C可显著降低玉米青贮的NDF、ADF含量，NDF含量降低约为5.1％。并且纤维素与半纤维素总共降低为4.85％，因此可以认为本发明的解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株是通过降低玉米青贮饲料中的纤维素与半纤维素来降低NDF和ADF的。
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序列表
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<120> 水牛瘤胃源解淀粉芽胞杆菌的筛选及其应用
<141> 2020-08-17
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1449
<212> DNA
<213> 解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1449)
<400> 1
catgcggcgt gctatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt 180
cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240
caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300
gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420
acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540
taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660
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tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840
ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960
cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt 1020
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260
ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa 1440
gtgacagat 1449

Claims (1)

1.保藏编号为CCTCC NO：M2020137的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SN-C菌株在降低玉米青贮饲料中纤维素与半纤维素中的应用。
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