CN113234182B - 一种β-环糊精臂凝集素磁性材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种β-环糊精臂凝集素磁性材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种β‑环糊精臂凝集素磁性材料及其制备方法和应用，属于凝集素磁性材料制备方法技术领域。该方法通过乙二胺和氯乙酸分别对β‑环糊精进行6位和2位取代修饰，得到单6‑氨基‑2‑羧基环糊精；通过溶剂热方法，以柠檬酸钠为稳定剂制备羧基化四氧化三铁；利用酰胺化反应将单6‑氨基‑2‑羧基环糊精和羧基化四氧化三铁整合，得环糊精臂磁性四氧化三铁；将反应产物与ConA(伴刀豆球蛋白A)凝集素化学偶联，制得β‑环糊精臂凝集素磁性材料；本发明利用凝集素的特异性以及β‑环糊精的亲水性，富集具有独特聚糖结构的N‑糖蛋白，通过外磁场将N‑糖蛋白从混合蛋白质样品中分离出来，有利于N‑糖蛋白的检测分析。

Description

一种β-环糊精臂凝集素磁性材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于凝集素磁性材料制备方法技术领域，具体涉及一种β-环糊精臂凝集素磁性材料及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质糖基化是最普遍的翻译后修饰类型之一，在真核生物的各种生理过程中起着关键作用。据报道，糖基化异常与多种疾病如癌症，类风湿病等有关。然而，糖蛋白的直接监测受到阻碍，因为糖蛋白仅以微米级尺度存在于由10个数量级的数千种蛋白组成的复杂生物样品中。因此，有效分离富集是成功检测和分析糖蛋白的重要前提。
近年来，已经研发了多种糖蛋白分离富集策略，包括酰肼化学、硼酸化学、凝集素亲和化学等。其中凝集素的亲和化学引起广泛关注。凝集素是由一组的特异性蛋白质组成的，对不同聚糖具有独特的亲和力。凝集素通常被固定在不同的基质上，包括琼脂糖、聚合物、二氧化硅和磁性纳米粒子(MNPs)。由于MNPs易制备、无毒害以及具有良好生物相容性和快速磁响应性的优点，其在分离富集领域中应用广泛。基于MNPs的凝集素材料已经成功用于糖蛋白的分离富集。然而，仅依靠聚糖和凝集素之间的特异性亲和作用来富集糖蛋白是远远不够的。由于相关的聚糖部分具有广泛的亲水性，因此糖蛋白通常比其他蛋白质更具亲水性。因此，糖蛋白与富集材料之间的亲水相互作用对于捕获糖蛋白也是必要的。但是令人失望的是，很少有研究报道基于凝集素的磁性材料具有优异的亲水性和特异性，可以从复杂的生物样品中富集糖蛋白。因此，具有亲水性和特异性协同作用的凝集素磁性材料的研发受到关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种β-环糊精臂凝集素磁性材料及其制备方法和应用，该磁性材料通过外磁场将N-糖蛋白从混合蛋白质样品中分离出来。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种β-环糊精臂凝集素磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将对甲苯磺酰氯溶液滴加到β-环糊精的碱性溶液中，在0-4℃下剧烈搅拌3-6h，得到对甲苯磺酰基单取代的β-环糊精(OTs-CD)；
步骤二：将步骤一得到的对甲苯磺酰基单取代的β-环糊精加到还原剂中，70-80℃油浴反应4h-24h，得到2位单取代的氨基β-环糊精(2-NH2-CD)；
步骤三：将步骤二得到的2-NH2-CD、ClCH2COOH、H2O和NaOH混合并搅拌至溶解，得到单2-NH2-6-COOH-CD；
步骤四：将FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O混合搅拌均匀后，在160-200℃反应12-16h，得到羧基化MNPs；
步骤五：将EDC、NHS溶于羧基化MNPs溶液中，超声分散，调节pH至6-8，再加入2-NH2-6-COOH-CD溶液反应，得到MNP-CD；
步骤六：将步骤五的MNP-CD溶解在缓冲溶液中，然后用EDC、NHS进行活化，再加入ConA溶液反应，得到β-环糊精臂凝集素磁性材料MNP-CD-ConA。
优选的是，步骤一中对甲苯磺酰氯和β-环糊精的摩尔比为3：2。
优选的是，所述的步骤二还原剂为乙二胺。
优选的是，所述的2-NH2-CD mmol：ClCH2COOH mmol：H2O mL：NaOH mL为4.4-8.8：140-280：5-10：20-40。
优选的是，所述步骤四中FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O摩尔比为4-12：0.7-2：18-55。
优选的是，所述的步骤五的反应时间为16-18h。
优选的是，所述的步骤六的反应温度为4℃，反应时间为12-16h。
优选的是，步骤六中ConA溶液的浓度为2mg/mL。
本发明提供上述制备方法得到的β-环糊精臂凝集素磁性材料，所述的β-环糊精臂凝集素磁性材料外貌为球形，尺寸为250nm，具有顺磁性。
本发明还提供上述β-环糊精臂凝集素磁性材料在分离富集N-糖蛋白上的应用。
本发明的有益效果
本发明提供一种β-环糊精臂凝集素磁性材料及其制备方法和应用，该方法通过乙二胺和氯乙酸分别对β-环糊精进行6位和2位取代修饰，得到单6-氨基-2-羧基环糊精；通过溶剂热方法，以柠檬酸钠为稳定剂制备羧基化四氧化三铁；利用酰胺化反应将单6-氨基-2-羧基环糊精和羧基化四氧化三铁整合,得环糊精臂磁性四氧化三铁；将反应产物与ConA通过EDC，NHS化学偶联，制得β-环糊精臂凝集素磁性材料；本发明利用凝集素的特异性以及β-环糊精的亲水性，富集具有独特聚糖结构的N-糖蛋白且通过外磁场将N-糖蛋白从混合蛋白质样品中分离出来，有利于N-糖蛋白的检测分析。
附图说明
图1为本发明实施例1所制备的MNPs的SEM图；
图2为本发明实施例1所制备的MNP-CD的SEM图；
图3为本发明实施例1所制备的MNP-CD-ConA的SEM图；
图4为本发明实施例1所制备的3种磁性材料的磁滞回线图；
图5为本发明实施例1所制备的MNP-CD-ConA富集N-糖蛋白的质谱图；
图6为本发明实施例2所制备的MNP-CD-ConA富集N-糖蛋白的质谱图；
图7为本发明实施例3所制备的MNP-CD-ConA富集N-糖蛋白的质谱图；
图8为本发明实施例4所制备的MNP-CD-ConA富集N-糖蛋白的质谱图；
图9为本发明实施例5所制备的MNP-CD-ConA富集N-糖蛋白的质谱图；
图10为本发明实施例6所制备的MNP-CD-ConA富集N-糖蛋白的质谱图。
具体实施方案
一种β-环糊精臂凝集素磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将对甲苯磺酰氯溶解在溶剂中，得到对甲苯磺酰氯溶液，得到所述的溶液优选为乙腈溶剂，对甲苯磺酰氯溶液的质量分数优选为30-40％，然后将得到的对甲苯磺酰氯溶液滴加到β-环糊精的碱性溶液中，所述的碱性溶液质量分数优选为2.5-3.5％，然后在0-4℃下剧烈搅拌3-6h，过滤取滤液，HCl中和后4℃过夜得白色沉淀，得到OTs-CD；所述的对甲苯磺酰氯和β-环糊精的摩尔比优选为3：2；
步骤二：将步骤一得到的对甲苯磺酰基单取代的β-环糊精加入到还原剂中，所述的还原剂优选为乙二胺，所述的OTs-CD质量分数优选为14-18％，70-80℃油浴反应4h-24h，旋干乙二胺后热水溶解，乙醇沉淀并洗涤以除去过量的乙二胺，40℃真空干燥48h得到2-NH2-CD；
步骤三：优选按照固液比4.4-8.8mmol：140-280mmol：5-10mL：20-40mL将步骤二得到的2-NH2-CD、ClCH2COOH、H2O和NaOH混合并搅拌至溶解，优选20-23℃水浴18-24h，无水甲醇析出，洗涤2-3次后冷冻干燥，得到单2-NH2-6-COOH-CD；
步骤四：将FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O溶于乙二醇中，混合搅拌均匀后，转移至高温反应釜中，在160-200℃反应12-16h，用蒸馏水和无水乙醇分别洗涤3-4次，真空干燥得到羧基化MNPs；所述的FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O摩尔比优选为4-12：0.7-2：18-55；
步骤五：将EDC、NHS溶于羧基化MNPs溶液中，所述的羧基化MNPs溶液浓度优选为1g/L，超声分散，分散时间优选为30-40min，调节pH至6-8，再加入2-NH2-6-COOH-CD溶液反应，反应温度优选为25℃，水浴反应优选为16-18h，2-NH2-6-COOH-CD溶液的浓度优选为5g/mL，经过蒸馏水洗涤干燥，得到MNP-CD；所述的EDC和NHS摩尔比优选为1：1；羧基化MNPs溶液和2-NH2-6-COOH-CD溶液的体积比优选为3：1；EDC mmol：NHS mmol：羧基化MNPs溶液mL为8：8：30；
步骤六：将步骤五的MNP-CD溶解在缓冲溶液中，所述的缓冲溶液优选为MES(pH＝5.5)缓冲溶液，然后用EDC、NHS进行活化，具体活化过程优选为：在MNP-CD缓冲溶液中分别加入2mol/L的EDC、NHS溶液(MES配制)，20-23℃充分搅拌活化2-6h，结束后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液洗3次除去过量的EDC与NHS，将产物再分散于PBS缓冲溶液中，再加入ConA溶液反应，优选在4℃反应12-16h，PBS缓冲液洗3次，得到β-环糊精臂凝集素磁性材料MNP-CD-ConA。所述的MNP-CD的质量mg：EDC、NHS的MES溶液体积mL：ConA的PBS溶液的体积mL为10：0.5-2.5：1-3，ConA的PBS溶液的浓度优选为2mg/mL。
本发明还提供上述制备方法得到的β-环糊精臂凝集素磁性材料。所述的β-环糊精臂凝集素磁性材料外貌为球形，尺寸约为250nm，具有较强的顺磁性。
本发明还提供上述β-环糊精臂凝集素磁性材料在分离富集N-糖蛋白上的应用，具体步骤如下：
(1)将预处理好的MNP-CD-ConA(1mg)分散在300μL的Loading buffer(20mM Tris-HCl含150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2，pH＝7.4)中，向其中加入200μL辣根过氧化物酶和牛血清白蛋白混合溶液(1mg/ml)，室温孵育2h；
(2)将孵育好的MNP-CD-ConA通过外磁场分离，倒掉上清液，用200μL Loadingbuffer洗涤3次，磁分离后倒掉上清液；
(3)将洗涤好的MNP-CD-ConA用500μL Elution buffer(25mM Tris-HCl含500mMNaCl、500mMα-甲基-D-甘露糖苷，pH＝7.4)洗脱富集的辣根过氧化物酶，室温下孵育2h，外磁场分离后，取上清液测质谱。
下面结合实例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于以下实施例。
除非另外限定，这里所使用的术语(包含科技术语)应当解释为具有如本发明所属技术领域的技术人员所共同理解到的相同意义。还将理解到，这里所使用的术语应当解释为具有与它们在本说明书和相关技术的内容中的意义相一致的意义，并且不应当以理想化或过度的形式解释，除非这里特意地如此限定。
实施例1
一种β-环糊精臂凝集素磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照质量分数35％，将对甲苯磺酰氯溶解在乙腈溶液中，慢慢滴加到β-环糊精(对甲苯磺酰氯：β-环糊精＝3：2摩尔比)的2.5％(质量分数)碱性溶液中，在4℃下剧烈搅拌3h，过滤取滤液，HCl中和后4℃过夜得白色沉淀，即OTs-CD。
(2)以乙二胺为强还原剂，按照16％质量分数将OTs-CD投入乙二胺中，80℃油浴12h。旋干乙二胺后热水溶解，乙醇沉淀并洗涤以除去过量的乙二胺。40℃真空干燥48h得2-NH2-CD。
(3)按照固液比4.4mmol：140mmol：5mL：20mL，将2-NH2-CD、ClCH2COOH、H2O和40％(质量分数)NaOH混合并搅拌至溶解，23℃水浴18h。无水甲醇析出，洗涤2-3次后冷冻干燥12h，得淡黄色固体即单2-NH2-6-COOH-CD。
(4)按照固液比12mmol：2mmol：55mmol：75mL，将FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O溶于乙二醇中，室温下搅拌溶解至呈均匀的棕黄色溶液后，转移至高温反应釜中，200℃反应16h。得到的黑色沉淀用蒸馏水和无水乙醇分别洗涤3-4次，60℃真空干燥得羧基化MNPs，SEM图如图1所示。
(5)将8mmol EDC、8mmol NHS溶于30mL 1g/L的羧基化MNPs溶液中，超声分散30min，用NaOH溶液调节pH至6，再加入10mL 5g/mL的2-NH2-6-COOH-CD溶液。25℃水浴反应16h，蒸馏水洗涤三次，40℃真空干燥48h得棕黑色沉淀，即MNP-CD，SEM图如图2所示。
(6)将10mg的MNP-CD溶解在5mL的MES(pH＝5.5)缓冲溶液中，超声形成均匀溶液，向其中分别加入2mol/L的EDC、NHS的MES溶液1mL，20℃充分搅拌活化2h。结束后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液洗3次除去过量的EDC与NHS。将产物再分散于10mL PBS缓冲溶液中，加入2mL的2mg/mL ConA的PBS溶液，4℃反应16h。PBS缓冲液洗3次得到棕黄色沉淀，即MNP-CD-ConA，于4℃下保存备用。
图3为本发明得到的MNP-CD-ConA的SEM图，表明MNP-CD-ConA外貌为球形，尺寸约为250nm。
图4为本发明得到的MNP、MNP-CD、MNP-CD-ConA的磁滞回线图，说明所制备的磁性材料具有一定的顺磁性。
实施例1得到的磁性材料在分离富集N-糖蛋白上的应用，具体包括：
(1)将预处理好的MNP-CD-ConA(1mg)分散在300μL的Loading buffer(20mM Tris-HCl含150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2，pH＝7.4)中，向其中加入200μL辣根过氧化物酶和牛血清白蛋白混合溶液(1mg/ml)，室温孵育2h。
(2)将孵育好的MNP-CD-ConA通过外磁场分离，倒掉上清液。用200μL Loadingbuffer洗涤3次，磁分离后倒掉上清液。
(3)将洗涤好的MNP-CD-ConA用500μL Elution buffer(25mM Tris-HCl含500mMNaCl、500mMα-甲基-D-甘露糖苷，pH＝7.4)洗脱富集的辣根过氧化物酶，室温下孵育2h。外磁场分离后，取上清液测质谱。质谱图如图5所示，说明MNP-CD-ConA对辣根过氧化物酶具有一定的富集能力。
实施例2
一种β-环糊精臂凝集素磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照质量分数30％，将对甲苯磺酰氯溶解在乙腈溶液中，慢慢滴加到β-环糊精(对甲苯磺酰氯：β-环糊精＝3：2摩尔比)的3.5％(质量分数)碱性溶液中，在4℃下剧烈搅拌6h，过滤取滤液，HCl中和后4℃过夜得白色沉淀，即OTs-CD。
(2)以乙二胺为强还原剂，按照14％质量分数将OTs-CD投入乙二胺中，80℃油浴24h。旋干乙二胺后热水溶解，乙醇沉淀并洗涤以除去过量的乙二胺。40℃真空干燥48h得2-NH2-CD。
(3)按照固液比5.2mmol：165.5mmol：6mL：24mL，将2-NH2-CD、ClCH2COOH、H2O和40％(质量分数)NaOH混合并搅拌至溶解，20℃水浴18h。无水甲醇析出，洗涤2-3次后冷冻干燥12h，得淡黄色固体即单2-NH2-6-COOH-CD。
(4)按照固液比4mmol：0.7mmol：18mmol：25mL，将FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O溶于乙二醇中，室温下搅拌溶解至呈均匀的棕黄色溶液后，转移至高温反应釜中，160℃反应16h。得到的黑色沉淀用蒸馏水和无水乙醇分别洗涤3-4次，60℃真空干燥得羧基化MNPs。
(5)将8mmol EDC、8mmol NHS溶于30mL 1g/L的羧基化MNPs溶液中，超声分散30min，用NaOH溶液调节pH至7，再加入10mL 5g/mL的2-NH2-6-COOH-CD溶液。25℃水浴反应16h，蒸馏水洗涤三次，40℃真空干燥48h得棕黑色沉淀即MNP-CD。
(6)将10mg的MNP-CD溶解在5mL的MES(pH＝5.5)缓冲溶液中，超声形成均匀溶液，向其中分别加入2mol/L的EDC、NHS的MES溶液1.5mL，20℃充分搅拌活化4h。结束后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液洗3次除去过量的EDC与NHS。将产物再分散于10mL PBS缓冲溶液中，加入1mL的2mg/mL ConA的PBS溶液，4℃反应12h。PBS缓冲液洗3次得到棕黄色沉淀，即MNP-CD-ConA，于4℃下保存备用。
实施例2得到的磁性材料在分离富集N-糖蛋白上的应用，具体包括：
(1)将预处理好的MNP-CD-ConA(1mg)分散在300μL的Loading buffer(20mM Tris-HCl含150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2，pH＝7.4)中，向其中加入200μL辣根过氧化物酶和牛血清白蛋白混合溶液(1mg/ml)，室温孵育2h。
(2)将孵育好的MNP-CD-ConA通过外磁场分离，倒掉上清液。用200μL Loadingbuffer洗涤3次，磁分离后倒掉上清液。
(3)将洗涤好的MNP-CD-ConA用500μL Elution buffer(25mM Tris-HCl含500mMNaCl、500mMα-甲基-D-甘露糖苷，pH＝7.4)洗脱富集的辣根过氧化物酶，室温下孵育2h。外磁场分离后，取上清液测质谱，质谱图如图6所示。
实施例3
一种β-环糊精臂凝集素磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照质量分数40％，将对甲苯磺酰氯溶解在乙腈溶液中，慢慢滴加到β-环糊精(对甲苯磺酰氯：β-环糊精＝3：2摩尔比)的3.0％(质量分数)碱性溶液中，在4℃下剧烈搅拌3h，过滤取滤液，HCl中和后4℃过夜得白色沉淀，即OTs-CD。
(2)以乙二胺为强还原剂，按照18％质量分数将OTs-CD投入乙二胺中，80℃油浴4h。旋干乙二胺后热水溶解，乙醇沉淀并洗涤以除去过量的乙二胺。40℃真空干燥48h得2-NH2-CD。
(3)按照固液比7.6mmol：242mmol：8.6mL：34.5mL，将2-NH2-CD、ClCH2COOH、H2O和40％(质量分数)NaOH混合并搅拌至溶解，22℃水浴20h。无水甲醇析出，洗涤2-3次后冷冻干燥12h，得淡黄色固体即单2-NH2-6-COOH-CD。
(4)按照固液比6mmol：1.1mmol：27mmol：37.5mL，将FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O溶于乙二醇中，室温下搅拌溶解至呈均匀的棕黄色溶液后，转移至高温反应釜中，200℃反应12h。得到的黑色沉淀用蒸馏水和无水乙醇分别洗涤3-4次，60℃真空干燥得羧基化MNPs。
(5)将8mmol EDC、8mmol NHS溶于30mL 1g/L的羧基化MNPs溶液中，超声分散35min，用NaOH溶液调节pH至6，再加入10mL 5g/mL的2-NH2-6-COOH-CD溶液。25℃水浴反应18h，蒸馏水洗涤三次，40℃真空干燥48h得棕黑色沉淀即MNP-CD。
(6)将10mg的MNP-CD溶解在5mL的MES(pH＝5.5)缓冲溶液中，超声形成均匀溶液，向其中分别加入2mol/L的EDC、NHS的MES溶液2mL，22℃充分搅拌活化6h。结束后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液洗3次除去过量的EDC与NHS。将产物再分散于10mL PBS缓冲溶液中，加入2mL的2mg/mL ConA的PBS溶液，4℃反应12h。PBS缓冲液洗3次得到棕黄色沉淀，即MNP-CD-ConA，于4℃下保存备用。
实施例3得到的磁性材料在分离富集N-糖蛋白上的应用，具体包括：
(1)将预处理好的MNP-CD-ConA(1mg)分散在300μL的Loading buffer(20mM Tris-HCl含150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2，pH＝7.4)中，向其中加入200μL辣根过氧化物酶和牛血清白蛋白混合溶液(1mg/ml)，室温孵育2h。
(2)将孵育好的MNP-CD-ConA通过外磁场分离，倒掉上清液。用200μL Loadingbuffer洗涤3次，磁分离后倒掉上清液。
(3)将洗涤好的MNP-CD-ConA用500μL Elution buffer(25mM Tris-HCl含500mMNaCl、500mMα-甲基-D-甘露糖苷，pH＝7.4)洗脱富集的辣根过氧化物酶，室温下孵育2h。外磁场分离后，取上清液测质谱，质谱图如图7所示。
实施例4
一种β-环糊精臂凝集素磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照质量分数35％，将对甲苯磺酰氯溶解在乙腈溶液中，慢慢滴加到β-环糊精(对甲苯磺酰氯：β-环糊精＝3：2摩尔比)的3.5％(质量分数)碱性溶液中，在0℃下剧烈搅拌3h，过滤取滤液，HCl中和后4℃过夜得白色沉淀，即OTs-CD。
(2)以乙二胺为强还原剂，按照16％质量分数将OTs-CD投入乙二胺中，75℃油浴12h。旋干乙二胺后热水溶解，乙醇沉淀并洗涤以除去过量的乙二胺。40℃真空干燥48h得2-NH2-CD。
(3)按照固液比6.4mmol：204mmol：7.3mL：29mL，将2-NH2-CD、ClCH2COOH、H2O和40％(质量分数)NaOH混合并搅拌至溶解，23℃水浴24h。无水甲醇析出，洗涤2-3次后冷冻干燥12h，得淡黄色固体即单2-NH2-6-COOH-CD。
(4)按照固液比8mmol：1.4mmol：36mmol：50mL，将FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O溶于乙二醇中，室温下搅拌溶解至呈均匀的棕黄色溶液后，转移至高温反应釜中，160℃反应12h。得到的黑色沉淀用蒸馏水和无水乙醇分别洗涤3-4次，60℃真空干燥得羧基化MNPs。
(5)将8mmol EDC、8mmol NHS溶于30mL 1g/L的羧基化MNPs溶液中，超声分散35min，用NaOH溶液调节pH至7，再加入10mL 5g/mL的2-NH2-6-COOH-CD溶液。25℃水浴反应16h，蒸馏水洗涤三次，40℃真空干燥48h得棕黑色沉淀即MNP-CD。
(6)将10mg的MNP-CD溶解在5mL的MES(pH＝5.5)缓冲溶液中，超声形成均匀溶液，向其中分别加入2mol/L的EDC、NHS的MES溶液1mL，23℃充分搅拌活化4h。结束后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液洗3次除去过量的EDC与NHS。将产物再分散于10mL PBS缓冲溶液中，加入1mL的2mg/mL ConA的PBS溶液，4℃反应16h。PBS缓冲液洗3次得到棕黄色沉淀，即MNP-CD-ConA，于4℃下保存备用。
实施例4得到的磁性材料在分离富集N-糖蛋白上的应用，具体包括：
(1)将预处理好的MNP-CD-ConA(1mg)分散在300μL的Loading buffer(20mM Tris-HCl含150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2，pH＝7.4)中，向其中加入200μL辣根过氧化物酶和牛血清白蛋白混合溶液(1mg/ml)，室温孵育2h。
(2)将孵育好的MNP-CD-ConA通过外磁场分离，倒掉上清液。用200μL Loadingbuffer洗涤3次，磁分离后倒掉上清液。
(3)将洗涤好的MNP-CD-ConA用500μL Elution buffer(25mM Tris-HCl含500mMNaCl、500mMα-甲基-D-甘露糖苷，pH＝7.4)洗脱富集的辣根过氧化物酶，室温下孵育2h。外磁场分离后，取上清液测质谱，质谱图如图8所示。
实施例5
一种β-环糊精臂凝集素磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照质量分数30％，将对甲苯磺酰氯溶解在乙腈溶液中，慢慢滴加到β-环糊精(对甲苯磺酰氯：β-环糊精＝3：2摩尔比)的3.2％(质量分数)碱性溶液中，在2℃下剧烈搅拌4h，过滤取滤液，HCl中和后4℃过夜得白色沉淀，即OTs-CD。
(2)以乙二胺为强还原剂，按照15％质量分数将OTs-CD投入乙二胺中，75℃油浴6h。旋干乙二胺后热水溶解，乙醇沉淀并洗涤以除去过量的乙二胺。40℃真空干燥48h得2-NH2-CD。
(3)按照固液比8.0mmol：254.5mmol：9.0mL：36.4mL，将2-NH2-CD、ClCH2COOH、H2O和40％(质量分数)NaOH混合并搅拌至溶解，22℃水浴18h。无水甲醇析出，洗涤2-3次后冷冻干燥12h，得淡黄色固体即单2-NH2-6-COOH-CD。
(4)按照固液比10mmol：1.75mmol：45mmol：62.5mL，将FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O溶于乙二醇中，室温下搅拌溶解至呈均匀的棕黄色溶液后，转移至高温反应釜中，180℃反应14h。得到的黑色沉淀用蒸馏水和无水乙醇分别洗涤3-4次，60℃真空干燥得羧基化MNPs。
(5)将8mmol EDC、8mmol NHS溶于30mL 1g/L的羧基化MNPs溶液中，超声分散40min，用NaOH溶液调节pH至8，再加入10mL 5g/mL的2-NH2-6-COOH-CD溶液。25℃水浴反应17h，蒸馏水洗涤三次，40℃真空干燥48h得棕黑色沉淀即MNP-CD。
(6)将10mg的MNP-CD溶解在5mL的MES(pH＝5.5)缓冲溶液中，超声形成均匀溶液，向其中分别加入2mol/L的EDC、NHS的MES溶液2mL，20℃充分搅拌活化2h。结束后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液洗3次除去过量的EDC与NHS。将产物再分散于10mL PBS缓冲溶液中，加入3mL的2mg/mL ConA的PBS溶液，4℃反应12h。PBS缓冲液洗3次得到棕黄色沉淀，即MNP-CD-ConA，于4℃下保存备用。
实施例5得到的磁性材料在分离富集N-糖蛋白上的应用，具体包括：
(1)将预处理好的MNP-CD-ConA(1mg)分散在300μL的Loading buffer(20mM Tris-HCl含150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2，pH＝7.4)中，向其中加入200μL辣根过氧化物酶和牛血清白蛋白混合溶液(1mg/ml)，室温孵育2h。
(2)将孵育好的MNP-CD-ConA通过外磁场分离，倒掉上清液。用200μL Loadingbuffer洗涤3次，磁分离后倒掉上清液。
(3)将洗涤好的MNP-CD-ConA用500μL Elution buffer(25mM Tris-HCl含500mMNaCl、500mMα-甲基-D-甘露糖苷，pH＝7.4)洗脱富集的辣根过氧化物酶，室温下孵育2h。外磁场分离后，取上清液测质谱，质谱图如图9所示。
实施例6
一种β-环糊精臂凝集素磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照质量分数40％，将对甲苯磺酰氯溶解在乙腈溶液中，慢慢滴加到β-环糊精(对甲苯磺酰氯：β-环糊精＝3：2摩尔比)的3.5％(质量分数)碱性溶液中，在2℃下剧烈搅拌6h，过滤取滤液，HCl中和后4℃过夜得白色沉淀，即OTs-CD。
(2)以乙二胺为强还原剂，按照17％质量分数将OTs-CD投入乙二胺中，70℃油浴24h。旋干乙二胺后热水溶解，乙醇沉淀并洗涤以除去过量的乙二胺。40℃真空干燥48h得2-NH2-CD。
(3)按照固液比8.8mmol：280mmol：10mL：40mL，将2-NH2-CD、ClCH2COOH、H2O和40％(质量分数)NaOH混合并搅拌至溶解，23℃水浴20h。无水甲醇析出，洗涤2-3次后冷冻干燥12h，得淡黄色固体即单2-NH2-6-COOH-CD。
(4)按照固液比8.2mmol：1.5mmol：37mmol：52mL，将FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O溶于乙二醇中，室温下搅拌溶解至呈均匀的棕黄色溶液后，转移至高温反应釜中，180℃反应16h。得到的黑色沉淀用蒸馏水和无水乙醇分别洗涤3-4次，60℃真空干燥得羧基化MNPs。
(5)将8mmol EDC、8mmol NHS溶于30mL 1g/L的羧基化MNPs溶液中，超声分散40min，用NaOH溶液调节pH至6，再加入10mL 5g/mL的2-NH2-6-COOH-CD溶液。25℃水浴反应17h，蒸馏水洗涤三次，40℃真空干燥48h得棕黑色沉淀即MNP-CD。
(6)将10mg的MNP-CD溶解在5mL的MES(pH＝5.5)缓冲溶液中，超声形成均匀溶液，向其中分别加入2mol/L的EDC、NHS的MES溶液2.5mL，22℃充分搅拌活化6h。结束后用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液洗3次除去过量的EDC与NHS。将产物再分散于10mL PBS缓冲溶液中，加入2mL的2mg/mL ConA的PBS溶液，4℃反应14h。PBS缓冲液洗3次得到棕黄色沉淀，即MNP-CD-ConA，于4℃下保存备用。
实施例6得到的磁性材料在分离富集N-糖蛋白上的应用，具体包括：
(1)将预处理好的MNP-CD-ConA(1mg)分散在300μL的Loading buffer(20mM Tris-HCl含150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2，pH＝7.4)中，向其中加入200μL辣根过氧化物酶和牛血清白蛋白混合溶液(1mg/ml)，室温孵育2h。
(2)将孵育好的MNP-CD-ConA通过外磁场分离，倒掉上清液。用200μL Loadingbuffer洗涤3次，磁分离后倒掉上清液。
(3)将洗涤好的MNP-CD-ConA用500μL Elution buffer(25mM Tris-HCl含500mMNaCl、500mMα-甲基-D-甘露糖苷，pH＝7.4)洗脱富集的辣根过氧化物酶，室温下孵育2h。外磁场分离后，取上清液测质谱，质谱图如图10所示。
以上所述仅为本发明的几种实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种β-环糊精臂凝集素磁性材料在制备分离富集N-糖蛋白材料中的应用，其特征在于，所述的β-环糊精臂凝集素磁性材料的制备方法包括以下步骤：
步骤一：将对甲苯磺酰氯溶液滴加到β-环糊精的碱性溶液中，在0-4℃下剧烈搅拌3-6h，得到对甲苯磺酰基单取代的β-环糊精OTs-CD；
步骤二：将步骤一得到的对甲苯磺酰基单取代的β-环糊精加到还原剂中，70-80℃油浴反应4h-24h，得到2位单取代的氨基β-环糊精2-NH2-CD；
步骤三：将步骤二得到的2-NH2-CD、ClCH2COOH、H2O和NaOH混合并搅拌至溶解，得到单2-NH2-6-COOH-CD；
步骤四：将FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O混合搅拌均匀后，在160-200℃反应12-16h，得到羧基化MNPs；
步骤五：将EDC、NHS溶于羧基化MNPs溶液中，超声分散，调节pH至6-8，再加入2-NH2-6-COOH-CD溶液反应，得到MNP-CD；
步骤六：将步骤五的MNP-CD溶解在缓冲溶液中，用EDC、NHS进行活化，再加入ConA溶液反应，得到β-环糊精臂凝集素磁性材料MNP-CD-ConA。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤一中对甲苯磺酰氯和β-环糊精的摩尔比为3：2。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤二还原剂为乙二胺。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的2-NH2-CD mmol：ClCH2COOH mmol：H2O mL：NaOH mL为4.4-8.8：140-280：5-10：20-40。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤四中FeCl3·6H2O、NaAc和Na3C6H5O7·2H2O摩尔比为4-12：0.7-2：18-55。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤五的反应时间为16-18h。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤六的反应温度为4℃，反应时间为12-16h。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤六中ConA溶液的浓度为2mg/mL。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的β-环糊精臂凝集素磁性材料外貌为球形，尺寸为250nm，具有顺磁性。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003035113A1 (de) * 2001-10-26 2003-05-01 Berlin Heart Ag Magnetische nanodispersion mit cyclodextrinen und verfahren zu ihrer herstellung
WO2016113762A1 (en) * 2015-01-15 2016-07-21 Council Of Scientific & Industrial Research Modified cyclodextrin coated magnetite nanoparticles for targeted delivery of hydrophobic drugs
CN109012629A (zh) * 2018-08-16 2018-12-18 南京大学 一种制备磁性羧甲基β-环糊精聚合物的方法及其应用
CN110396146A (zh) * 2019-07-11 2019-11-01 江苏大学 苯硼酸修饰磁性β-环糊精聚合物的制备方法及其选择性分离莽草酸的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003035113A1 (de) * 2001-10-26 2003-05-01 Berlin Heart Ag Magnetische nanodispersion mit cyclodextrinen und verfahren zu ihrer herstellung
WO2016113762A1 (en) * 2015-01-15 2016-07-21 Council Of Scientific & Industrial Research Modified cyclodextrin coated magnetite nanoparticles for targeted delivery of hydrophobic drugs
CN109012629A (zh) * 2018-08-16 2018-12-18 南京大学 一种制备磁性羧甲基β-环糊精聚合物的方法及其应用
CN110396146A (zh) * 2019-07-11 2019-11-01 江苏大学 苯硼酸修饰磁性β-环糊精聚合物的制备方法及其选择性分离莽草酸的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Efficient heavy metal ion removal by triazinyl-β-cyclodextrin functionalized iron nanoparticles;Amir Abdolmaleki等;《RCS Advance》;20151012(第5期);全文 *

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