CN113234611B - 酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。本发明在酿酒酵母菌株的基础上，转入外源基因4CL、Ech、Fcs、vdh、PobA中的至少一种。本发明通过精准控制以上关键基因的转入，在酵母体内构建了一种全新的利用木质素或对香豆酸转化合成原儿茶酸的路径，实现了利用木质素单体及木质素合成原儿茶酸。实验表明，本发明基因工程菌可以充分利用木质素及其衍生的芳香族化合物制备原儿茶酸，不仅可以解决木质素的利用问题，而且可以生成原儿茶酸这种重要的化工原料，实现木质素的高值化利用。

Description

酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。
背景技术
原儿茶酸作为药物，在临床上可用于治疗慢性气管炎、烧伤、小儿肺炎、菌痢、急性盂肾炎、急性胰腺炎及某种溃疡病的治疗。另外，其具有一定的抗氧化抗菌作用，对金黄葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌等有抑制作用。原儿茶酸是一种关键的代谢中间体，可以进一步转化为许多化学物质，如己二酸，吡啶2,4-二羧酸等。此外，在最近的研究中，原儿茶酸可以用做合成聚合物的单体。因此原儿茶酸具有广阔的应用前景，化学合成主要以香兰素为原料，经碱熔溶氧化脱甲基，再经酸化制备，该工艺需要240℃以上高温，反应大部分时间为固相反应，难于控制，必须使用特殊的反应设备，投资大、设备利用率低。微生物转化合成原儿茶酸技术，已经进行了开发研究。原儿茶酸主要通过3-脱氢莽草酸脱水酶(3-dehydroshikimate dehydratase，aroZ)作用于3-脱氢莽草酸(DHS)一步催化形成。利用该基因在大肠杆菌，芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌及酿酒酵母中实现了从葡萄糖合成原儿茶酸，该法环保、可持续，并且与化学法相比，具有经济竞争力，有很好的产业应用前景。除了从糖合成原儿茶酸，利用木质素合成原儿茶酸可以减少葡萄糖的使用，促进生物质的利用，减少农业废弃物对环境的污染。当前研究研究利用木质素合成原儿茶酸主要是针对木质素降解微生物，如红球菌，恶臭假单胞菌的转化木质素合成原儿茶酸及其衍生分子等。然而，木质素降解降解菌能够降解原儿茶酸，导致其原儿茶酸无法积累，需要进行基因的敲除等措施。利用生物安全菌株酵母酿酒酵母转化木质素合成原儿茶酸尚未进行研究，本研究针对木质素水解液主要单体组成，通过构建优化木质素单体合成原儿茶酸路线，实现了酿酒酵母高效合成原儿茶酸。
生物合成原儿茶酸以葡萄糖研究较多，大肠杆菌引入ubic和pobA基因合成了利用葡萄糖合成了大约110mg/L的原儿茶酸。另外，在谷氨酸棒杆菌中，引入ubic基因，通过在发酵罐中分批补料发酵获得了1140.0±11.6mg/L)原儿茶酸。Michael以蔗糖为原料在酿酒酵母中引入AroZ(DHS dehydratase)和设计degron-tagged Aro1实现了酿酒酵母CEN.PK利用蔗糖合成了原儿茶酸，通过发酵过程补充糖经过8天发酵最终获得了5.6g/L原儿茶酸。除了从糖出发，以芳香化合物未原料合成原儿茶酸，近期也有研究。戴玉杰等发明了利用苯酚为原料制备原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)的基因工程菌及其构建方法。该工程菌含有对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclBCD和羟化酶基因pobA，以苯酚为原料，通过生物转化法将苯酚进行加羧获得对羟基苯甲酸，然后将对羟基苯甲酸3位氧化获得原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)。袁吉锋等发明了在大肠杆菌中导入PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA，实现了大肠杆菌从酪氨酸出发合成原儿茶酸。目前仍未见以木质素为原料合成原儿茶酸的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。本发明在酿酒酵母菌株基础上进行基因改造，在酵母体内构建了一种新的木质素生物转化路径，获得的酿酒酵母工程菌可以充分利用木质素及其衍生的芳香族化合物合成原儿茶酸，明显提高了原儿茶酸的含量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌酿酒酵母菌株为底盘菌株，转入外源基因4CL、Ech、Fcs、vdh、PobA中的至少一种。
本发明中，所述底盘菌株以酿酒酵母菌株作为出发菌，在其基础上敲除了ADH6,ADH7,BDH2基因。出发菌株可以选择任意的酿酒酵母菌。一些具体实施例中，所述出发菌株为酿酒酵母菌株BY4742。在酿酒酵母菌株BY4742的基础上，敲除ADH6,ADH7,BDH2基因，获得底盘菌株，将其命名为菌株ZR01。
本发明对于以上基因的敲除方法没有特殊限定，可以是CRISPR技术，也可利用酵母同源重组机制。本发明具体实施例中，通过CRISPR技术对ADH6,ADH7,BDH2基因进行敲除。具体方法为：
以酿酒酵母BY4742为模板，PCR获取酿酒酵母ADH6基因(genbank号为：NM_001182831.3)的左右各400bp序列，命名为ADH6L、ADH6R，进行overlap，获取ADH6-LR作为donor DNA。根据ADH6序列构建gRNA质粒，将gRNA，cas9，donor DNA导入酿酒酵母BY4742中，涂布SC筛选平板，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证及测序。根据上述方式，依次敲除ADH7(NM_001178812.1),BDH2(NM_001178203.1)，命名为ZR01。
一些实施方案中，在底盘菌株ZR01转入外源基因1)～5)中的任意一种：
1)Ech和Fcs；
2)4CL和Ech；
3)4CL、Ech和vdh；
4)4CL、Ech、vdh和PobA；
5)vdh或PobA。
本发明中，所述外源基因4CL基因来源于欧芹。Ech基因来源于恶臭假单胞菌或链霉菌。Fcs基因来源于恶臭假单胞菌或链霉菌。vdh基因和pobA基因来源于恶臭假单胞菌。
以上外源基因均为本领域公知的基因序列，均为全长序列。
本发明具体实施例中，本领域技术人员也可以根据酿酒酵母的密码子偏好性对相关序列进行优化。本发明中，欧芹来源的4CL基因为优化后的序列，优化后的4CL基因的序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明中，链霉菌来源的Ech基因和Fcs基因具体来源于链霉菌Streptomycessp.V-1菌株，Ech基因的登录号为KC847406.1，Fcs基因的登录号为KC847405.1。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的Ech基因(登录号AAN68962.1)、Fcs基因(登录号AAN68960.2)、Vdh基因(登录号AAN68961.1)和PobA基因(登录号AAN69138.1)具体来源于恶臭假单胞菌KT2440，各基因的扩增引物如下：
Pp-FCS-F:5’-ATGAATAACGAAGCCCGCTCA-3’(SEQ ID NO：2)；
Pp-FCS-R:5’-TCAAGGCCGCACCTTGGC-3’(SEQ ID NO：3)；
Pp-ECH-F:5’-ATGAGCAAATACGAAGGCCG-3’(SEQ ID NO：4)；
Pp-ECH-R:5’-TCAGCGCTTGTAGGCCTGC-3’(SEQ ID NO：5)；
Pp-VDH-F:5’-ATGTTGCAGGTGCCTTTGCT-3’(SEQ ID NO：6)；
Pp-VDH-R:5’-CTAGATGGGATAGTGACGCGGG-3’(SEQ ID NO：7)；
Pp-PobA-F:5’-ATGAAAACTCAGGTTGCAATTATTG-3’(SEQ ID NO：8)；
Pp-PobA-R:5’-TCAGGCAACTTCCTCGAACG-3’(SEQ ID NO：9)。
一些具体实施例中，在底盘菌株ZR01中转入链霉菌来源的Ech(ssech)和Fcs(ssfcs)，获得的工程菌VAN1。
在底盘菌株ZR01中转入恶臭假单胞菌来源的Ech(ppech)和Fcs(ppfcs)，获得的工程菌VAN2。
在底盘菌株ZR01中转入欧芹来源的4Cl和恶臭假单胞菌来源的Ech(ppech)，获得的工程菌VAN3。
在底盘菌株ZR01中转入欧芹来源的4Cl、恶臭假单胞菌来源的Ech(ppech)和恶臭假单胞菌来源的Vdh，获得的工程菌VAC1。
将欧芹来源的4Cl，以及恶臭假单胞菌来源的Ech(ppech)、Vdh和PobA以质粒的形式转入底盘菌株ZR01，获得的工程菌PCA1。
在菌株PCA1的基础上进一步转入pRS413质粒，获得菌株PCA2。
在底盘菌株ZR01中转入恶臭假单胞菌来源的PobA，获得菌株PCA3。
PCA1～PCA3菌株中，外源基因通过质粒形式导入。
本发明中，利用同源重组机制，将欧芹来源的4Cl，以及恶臭假单胞菌来源的Ech(ppech)、Vdh和PobA整合到ZR01的基因组上，获得的工程菌PCA4。
本发明中，内源基因、外源基因中每个基因的5’端连接启动子，3’端连接终止子。
其中，所述启动子为酿酒酵母内源启动子PTPI1P、PFBA1、PENO2或PPGK1。
本发明对终止子的来源没有特殊限定，本领域常用的终止子均可。本发明中，所述终止子为酿酒酵母内源终止子，具体为TTPI1P、TFBA1、TENO2、THXT7、TPGI1、TPGH、或TGPM1，终止子的具体种类包括但不仅限于此。
本发明还提供了以上所述酿酒酵母工程菌在制备原儿茶酸中的应用。
本发明提供所述酿酒酵母工程菌的构建方法，包括：构建启动子-外源基因/内源基因-终止子的表达模块，将所述表达模块与线性化骨架载体转化底盘菌株。
本发明中，所述转化方法为醋酸锂转化法。
所述骨架载体为PRS415或PRS413。
本发明还提供了一种原儿茶酸的制备方法，利用以上酿酒酵母工程菌进行发酵。
本发明中，所述发酵的培养基包含香豆素酸或木质素。
本发明在敲除ADH6、ADH7和BDH2酿酒酵母的基础上，转入外源基因4CL、Ech、Fcs、vdh、PobA中的至少一种，在酵母体内构建了一种新的木质素生物转化路径，该路径通过对关键基因进行改造将木质素转化合成对羟基苯甲酸及原儿茶酸，实现了利用木质素单体及木质素合成原儿茶酸。实验表明，本发明的基因工程菌可以充分利用木质素及其衍生的芳香族化合物制备原儿茶酸，不仅可以解决木质素的利用问题，而且可以生成原儿茶酸这种重要的化工原料，实现木质素的高值化利用。
附图说明
图1为酵母工程菌VAN1、VAN2、VAN3和VAC1的构建示意图；
图2为VAN1、VAN2、VAN3和VAC1菌株转化木质素合成对羟基苯甲醛及对羟基苯甲醛的结果；
图3为基因工程菌PCA2,PCA3发酵制备原儿茶酸的结果；
图4为基因工程菌PCA4以不同浓度的对香豆素酸为底物产原儿茶酸的结果；
图5为基因工程菌PCA4以预处理的玉米秸秆木质素为底物产原儿茶酸的结果。
具体实施方式
本发明提供了酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、构建菌株VAN1～VAN3
通过PCR扩增酵母启动子PTPI1P，终止子TGPM1，分别与基因ssfcs(链霉菌来源的Fcs)，ppfcs(恶臭假单胞菌来源的Fcs)，4CL基因进行overlap，获得模块PTPI1P-ssfcs-TGPM1，PTPI1P-ppfcs-TGPM1，PTPI1P-4CL-TGPM1。通过PCR扩增酵母启动子PFBA1,终止子TPGI1分别与基因ssech(链霉菌来源的Ech)，ppech(恶臭假单胞菌来源的Ech)，进行overlap，获得模块PFBA1-ssech-TPGI1,PFBA1-ppech-TPGI1。利用XhoI，BamHI酶切prs415质粒，将线性化载体PRS415分别与模块PTPI1P-ssfcs-TGPM1,PFBA1-ssech-TPGI1；PTPI1P-ppfcs-TGPM1，PFBA1-ppech-TPGI1；PTPI1P-4CL-TGPM1，PFBA1-ppech-TPGI1通过醋酸锂转化法导入酿酒酵母ZR01，通过载体左、右同源序列与载体发生重组而整合到载体上，转化后采用SD-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌，分别命名为VAN1 VAN2 VAN3，构建示意图见图1。
2、构建菌株VAC1
构建模块TPGI1-PENO2-vdh-TENO2,将线性化载体PRS415与模块PTPI1P-4CL-TGPM1，PFBA1-ppech-TPGI1,TPGI1-PENO2-vdh-TENO2利用上述步骤1的方法转化酿酒酵母ZR01，获得VAC1，构建示意图见图1。
3、构建菌株PCA2～PCA4
构建模块TENO2-PPGK1-PobA-THXT7,将线性化载体PRS415与模块PTPI1P-4CL-TGPM1，PFBA1-ppech-TPGI1,TPGI1-PENO2-vdh-TENO2,TENO2-PPGK1-PobA-THXT7利用上述步骤1的方法转化酿酒酵母ZR01，获得PCA1；进一步将pRS413质粒转化PCA1菌株，获得PCA2菌株。
将线性化载体PRS413与上述模块TENO2-PPGK1-PobA-THXT7,利用上述步骤1的方法导入到酿酒酵母PCA1中，获得PCA3。
采用醋酸锂法将片段PTPI1P-4CL-TGPM1，PFBA1-ppech-TPGI1,TPGI1-PENO2-vdh-TENO2,TENO2-PPGK1-PobA-THXT7转化酿酒酵母ZR01，通过左、右同源序列与酵母基因组上HO位点发生重组而整合到基因组上，将模块TENO2-PPGK1-PobA-THXT7通过左、右同源序列与酵母基因组上detal15位点发生重组而整合到基因组上，获得稳定遗传的酵母菌株PCA4。
实施例2不同菌株合成原儿茶酸的能力
将实施例1构建的菌株VAN1、VAN2、VAN3、VAC1和对照菌株Control(ZR01中转化的空质粒pRS415),在初始添加200mg/L对香豆酸的SC-L(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L)培养基下培养24h分析其对羟基苯甲酸及对羟基苯甲醛的产量，结果见图2。
将实施例1构建的菌株PCA2和PCA3,在初始添加200mg/L对香豆酸的SC-Leu-His(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L)培养基下培养96h分析其原儿茶酸及对羟基苯甲酸的产量，结果见图3。
将实施例1构建的菌株PCA4，在初始200(mg/L),600(mg/L),1000(mg/L),1400(mg/L),1600(mg/L),2000(mg/L)对香豆酸条件下，在1600mg/L对香豆酸条件下最高可以产生720mg/L原儿茶酸，结果见图4。
将1.5g氢氧化钠溶于135mL纯净水中，加入到15g玉米秸秆，置于反应釜中，油浴130℃，30min。冷却，过滤，调节pH为6，12000rpm 30min除去沉淀，获得木质素水解液。
将实施例1构建的菌株PCA4，加入0.5X木质素水解液的YPD培养基中发酵。最高产生400mg/L原儿茶酸，结果见图5。
由图2结果可知，本发明构建的酵母工程菌VAN1 VAN2、VAN3、VAC1可以转化木质素合成原儿茶酸的前体物质对羟基苯甲酸，其中，转入4CL、ppEch和vdh的菌株VAC1的转化效果最好，对羟基苯甲酸的含量高达115mg/L。
图3可知，通过在VAC1基础上引入pobA获得PCA2菌株，利用200mg/L的对香豆酸合成了93mg/L的原儿茶酸。为了进一步提高原儿茶酸产量增加pobA的拷贝数获得PCA4，PCA4菌株显著提高了产量，最终获得了120mg/L的原儿茶酸。
图4可知，菌株PCA4在初始浓度为200(mg/L),600(mg/L),1000
(mg/L),1400(mg/L),1600(mg/L),2000(mg/L)的对香豆酸条件下均可产生原儿茶酸，其中，在1600mg/L对香豆酸条件下合成原儿茶酸的含量最高，
可达720mg/L。
图5可知，将菌株PCA4接种至含0.5X木质素水解液的YPD培养基中发酵，最高产生400mg/L原儿茶酸。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用
<130> MP21005897
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggtgact gtgttgctcc aaaggaagac ttaattttta gatctaagtt gcctgatatc 60
tatatcccaa agcatttgcc tttacacaca tactgtttcg aaaacatctc taaggttggt 120
gacaagtcat gcttaattaa cggtgccacc ggtgaaactt ttacttactc tcaagtagaa 180
ttgttgtcca gaaaagttgc aagtggtttg aataagttag gtatccaaca aggtgacaca 240
attatgttgt tattgccaaa ctcacctgaa tatttctttg ctttcttggg tgcatcctac 300
agaggtgcca taagtacaat ggctaatcca tttttcacct ccgctgaagt tatcaaacaa 360
ttaaaggcta gtcaagcaaa gttgatcatc actcaagcat gttacgtcga taaagtaaag 420
gactacgctg cagaaaagaa tatccaaatc atctgtatcg atgacgctcc acaagattgc 480
ttgcatttct ctaagttgat ggaagcagac gaatcagaaa tgcctgaagt tgtcattaac 540
tccgatgacg tagttgcttt accatactct tcaggtacta caggtttgcc taaaggtgtt 600
atgttaaccc acaagggttt ggttactagt gtcgcacaac aagtagatgg tgacaaccca 660
aacttataca tgcattctga agatgttatg atctgcatat tgcctttgtt ccacatctat 720
tcattgaatg ccgtcttatg ttgcggtttg agagctggtg taactatctt gatcatgcaa 780
aagttcgata tcgttccatt cttggaattg atccaaaagt acaaggtcac aataggtcca 840
ttcgttccac ctatagtctt agctatcgca aaatcccctg tcgttgataa gtacgacttg 900
tccagtgtaa gaaccgttat gagtggtgcc gctccattgg gtaaagaatt ggaagatgcc 960
gttagagcta aatttcctaa cgctaagtta ggtcaaggtt atggtatgac tgaagcaggt 1020
ccagttttag ccatgtgttt ggccttcgct aaagaacctt acgaaattaa atctggtgca 1080
tgcggtaccg ttgtcagaaa tgccgaaatg aagatagttg atccagaaac taacgcttca 1140
ttgcctagaa accaaagagg tgaaatttgt ataagaggtg accaaatcat gaagggttat 1200
ttgaacgacc cagaatcaac tagaaccact attgatgaag aaggttggtt gcatacaggt 1260
gacatcggtt ttattgatga cgatgacgaa ttattcattg tcgatagatt gaaggaaata 1320
atcaaataca agggttttca agttgcacca gccgaattgg aagctttgtt gttgactcat 1380
ccaacaatct ctgatgcagc cgtagttcct atgatagacg aaaaagctgg tgaagtacct 1440
gttgcatttg tcgtaagaac aaatggtttc acaaccactg aagaagaaat taaacaattc 1500
gtttccaagc aagttgtctt ttataagaga atattcagag tctttttcgt agatgctata 1560
ccaaagtctc cttcaggtaa aatcttgaga aaggatttga gagcaagaat tgcctctggt 1620
gacttgccaa aatag 1635
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaataacg aagcccgctc a 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaaggccgc accttggc 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgagcaaat acgaaggccg 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcagcgcttg taggcctgc 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgttgcagg tgcctttgct 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctagatggga tagtgacgcg gg 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgaaaactc aggttgcaat tattg 25
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcaggcaact tcctcgaacg 20

Claims (8)

1.酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以敲除ADH6、ADH7和BDH2基因的酿酒酵母菌株为底盘菌株，转入外源基因4CL、Ech、Fcs、vdh和PobA；所述底盘菌株的出发菌为酿酒酵母菌株BY4742；
所述外源基因中，4CL基因来源于欧芹； Ech基因来源于恶臭假单胞菌或链霉菌；Fcs基因来源于恶臭假单胞菌或链霉菌；vdh基因和pobA基因来源于恶臭假单胞菌；
所述4CL基因的序列如SEQ ID NO：1所示；
所述链霉菌来源的Ech基因的登录号为KC847406.1，Fcs基因的登录号为KC847405.1；
所述恶臭假单胞菌来源的Ech基因的登录号为AAN68962.1，Fcs基因的登录号为AAN68960.2，Vdh基因的登录号为AAN68961.1，PobA基因的登录号为AAN69138.1。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述内源基因、外源基因中每个基因的5’端连接启动子，3’端连接终止子。
3.根据权利要求2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述启动子为酿酒酵母内源启动子PTPI1P、P FBA1、P ENO2或P PGK1。
4.权利要求1~3任一项所述的酿酒酵母工程菌在制备原儿茶酸中的应用。
5.权利要求1~3任一项所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括：
构建启动子-外源基因-终止子的表达模块，将所述表达模块与线性化的骨架载体转化底盘菌株。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述骨架载体为PRS415或PRS413。
7.一种原儿茶酸的制备方法，其特征在于，利用权利要求1~3任一项所述的酵母工程菌进行发酵。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的培养基包含香豆素酸或木质素。
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BR112014003041B1 (pt) * 2011-08-08 2021-10-13 International Flavors & Fragrances Inc. Método para produzir vanilina e/ou vanilina beta-d-glicosídeo, polipeptídeo de catecol-ometil transferase (comt) mutante, e, microorganismo hospedeiro recombinante
US10519472B2 (en) * 2012-12-27 2019-12-31 Rhodia Operations Recombinant host cell for biosynthetic production
WO2015066722A1 (en) * 2013-11-04 2015-05-07 Bgn Tech Llc Methods of making vanillin via the microbial fermentation of ferulic acid from eugenol using a plant dehydrogenase.
EP2963110A1 (en) * 2014-07-01 2016-01-06 Rhodia Opérations Microorganisms and methods for producing vanillin
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