CN113223616A - 一种筛选盐适应pl7家族褐藻胶裂解酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛选盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的方法。包括结合CAZy和NCBI数据库检索获取PL7家族褐藻胶裂解酶的氨基酸序列集；再对其氨基酸序列信息进行分析，以盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的盐适应特征指数为筛选依据进行特征排序，盐适应特征指数高的为高盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶，盐适应特征指数低的为低盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶。该方法借助于盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的氨基酸序列偏好性质，通过数据库检索、特征值筛选等手段最终得到高效表达特定盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的基因工程菌，其表达的PL7家族褐藻胶裂解酶具有特定的盐环境适应性，可用于高盐或低盐环境的褐藻生物催化降解。

Description

一种筛选盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的方法
技术领域
本发明涉及生物信息领域，尤其是一种筛选盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的方法。
背景技术
褐藻胶是海带等大型褐藻细胞壁的重要组分，褐藻胶裂解酶可通过消去反应使褐藻胶多糖的β-1,4糖苷键断裂，可对褐藻有效脱胶和降粘，并产生富含褐藻寡糖的高活性海藻提取液，用于动物饲料添加剂或植物有机肥料。
相比物理降解法和化学降解法，酶解法具有反应条件温和、过程易于控制、底物特异性强、产率高和节能环保等优点，所以以酶解法为代表的生物降解必然会逐步取代传统的化学降解，在未来的商业生产中占据优势地位。褐藻胶裂解酶可以基于消去反应使褐藻胶多糖的β-1,4糖苷键断裂，形成具有双键的褐藻寡糖。褐藻胶裂解酶属于多糖降解酶Polysaccharide Lyase(PL)家族，主要包括第5、第6、第7、第14、第15、第17和第18家族，目前见报道最多的为PL7家族的褐藻胶裂解酶。
PL7家族的褐藻胶裂解酶常表现出一定的盐激活性质，但是不同来源的褐藻胶裂解酶具有不同的最适盐浓度。在海带等大型褐藻加工过程中，具有高盐适应性的褐藻胶裂解酶可以在含盐量高的海水介质中保持可观的催化效率，与无盐适应性的酶在高盐浓度条件下会发生聚集变性不同，具有高盐适应性的酶可以在高盐浓度条件下维持蛋白的溶解性、结构的稳定性及活性，可减少褐藻加工过程的用水量，亦可适用于高盐环境或高盐废水的褐藻处理。
具有低盐适应性的褐藻胶裂解酶同样有着重要的应用，例如其在一些可以在含量量低或无盐介质中，具有高盐适应性的褐藻胶裂解酶常表现出很低的活性，而具有低盐适应性的褐藻胶裂解酶则可以发挥较高的催化效率，并且无需外加盐离子也有助于降低盐等物料的消耗，操作更为便捷，且后续产物纯化不会受高盐影响。因此，精准高效的开发具有特定盐适应性的褐藻胶裂解酶在绿色农业领域具有广阔的开发前景。
如何高效地发掘自然界盐适应性褐藻胶裂解酶，关键在于最大限度地减少因单一目的、重复研究所造成的人力、财力和物力等科研和自然资源严重浪费的共性问题。目前已见多种发掘手段，包括：1)对源于极端环境的样品的直接筛菌；2)宏基因组随机克隆筛选；3)酶三维结构的理性改造。其中，方法1和方法2需要浪费大量的人力物力，而方法3依赖于对目标酶蛋白结构和催化机理的前期研究，并且三种方法都严重依赖于一个高效的筛选手段，实现难度大。
得益于基因测序技术的发展，目前可通过NCBI等生物信息数据库获取大量微生物基因组的信息，为本发明奠定了基础，至今仍未见报道根据氨基酸组成偏好性进行盐适应性褐藻胶裂解酶酶的理性筛选和挖掘。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种筛选特定盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种筛选盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
样本集的建立：结合CAZy数据库和NCBI数据库，检索获取PL7家族褐藻胶裂解酶的氨基酸序列集；
盐适应性特征值筛选：对上述氨基酸序列集中的氨基酸序列信息进行分析，再以盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的盐适应特征指数为筛选依据进行特征排序，盐适应特征指数高的为高盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶，盐适应特征指数低的为低盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶。
进一步，还包括将筛选出的盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶对应带基因片段利用全基因合成手段获得；再将该基因片段与骨架质粒重组得到重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)得到盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的重组菌株。
进一步，所述对上述氨基酸序列集中的氨基酸序列信息进行分析为，获取碱性氨基酸数目占总蛋白的比值；其中碱性氨基酸为组氨酸、赖氨酸和精氨酸。
进一步，所述盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的盐适应特征指数为碱性氨基酸数目占总蛋白的比值，即HKR％。
本发明通过CAZy与NCBI收集到PL7家族褐藻胶裂解酶的氨基酸序列。提出一种利用计算机辅助筛选特定盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的方法，该方法利用盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的氨基酸序列偏好特征作为探针即指氨基酸序列偏好特征，是序列中碱性氨基酸数目占总蛋白的比值，即HKR％。通过数据库挖掘得到表达盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的氨基酸序列信息，利用基因工程手段构建高效表达重组盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的基因工程菌。相比传统筛选方法，藉助计算机辅助手段使得该筛选方法能更精确、高效地获得目标盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶。
本发明的有益效果：
1.本发明借助于盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的氨基酸序列偏好性质，通过数据库检索、特征值筛选、全基因合成和基因工程手段，最终得到高效表达特定盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的基因工程菌，其表达的PL7家族褐藻胶裂解酶具有特定的盐环境适应性，可用于高盐环境或低盐环境的褐藻生物催化降解。
2.现有技术一般通过对微生物酶基因的随机克隆表达或复杂的酶三维结构理性设计来获得具盐适应性的酶，随机性大导致大量人力物力的浪费，又或是高度依赖于对目标酶蛋白结构和催化机理的前期研究，并且都严重依赖于一个高效的筛选手段。本发明提供的方法可以避免随机性高和对结构、催化机理前期研究的依赖性，实现具特定盐适应性的PL7家族褐藻胶裂解酶的高效开发。
附图说明
图1为PL7家族褐藻胶裂解酶正电荷氨基酸含量与其适宜盐浓度的关联性分析示意图。
图2为数据库收录的弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶的HKR比例示意图。
图3为弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-1、Aly-2的SDS-PAGE图。
图4为弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-3、Aly-4的SDS-PAGE图。
图5为不同盐浓度对弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-1的酶活力的影响结果示意图。
图6为不同盐浓度对弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-2的酶活力的影响结果示意图。
图7为不同盐浓度对弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-3的酶活力的影响结果示意图。
图8为不同盐浓度对弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-4的酶活力的影响结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在下面的实施例中，如未明确说明，“％”指氨基酸数量的百分比。
如下实施例中仅针对某一菌属的PL7家族褐藻胶裂解酶进行筛选，其他菌属的具有盐适应性的PL7家族褐藻胶裂解酶也可采取相似的方法获得。
本发明所述碳水化合物活性酶数据库为Carbohydrate-Active enZymes，Cazy数据库；美国国家生物技术信息中心为National Center for Biotechnology Information，NCBI数据库。
实施例1：PL7家族褐藻胶裂解酶的序列和盐适应性数据收集
通过碳水化合物活性酶数据库获得已报道的PL7家族褐藻胶裂解酶及其氨基酸序列(登录CAZy网站的主页，界面中的“Enzyme Classes currently covered”酶类分类栏目中点击选择多糖裂解酶裂类(PLs)，选中PL Family Number栏目中的7，在跳出的网页中选择Characterized(已表征)，便可检索得到已报道的7家族的褐藻胶裂解酶)，再通过期刊数据库检索相关酶的论文，从学术论文中筛选出具有盐适应性数据的PL7家族褐藻胶裂解酶及其盐适应性数据。本发明数据收集遵循以下原则：1)将PL7家族褐藻胶裂解酶的适应盐浓度定义为达到80％最大酶活力时的盐浓度；2)将盐激活倍数定义为最大酶活力与无盐条件下酶活力的比值；3)排除了盐浓度未出现明显最大值的文献。最终经过筛选、整理得表1。
表1 已报道PL7家族褐藻胶裂解酶的盐适应性数据表
Figure BDA0003042115190000041
为了得到PL7家族褐藻胶裂解酶的氨基酸组成特征与其盐浓度之间的关系，发明人研究了PL7家族褐藻胶裂解酶的适宜盐浓度与氨基酸组成数据的关系，分析其中的关联性。通过对数据的分析，可以得到如下结论：PL7家族褐藻胶裂解酶的适宜盐浓度与带正电荷氨基酸组氨酸(Histidine，H)、赖氨酸(Lysine，K)、精氨酸(Arginine，R)的含量之和呈现良好的正相关(图1)，PL7家族褐藻胶裂解酶的带正电荷氨基酸含量越高，其最适盐浓度越高，而带正电荷氨基酸含量越低，其最适盐浓度越低。结果表明带正电荷氨基酸含量可作为具有特定盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的筛选开发，可大幅提高开发具特定盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的效率。
实施例2：计算机辅助筛选具盐适应性的弧菌属微生物PL7家族褐藻胶裂解酶
筛选获得具有高盐适应性的弧菌属微生物PL7家族褐藻胶裂解酶，以及具有低盐适应性的弧菌属微生物PL7家族褐藻胶裂解酶。以弧菌属微生物PL7家族褐藻胶裂解酶的筛选为例说明本发明的方法。首先，在Cazy数据库中检索，获得弧菌属微生物PL7家族褐藻胶裂解酶的Genebank号，利用Genebank号在NCBI基因组数据库获取对应的氨基酸序列，收集包含弧菌属微生物PL7家族褐藻胶裂解酶氨基酸信息，共获得90个弧菌属微生物PL7家族褐藻胶裂解酶的氨基酸信息，对其氨基酸序列信息进行分析，获取碱性氨基酸数目占总蛋白的比值HKR％作为盐适应性特征值，结果如表1和图2所示。选取HKR％为17.19％(1号，Aly-1)、15.85％(2号，Aly-2)、9.35％(3号，Aly-3)、9.09％(4号，Aly-4)的弧菌属微生物PL7家族褐藻胶裂解酶作为实验验证对象。
Aly-1对应的是SEQ ID NO:1；Aly-2对应的是SEQ ID NO:2；Aly-3对应的是SEQ IDNO:3；Aly-4对应的是SEQ ID NO:4。
SEQ ID No:1的氨基酸序列如下所示：
MKFKYLTLSTLIAMSSIASANVTFTDLNDKLGHPVDYPQYQSVLKASELQISDAKGKKSNKEYFALDGDFTGIVNPYFFVDKQSEALVFKMKNDHLRNEIRVHKNFRTDLPNQFYTLSSEVQIIDPLASMKDSDGKQDEITFLQVHNKGLDNEGTHNVPHPLLRVVWKKDAKGVKGHYWAIVKNNAVICKGSFGAKNKDKPFCKSDAAYTQYDLGKAPLDKTTAFDITVGNKMLKISVDGKTQVEHDIDYWRHLLSYFKAGVYNQFKNGMSEAHFYKLDFIESKS。
SEQ ID No:2的氨基酸序列如下所示：
MKHNVLIAAMALALPTFAIASDLNNGIDYPVPADKFDMRNWKITIPSDINEDGKVDEIEGVAMLSYSHKDFFFLNEEGNLVFEVHNKAVTTKNSKNARSELREMPRGADFSINTDDLQNHWALSSHPKAAEHSHVGGVLEATLKVDHVSEHAKFPEKGPAHSVVVGQIHAKKIDARIKEGKGYGHGNEPIKIFYKKFPGHEMGSVFWNYERNLAKNDPNRIDIAYPVWGNTWDNHDEPGKAGIALGEEFSYKIEVVGTMMNLTFETARHDTVTYAIDLSKGVDDKDFEHGYAEDMFYFKAGAYGQCSVSESHPVWGTGCAGTGDFAIDKKNGDYSSVTFSKLKLNGK。
SEQ ID No:3的氨基酸序列如下所示：
MLSRLNVKSSNNTRLSLLAMMISSLMLVGCGGSDEGSDNVSPPDSSGNSSGTITPDVGLDSQAAPSENFDLSAWYLGLPIDQNNDGKSDSIYEKELTAGFQYEPYFHTDMGDGGMVFLSYVSGPKTSTNTSYTRSELRSMLRRGDTSIKTQGVNMNNWVFGSAPVSDQLSAGGVDGTLTATLAVNHVTTTGDSSQVGRVIIGQIHANDDEPVRIYYRKLPKNSKGSIYIAHEPRDGYGSEQKYTMIGSQSSSASEPSDGIALNEKFSYRIKTNGDLLTVTIMRDNKPDIVQQVDMVNSGYNLGGQYMYFKAGVYNQNNTGDAKDYAQATFYHLEHEYGRAK。
SEQ ID No:4的氨基酸序列如下所示：
MEYRKLLLALMVAGLLGCGGGGSGGGGDLGSGDDVEDTVPELPDDENEEPTDPPEGPTEPPEEPSEPDDEIGAVAGWDINQWKITLPVSESYYKEHFGVGSDLNDRDSAAELIPADCAGKDTLTADTTLPYYVSHEGGRTHFIADLGDAGVATTTNTKYTRSELRGLYHYDTESRCSASAQNWAIPDKANHNLSATLRVEQYPNVSEPKVIVGQVHGYRIKQALIKLQWDGPSKDFRAIINNDFELDDQLCDASKCQPYSLRFEEVPAYEDFNYEIDVNATGIAITVNGVTQSVAWGERIESGEAMSVLNPAWADATNEYYFKAGIYPQIEPELNSGHVFDVSFSRIELTHE。
表2. 90个弧菌属微生物PL7家族褐藻胶裂解酶的盐适应性特征值表
Figure BDA0003042115190000061
Figure BDA0003042115190000071
Figure BDA0003042115190000081
Figure BDA0003042115190000091
Figure BDA0003042115190000101
实施例3：表达弧菌属微生物PL7家族褐藻胶裂解酶的基因工程菌株的构建方法
(1)通过全基因合成手段获得携带不同含量HKR％的弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶基因片段的PMD19-T载体，通过设计携带限制性内切酶NdeI和XhoI的引物，以携带目的基因的PMD19-T载体为模板进行PCR扩增。所用的高保真DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司，目的基因的扩增采用50μL体系，在0.2mL PCR管中加入下列成分。
Figure BDA0003042115190000102
反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸4min，28个循环后72℃保温5min。
(2)回收(1)的扩增产物，使用限制酶NdeI和XhoI对目的基因及表达载体pET-28a(+)进行双酶切。限制性内切酶购自中国大连TaKaRa生物公司，酶切体系如下所示。37℃酶切12h，4℃保存。
Figure BDA0003042115190000103
(3)将酶切完毕的目的基因与表达载体，在下面的反应体系使用T4连接酶在16℃连接30min后，将酶连完毕的载体导入购自中国大连TaKaRa公司E.coli BL21的感受态细胞。
Figure BDA0003042115190000104
Figure BDA0003042115190000111
(4)将(3)先涂布于含50μg/mL Kana抗性的LB固体培养基，37℃倒置培养16小时初筛；其次挑取阳性转化子至LB液体培养基50μg/mL Kana，37℃培养过夜，经下表菌液PCR反应体系验证后，送往厦大铂尚公司进行测序，并将测序结果与合成结果进行比对。并将高含量HKR重组菌株分别命名为Aly-1和Aly-2，低含量重组菌株分别命名为Aly-3和Aly-4。
Figure BDA0003042115190000112
实施例4：弧菌属PL7家族微生物褐藻胶裂解酶基因工程菌株的表达纯化
使用异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)进行重组PL7家族褐藻胶裂解酶菌株的诱导表达。加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.05mmol/L，16℃诱导20h后将菌液收集至200mL的离心管中，6500rpm/min离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在20mL的溶解缓冲液(溶解缓冲液配方为：0.3mol/L NaCl，15mmol/L咪唑，50mmol/L NaH2PO4，pH8.0)中，超声波破碎处理至菌液成半透明(参数设置为300w，超声时间5s，间歇时间5s，总工作时间15min)，11000rpm/min离心20min，上清与预先用溶解缓冲液平衡的Ni-NTA Agarose混匀，4℃结合1h，纯化过程按照纯化试剂盒(购自Qiagen公司)说明进行。纯化后使用重力型去盐柱将洗脱液置换为Tris-HCl缓冲液。结果见图3与图4，泳道M均为marker，图3为弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-1和Aly-2的SDS-PAGE图。可以看出，其中图1的A中的泳道1为PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-1的SDS-PAGE图，B中的泳道1为PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-2的SDS-PAGE图；图4的A中的泳道1为PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-3的SDS-PAGE图；B中的泳道1为PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-4的SDS-PAGE图。从图中可以看出，蛋白大小与实际相符。
实施例5：盐浓度对PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-1酶活的影响
通过测定酶液在4℃条件下与不同浓度的金属钠离子混合，使Na+离子的终浓度分别达到0mmol/L、200mmol/L、400mmol/L、600mmol/L、800mmol/L、1000mmol/L，并处理1h后测量残余酶活，以未被Na+离子处理的酶活力为100％，来研究金属钠离子对Aly-1酶活力的影响，结果见图5，图5为不同盐浓度对弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-1的酶活力的影响结果图。可以看出，Aly-1随着盐浓度的升高相对酶活逐渐地升高，在0mM至400mM之间，酶活较低，在600mM盐浓度才达到超过80％的酶活最大值，说明Aly-1需要在较高的盐浓度下才能发挥较好的催化效果，其无法在低盐环境发挥最大催化性能，适应于高盐环境。实验数据表明高HKR含量的Aly-1酶具有高盐适应性，符合本发明提出的PL7家族褐藻胶裂解酶的碱性氨基酸频率高则适应高盐环境的预测。
实施例6：盐浓度对PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-2酶活的影响
通过测定酶液在4℃条件下与不同浓度的金属钠离子混合，使Na+离子的终浓度分别达到0mmol/L、200mmol/L、400mmol/L、600mmol/L、800mmol/L、1000mmol/L，并处理1h后测量残余酶活，以未被Na+离子处理的酶活力为100％，来研究金属钠离子对Aly-2酶活力的影响，结果见图6，图6为不同盐浓度对弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-2的酶活力的影响结果图。可以看出，在0mM至600mM之间，Aly-2随着盐浓度的升高相对酶活逐渐地升高，在600mM盐浓度时达到超过80％的酶活值，600mM至1000mM之间，Aly-2随着盐浓度的升高相对酶活逐渐地降低，但Aly-2在盐浓度为600mM至800mM之间的盐浓度下才能发挥较好的催化效果，无法在低盐环境发挥最大催化性能，适应于高盐环境。实验数据表明高HKR含量的Aly-2酶具有高盐适应性，符合本发明提出的PL7家族褐藻胶裂解酶的碱性氨基酸频率高则适应高盐环境的预测。
实施例7：盐浓度对PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-3酶活的影响
通过测定酶液在4℃条件下与不同浓度的金属钠离子混合，使Na+离子的终浓度分别达到0mmol/L、200mmol/L、400mmol/L、600mmol/L、800mmol/L、1000mmol/L，并处理1h后测量残余酶活，以未被Na+离子处理的酶活力为100％，来研究金属钠离子对Aly-3酶活力的影响，结果见图7，图7为不同盐浓度对弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-2的酶活力的影响结果图。可以看出，Aly-3在盐浓度升高时相对酶活呈现出先上升在下降的趋势，在200mM盐浓度时即达到超过80％的酶活最大值，无需高盐环境即可发挥良好的催化性能，可在低盐环境下进行催化反应，适应于低盐环境。实验数据表明低HKR含量的Aly-3酶具有低盐适应性，符合本发明提出的PL7家族褐藻胶裂解酶的碱性氨基酸频率低则适应低盐环境的预测。
实施例8：盐浓度对PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-4酶活的影响
通过测定酶液在4℃条件下与不同浓度的金属钠离子混合，使Na+离子的终浓度分别达到0mmol/L、200mmol/L、400mmol/L、600mmol/L、800mmol/L、1000mmol/L，并处理1h后测量残余酶活，以未被Na+离子处理的酶活力为100％，来研究金属钠离子对Aly-4酶活力的影响，结果见图8，图8为不同盐浓度对弧菌属PL7家族褐藻胶裂解酶Aly-4的酶活力的影响结果图。可以看出，Aly-4在盐浓度升高时相对酶活呈现出先上升在下降的趋势，在200mM盐浓度时达到超过80％的酶活最大值，无需高盐环境即可发挥良好的催化性能，可在低盐环境下进行催化反应，适应于低盐环境。实验数据表明低HKR含量的Aly-4酶具有低盐适应性，符合本发明提出的PL7家族褐藻胶裂解酶的碱性氨基酸频率低则适应低盐环境的预测。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Figure BDA0003042115190000141
Figure BDA0003042115190000151
Figure BDA0003042115190000161
Figure BDA0003042115190000171
Figure BDA0003042115190000181
Figure BDA0003042115190000191
SEQUENCE LISTING
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<210> 1
<211> 285
<212> PRT
<213> Vibrio sp. dhg
<400> 1
Met Lys Phe Lys Tyr Leu Thr Leu Ser Thr Leu Ile Ala Met Ser Ser
1 5 10 15
Ile Ala Ser Ala Asn Val Thr Phe Thr Asp Leu Asn Asp Lys Leu Gly
20 25 30
His Pro Val Asp Tyr Pro Gln Tyr Gln Ser Val Leu Lys Ala Ser Glu
35 40 45
Leu Gln Ile Ser Asp Ala Lys Gly Lys Lys Ser Asn Lys Glu Tyr Phe
50 55 60
Ala Leu Asp Gly Asp Phe Thr Gly Ile Val Asn Pro Tyr Phe Phe Val
65 70 75 80
Asp Lys Gln Ser Glu Ala Leu Val Phe Lys Met Lys Asn Asp His Leu
85 90 95
Arg Asn Glu Ile Arg Val His Lys Asn Phe Arg Thr Asp Leu Pro Asn
100 105 110
Gln Phe Tyr Thr Leu Ser Ser Glu Val Gln Ile Ile Asp Pro Leu Ala
115 120 125
Ser Met Lys Asp Ser Asp Gly Lys Gln Asp Glu Ile Thr Phe Leu Gln
130 135 140
Val His Asn Lys Gly Leu Asp Asn Glu Gly Thr His Asn Val Pro His
145 150 155 160
Pro Leu Leu Arg Val Val Trp Lys Lys Asp Ala Lys Gly Val Lys Gly
165 170 175
His Tyr Trp Ala Ile Val Lys Asn Asn Ala Val Ile Cys Lys Gly Ser
180 185 190
Phe Gly Ala Lys Asn Lys Asp Lys Pro Phe Cys Lys Ser Asp Ala Ala
195 200 205
Tyr Thr Gln Tyr Asp Leu Gly Lys Ala Pro Leu Asp Lys Thr Thr Ala
210 215 220
Phe Asp Ile Thr Val Gly Asn Lys Met Leu Lys Ile Ser Val Asp Gly
225 230 235 240
Lys Thr Gln Val Glu His Asp Ile Asp Tyr Trp Arg His Leu Leu Ser
245 250 255
Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Phe Lys Asn Gly Met Ser Glu
260 265 270
Ala His Phe Tyr Lys Leu Asp Phe Ile Glu Ser Lys Ser
275 280 285
<210> 2
<211> 347
<212> PRT
<213> Vibrio sp. dhg
<400> 2
Met Lys His Asn Val Leu Ile Ala Ala Met Ala Leu Ala Leu Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ala Ile Ala Ser Asp Leu Asn Asn Gly Ile Asp Tyr Pro Val Pro
20 25 30
Ala Asp Lys Phe Asp Met Arg Asn Trp Lys Ile Thr Ile Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Asn Glu Asp Gly Lys Val Asp Glu Ile Glu Gly Val Ala Met Leu
50 55 60
Ser Tyr Ser His Lys Asp Phe Phe Phe Leu Asn Glu Glu Gly Asn Leu
65 70 75 80
Val Phe Glu Val His Asn Lys Ala Val Thr Thr Lys Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Leu Arg Glu Met Pro Arg Gly Ala Asp Phe Ser Ile
100 105 110
Asn Thr Asp Asp Leu Gln Asn His Trp Ala Leu Ser Ser His Pro Lys
115 120 125
Ala Ala Glu His Ser His Val Gly Gly Val Leu Glu Ala Thr Leu Lys
130 135 140
Val Asp His Val Ser Glu His Ala Lys Phe Pro Glu Lys Gly Pro Ala
145 150 155 160
His Ser Val Val Val Gly Gln Ile His Ala Lys Lys Ile Asp Ala Arg
165 170 175
Ile Lys Glu Gly Lys Gly Tyr Gly His Gly Asn Glu Pro Ile Lys Ile
180 185 190
Phe Tyr Lys Lys Phe Pro Gly His Glu Met Gly Ser Val Phe Trp Asn
195 200 205
Tyr Glu Arg Asn Leu Ala Lys Asn Asp Pro Asn Arg Ile Asp Ile Ala
210 215 220
Tyr Pro Val Trp Gly Asn Thr Trp Asp Asn His Asp Glu Pro Gly Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ile Ala Leu Gly Glu Glu Phe Ser Tyr Lys Ile Glu Val Val
245 250 255
Gly Thr Met Met Asn Leu Thr Phe Glu Thr Ala Arg His Asp Thr Val
260 265 270
Thr Tyr Ala Ile Asp Leu Ser Lys Gly Val Asp Asp Lys Asp Phe Glu
275 280 285
His Gly Tyr Ala Glu Asp Met Phe Tyr Phe Lys Ala Gly Ala Tyr Gly
290 295 300
Gln Cys Ser Val Ser Glu Ser His Pro Val Trp Gly Thr Gly Cys Ala
305 310 315 320
Gly Thr Gly Asp Phe Ala Ile Asp Lys Lys Asn Gly Asp Tyr Ser Ser
325 330 335
Val Thr Phe Ser Lys Leu Lys Leu Asn Gly Lys
340 345
<210> 3
<211> 341
<212> PRT
<213> Vibrio sp. BZM-1
<400> 3
Met Leu Ser Arg Leu Asn Val Lys Ser Ser Asn Asn Thr Arg Leu Ser
1 5 10 15
Leu Leu Ala Met Met Ile Ser Ser Leu Met Leu Val Gly Cys Gly Gly
20 25 30
Ser Asp Glu Gly Ser Asp Asn Val Ser Pro Pro Asp Ser Ser Gly Asn
35 40 45
Ser Ser Gly Thr Ile Thr Pro Asp Val Gly Leu Asp Ser Gln Ala Ala
50 55 60
Pro Ser Glu Asn Phe Asp Leu Ser Ala Trp Tyr Leu Gly Leu Pro Ile
65 70 75 80
Asp Gln Asn Asn Asp Gly Lys Ser Asp Ser Ile Tyr Glu Lys Glu Leu
85 90 95
Thr Ala Gly Phe Gln Tyr Glu Pro Tyr Phe His Thr Asp Met Gly Asp
100 105 110
Gly Gly Met Val Phe Leu Ser Tyr Val Ser Gly Pro Lys Thr Ser Thr
115 120 125
Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Ser Glu Leu Arg Ser Met Leu Arg Arg Gly
130 135 140
Asp Thr Ser Ile Lys Thr Gln Gly Val Asn Met Asn Asn Trp Val Phe
145 150 155 160
Gly Ser Ala Pro Val Ser Asp Gln Leu Ser Ala Gly Gly Val Asp Gly
165 170 175
Thr Leu Thr Ala Thr Leu Ala Val Asn His Val Thr Thr Thr Gly Asp
180 185 190
Ser Ser Gln Val Gly Arg Val Ile Ile Gly Gln Ile His Ala Asn Asp
195 200 205
Asp Glu Pro Val Arg Ile Tyr Tyr Arg Lys Leu Pro Lys Asn Ser Lys
210 215 220
Gly Ser Ile Tyr Ile Ala His Glu Pro Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Glu
225 230 235 240
Gln Lys Tyr Thr Met Ile Gly Ser Gln Ser Ser Ser Ala Ser Glu Pro
245 250 255
Ser Asp Gly Ile Ala Leu Asn Glu Lys Phe Ser Tyr Arg Ile Lys Thr
260 265 270
Asn Gly Asp Leu Leu Thr Val Thr Ile Met Arg Asp Asn Lys Pro Asp
275 280 285
Ile Val Gln Gln Val Asp Met Val Asn Ser Gly Tyr Asn Leu Gly Gly
290 295 300
Gln Tyr Met Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn Asn Thr Gly
305 310 315 320
Asp Ala Lys Asp Tyr Ala Gln Ala Thr Phe Tyr His Leu Glu His Glu
325 330 335
Tyr Gly Arg Ala Lys
340
<210> 4
<211> 352
<212> PRT
<213> Vibrio breoganii
<400> 4
Met Glu Tyr Arg Lys Leu Leu Leu Ala Leu Met Val Ala Gly Leu Leu
1 5 10 15
Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Leu Gly Ser Gly
20 25 30
Asp Asp Val Glu Asp Thr Val Pro Glu Leu Pro Asp Asp Glu Asn Glu
35 40 45
Glu Pro Thr Asp Pro Pro Glu Gly Pro Thr Glu Pro Pro Glu Glu Pro
50 55 60
Ser Glu Pro Asp Asp Glu Ile Gly Ala Val Ala Gly Trp Asp Ile Asn
65 70 75 80
Gln Trp Lys Ile Thr Leu Pro Val Ser Glu Ser Tyr Tyr Lys Glu His
85 90 95
Phe Gly Val Gly Ser Asp Leu Asn Asp Arg Asp Ser Ala Ala Glu Leu
100 105 110
Ile Pro Ala Asp Cys Ala Gly Lys Asp Thr Leu Thr Ala Asp Thr Thr
115 120 125
Leu Pro Tyr Tyr Val Ser His Glu Gly Gly Arg Thr His Phe Ile Ala
130 135 140
Asp Leu Gly Asp Ala Gly Val Ala Thr Thr Thr Asn Thr Lys Tyr Thr
145 150 155 160
Arg Ser Glu Leu Arg Gly Leu Tyr His Tyr Asp Thr Glu Ser Arg Cys
165 170 175
Ser Ala Ser Ala Gln Asn Trp Ala Ile Pro Asp Lys Ala Asn His Asn
180 185 190
Leu Ser Ala Thr Leu Arg Val Glu Gln Tyr Pro Asn Val Ser Glu Pro
195 200 205
Lys Val Ile Val Gly Gln Val His Gly Tyr Arg Ile Lys Gln Ala Leu
210 215 220
Ile Lys Leu Gln Trp Asp Gly Pro Ser Lys Asp Phe Arg Ala Ile Ile
225 230 235 240
Asn Asn Asp Phe Glu Leu Asp Asp Gln Leu Cys Asp Ala Ser Lys Cys
245 250 255
Gln Pro Tyr Ser Leu Arg Phe Glu Glu Val Pro Ala Tyr Glu Asp Phe
260 265 270
Asn Tyr Glu Ile Asp Val Asn Ala Thr Gly Ile Ala Ile Thr Val Asn
275 280 285
Gly Val Thr Gln Ser Val Ala Trp Gly Glu Arg Ile Glu Ser Gly Glu
290 295 300
Ala Met Ser Val Leu Asn Pro Ala Trp Ala Asp Ala Thr Asn Glu Tyr
305 310 315 320
Tyr Phe Lys Ala Gly Ile Tyr Pro Gln Ile Glu Pro Glu Leu Asn Ser
325 330 335
Gly His Val Phe Asp Val Ser Phe Ser Arg Ile Glu Leu Thr His Glu
340 345 350

Claims (4)

1.一种筛选盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
样本集的建立：结合CAZy数据库和NCBI数据库，检索获取PL7家族褐藻胶裂解酶的氨基酸序列集；
盐适应性特征值筛选：对上述氨基酸序列集中的氨基酸序列信息进行分析，再以盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的盐适应特征指数为筛选依据进行特征排序，盐适应特征指数高的为高盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶，盐适应特征指数低的为低盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶。
2.根据权利要求1所述筛选盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，还包括将筛选出的盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶对应带基因片段利用全基因合成手段获得；再将该基因片段与骨架质粒重组得到重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)得到盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的重组菌株。
3.根据权利要求1或2所述筛选盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，所述对上述氨基酸序列集中的氨基酸序列信息进行分析为，获取碱性氨基酸数目占总蛋白的比值；其中碱性氨基酸为组氨酸、赖氨酸和精氨酸。
4.根据权利要求1或2所述筛选盐适应PL7家族褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，所述盐适应性PL7家族褐藻胶裂解酶的盐适应特征指数为碱性氨基酸数目占总蛋白的比值，即HKR％。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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