CN113209077A

CN113209077A - 槲皮素类化合物在保护丙烯酰胺引起的肝毒性中的应用

Info

Publication number: CN113209077A
Application number: CN202110530693.5A
Authority: CN
Inventors: 陈琳; 冯宪超; 柴雨薇; 雷雪莹; 刘亚平; 范小静
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-05-15
Filing date: 2021-05-15
Publication date: 2021-08-06

Abstract

本发明涉及槲皮素类化合物在保护丙烯酰胺引起的肝毒性中的应用。本发明利用槲皮素、槲皮苷及金丝桃苷灌胃和AA处理小鼠，对肝脏进行氧化应激、自噬与凋亡相关蛋白表达检测，研究槲皮素类化合物对丙烯酰胺（AA）引起的肝毒性的体内保护机制。利用槲皮素、槲皮苷、槲皮素3‑β‑D‑葡萄糖苷及金丝桃苷预处理HepG2细胞，再用AA处理细胞，建立AA引起细胞自噬模型探究肝脏自噬发生下HepG2细胞变化，研究槲皮素类化合物的体外保护机制。本发明经研究证明槲皮素类化合物能通过影响细胞自噬、凋亡及氧化应激而对AA引起的肝损伤起到保护作用。本发明为解决AA引起的肝毒性提供一种思路，且为寻找更有效降低AA危害的槲皮素类化合物提供一定理论支持。

Description

槲皮素类化合物在保护丙烯酰胺引起的肝毒性中的应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及槲皮素类化合物在保护丙烯酰胺引起的肝毒性中的应用。

背景技术

丙烯酰胺（AA）是食物在高于120 ℃的条件下加热形成的危害物，主要由天冬酰胺和还原糖通过美拉德反应产生，具有神经毒性、生殖毒性、肝脏毒性以及潜在的致癌性。肝脏是人体代谢的重要器官，研究发现，AA会引起肝脏发生病理学变化，影响肝脏功能，引起肝细胞损伤。因此，如何减弱AA对机体的毒性成为待解决的一大话题。AA的危害控制方法有很多，主要分为物理控制与化学控制。物理控制主要是通过改变反应条件进而改变AA生成量，这种方法具有高效、简便的特点，但是控制反应条件可能会影响美拉德反应中风味物质的生成。因此，使用化学添加物的方法备受关注。其中，植物来源的天然多酚具有来源广、危害小的特点，在减弱AA引起的毒性上备受关注，槲皮素类化合物是天然多酚的一种，它们以槲皮素作为苷元连接不同糖苷，具有抗氧化、抗炎及抗癌等药理学功能。然而，槲皮素类化合物是否能减弱AA引起肝脏毒性，以及具体作用机制尚未清楚。

发明内容

本发明的目的在于从体内和体外两方面提供槲皮素类化合物——槲皮素、槲皮苷、槲皮素3-β-D-葡萄糖苷及金丝桃苷在保护AA引起的肝毒性中的应用。

本发明的技术方案如下所述。

1. 体内试验

（1）动物试验：对昆明小鼠进行槲皮素、槲皮苷及金丝桃苷（10 mg/kg bw/d）灌胃和AA处理；

（2）检测蛋白表达：将不同处理组小鼠肝脏组织提取总蛋白，利用Western blot对氧化应激、自噬和凋亡相关蛋白表达进行检测；

（3）检测SOD、MDA：使用试剂盒对肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）和脂质过氧化（MDA）水平进行检测；

（4）检测LC3II：利用免疫荧光对LC3II进行标记。

2. 体外实验

（1）细胞培养：人肝癌细胞HepG2购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，采用含10%胎牛血清和1%和青霉素-链霉素溶液（含青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml）的MEM培养基培养，培养箱设置37 ℃、5%CO2；

（2）细胞传代：待细胞长至皿底80%-90%时进行传代；

（3）细胞处理：用无血清培养基溶解的槲皮素、槲皮苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷及金丝桃苷（20 μM）处理细胞2 h，再用无血清培养基溶解的AA（4 mM）处理细胞24 h；

（4）检测蛋白表达：细胞处理后提取细胞蛋白，利用Western blot对氧化应激、自噬和凋亡相关蛋白表达进行检测；

（5）检测LC3II：利用免疫荧光对LC3II进行标记；

（6）观察自噬体：利用透射电镜观察细胞中的自噬体；

（7）检测MDA：使用试剂盒对细胞中脂质过氧化（MDA）水平进行检测；

（8）检测线粒体膜电位变化：利用JC-1作为荧光探针，检测线粒体膜电位变化；

（9）检测细胞凋亡：利用流式细胞术检测细胞凋亡。

附图说明

图1为不同处理组小鼠氧化应激相关蛋白表达。

图2为不同处理组小鼠肝脏SOD与MDA含量变化。

图3为不同处理组小鼠肝脏LC3转化水平。

图4为不同处理组小鼠肝脏LC3免疫荧光。

图5为不同处理组小鼠肝脏AKT/mTOR通路蛋白表达水平。

图6为不同处理组小鼠肝脏自噬通路相关蛋白表达。

图7为不同处理组小鼠肝脏线粒体凋亡通路相关蛋白表达。

图8为不同处理组小鼠肝脏内质网应激介导的凋亡通路相关蛋白表达。

图9为槲皮素类化合物对AA引起的HepG2细胞自噬相关蛋白表达的影响。

图10为AA及槲皮素类化合物处理下HepG2细胞中LC3II免疫荧光标记。

图11为AA及槲皮素类化合物处理下HepG2细胞透射电镜

（a）对照组；（b）丙烯酰胺处理组；（c）槲皮素+丙烯酰胺处理组；（d）槲皮苷+丙烯酰胺处理组；（e）槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷+丙烯酰胺处理组；（f）金丝桃苷+丙烯酰胺处理组。

图12为AA及槲皮素类化合物处理下HepG2细胞ROS染色

图13为槲皮素类化合物对AA引起HepG2细胞氧化应激相关蛋白表达的影响。

图14为HepG2细胞中MDA含量变化。

图15为AA及槲皮素类化合物处理下HepG2细胞JC-1染色。

图16为槲皮素类化合物对AA引起的细胞凋亡相关蛋白的影响。

图17为流式细胞术检测细胞凋亡。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的阐述说明，给出的实施例仅为了阐述本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1：

体内试验。

（1）动物试验：将80只体重为25-30 g的雄性昆明（KM）小鼠适应性饲养两周后，随机分成8组，每组10只，并按如下方式分组处理：

A：control组，生理盐水灌胃14 d；

B：AA处理组，生理盐水灌胃7 d后，50 mg/kg bw/d AA腹腔注射7 d；

C：槲皮素+AA组，10 mg/kg bw/d槲皮素灌胃7 d；在第八天，10 mg/kg bw/d槲皮素灌胃后，用50 mg/kg bw/d AA腹腔注射7d；

D：槲皮苷+AA组，10 mg/kg bw/d槲皮苷灌胃7 d；在第八天，10 mg/kg bw/d槲皮苷灌胃后，用50 mg/kg bw/d AA腹腔注射7 d；

E：金丝桃苷+AA组，10 mg/kg bw/d金丝桃苷灌胃7 d；在第八天，10 mg/kg bw/d金丝桃苷灌胃后，用50 mg/kg bw/d AA腹腔注射7 d；

F：槲皮素处理组，10 mg/kg bw/d槲皮素灌胃14 d；

G：槲皮苷处理组，10 mg/kg bw/d槲皮苷灌胃14 d；

H：金丝桃苷处理组，10 mg/kg bw/d槲皮苷灌胃14 d；

试验期间每只小鼠可自由进食、饮水。在第15天牺牲小鼠。立即从小鼠中切除肝脏组织，并用冰冷的生理盐水彻底清洗。将各组织分为两部分，一部分用于固定于4%多聚甲醛中用于组织学观察，一部分用液氮速冻后转至-80 ℃冰箱保存备用。

（2）组织蛋白提取：取冻存于-80 ℃的肝组织于2 ml离心管中，按照1：20比例添加组织蛋白提取液，利用手持匀浆器在冰浴中匀浆。匀浆液置于4 ℃离心机中，12000 r/min，离心5 min。取上清液5 μL，用组织蛋白提取液按照1：20比例稀释上清液，用于测定蛋白浓度。将牛血清白蛋白标准品（2 mg/mL）稀释至1.5、1、0.5、0.2、0 mg/mL，用于绘制标准曲线。将样品及标准品滴加96孔板中，设置四个平行孔（每孔5 μL），将BCA的A、B液按50:1比例混合，快速滴加至96孔板（每孔100 μL），放入37 ℃恒温箱中孵育30 min，于490 nm下测定吸光度值。根据测定的吸光度值，代入标准曲线，得出样品中蛋白浓度，利用组织蛋白提取液将每个样品蛋白浓度调一致。加入1/4体积的β-巯基乙醇上样缓冲液，100 ℃水浴锅中煮样5 min，取出冷却，于-80 ℃冰箱保存。

（3）Western blot（WB）：将-80 ℃冰箱保存的电泳样品4 ℃解冻，放入50 ℃恒温箱中烘样5 min。将电泳样及marker点入泳道内，先设置80 V，待样品跑到上下层胶分界线时，设置120 V继续将蛋白分离。将PVDF膜置于甲醇中，充分浸泡2 min进行活化，用蒸馏水冲洗两遍，加入转印液待用。利用半干转印的方法，按照转印滤纸-凝胶-PVDF膜-转印滤纸的顺序，根据目标蛋白分子量调整转印时间，进行转印。转印完成后，用5%脱脂牛奶封闭3h。TBST洗5次，每次8 min。选择目标蛋白对应的一抗进行孵育，4 ℃过夜。TBST洗5次，每次8min。根据一抗种类选择对应二抗，置于摇床，室温孵育2 h。TBST洗5次，每次8 min。将PVDF膜浸泡在ECL发光液中，采用 ChemiDox 凝胶成像***成像以及Quantity One 软件，对条带灰度进行图像采集和蛋白质条带灰度分析。

（4）免疫荧光：将石蜡包埋的组织切片室温放置1 h后，于二甲苯中浸泡2次，每次10 min。脱蜡后梯度复水，100%、95%、70%乙醇各浸泡各一次，每次5 min。PBS清洗2次，每次5min。采用煮沸热修复法，将0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）加热至95 ℃，将组织切片加热10 min，冷却后取出，用PBS清洗3次，每次5 min。滴加3%过氧化氢去离子水孵育15 min。PBS洗3次，每次5 min。滴加5%山羊血清，室温封闭30 min。滴加一抗（稀释比例1:100），4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，每次5 min。滴加带有荧光标记的二抗，室温避光孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。用含DAPI抗荧光衰减封片剂封片，自动荧光显微镜下拍照。

（5）超氧化物歧化酶（SOD）检测：取适量的肝组织样品，按照每10 mg组织加入100μL SOD样品制备液的比例在4 ℃或冰浴进行匀浆。4 ℃约12000 g离心5 min，取上清作为待测样品。按照总SOD活性检测试剂盒（WST-8法）试剂盒要求，进行WST-8/酶工作液及反应启动工作液的配制。样品及空白对照加入96孔板，加入WST-8/酶工作液和反应启动工作液，37 ℃孵育30 min，用酶标仪在450 nm下测定吸光度。

（6）脂质氧化（MDA）检测：按照（2）组织蛋白提取方法进行，BCA测定蛋白浓度后，将剩余上清液用于MDA含量测定。根据脂质氧化（MDA）检测试剂盒的要求，进行TBA储存液及MDA检测工作液的配制。取适量标准品用蒸馏水稀释至1、5、10、50、100、200 μM，制作标准曲线。将样品、标准品及空白对照中加入MDA检测工作液，混匀后，100 ℃水浴加热15分钟。冷却至室温，1000 g室温离心10 min。取200 μL上清加入到96孔板中，随后用酶标仪在532 nm测定吸光度。

实施例1体内试验结果表明：

（1）AA处理组的小鼠肝脏中HO-1、NQO1蛋白表达明显增加，而经槲皮素类化合物灌胃的小鼠能够明显逆转这种作用，且槲皮素类化合物单独处理不会引起HO-1、NQO1两种蛋白表达增加（图1），说明槲皮素类化合物能够下调AA引起的氧化应激水平增加。槲皮素类化合物能改善AA引起的SOD减少和MDA升高（图2），且三种槲皮素类化合物中槲皮苷的下调作用较强；

（2）槲皮素类化合物能减弱LC3的激活（图3、4），且槲皮素类化合物预处理组的小鼠肝脏中， AKT/mTOR信号通路的激活减弱（图5），beclin-1、Atg7蛋白表达减弱（图6），进一步说明了槲皮素类化合物对AA引起的肝损伤的保护作用体现在自噬通路的改变上；

（3）采用WB对线粒体凋亡（bax、bcl-2、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3）及内质网应激（BIP、CHOP、p-IRE1、cleaved-caspase-12）两条凋亡信号通路进行检测，确定AA会引起小鼠肝脏发生凋亡，并且槲皮素类化合物预处理会减弱AA引起的肝脏细胞凋亡（图7、8）。

实施例2：

体外实验。

（1）试验细胞株及其培养：人肝癌细胞HepG2购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，采用含10%胎牛血清和1%和青霉素-链霉素溶液（含青霉素100 U/ml，链霉素100μg/ml）的MEM培养基培养，培养箱设置37 ℃、5%CO2。

（2）细胞传代：待细胞长至皿底80%-90%时，细胞可进行传代。移除细胞培养基，用含有1%青霉素-链霉素的PBS洗一遍，加入2 mL0.25%胰酶消化液轻轻摇晃至覆盖皿底，转移至37 ℃细胞培养箱中孵育2 min，显微镜下观察细胞形态变圆即为消化完成，消化结束后迅速移除胰酶消化液，加入2 ml新鲜完全培养基，用移液枪轻轻吹打使细胞脱离皿底。待细胞与培养基混合均匀后转移至5 mL离心管，800 r/min离心5 min，取出后弃去上清，将沉淀中加入1 mL新鲜的完全培养基，轻轻重悬，取500 μL重悬液加入已装有10 mL培养基的培养皿中，轻轻摇晃至细胞在培养皿中分布均匀，放入37 ℃细胞培养箱中培养。

（3）细胞蛋白提取：细胞传代后，将细胞转移至60 mm培养皿中，培养至细胞覆盖皿底80%时，弃去培养基，用含有1%青霉素-链霉素的PBS洗一遍，开始处理细胞。先用无血清培养基溶解的槲皮素、槲皮苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷及金丝桃苷处理细胞2 h，再用无血清培养基溶解的AA处理细胞24 h。处理结束后，弃去培养基，加入1 mL冰PBS洗一遍，弃去PBS后，用滤纸延皿壁吸净皿底水分，后迅速转移至冰上。每皿细胞加入150 μL含有1%PMSF的细胞裂解液，轻轻摇晃至覆盖皿底，放置冰上裂解10 min。用细胞刮铲轻轻将细胞刮下，转移至1.5 mL离心管，12000 r/min，离心5 min。后续步骤与体内试验（2）相同。

（4）Western blot：与体内试验（3）相同。

（5）免疫荧光：细胞处理完毕，按照细胞传代步骤离心收集细胞。弃去上清加入1mLPBS重悬细胞，800 r/min离心5 min，取出后弃去上清，将沉淀中加入4%多聚甲醛，静置24 h。后续步骤与体内试验（4）相同。

（6）活性氧（ROS）检测：传代后将细胞接种在6孔板中，培养至覆盖皿底80%后处理细胞。处理完毕后，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μM。去除细胞培养液，加入1 mL稀释好的DCFH-DA。37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次。使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，在倒置荧光显微镜下观察拍照。

（7）线粒体膜电位（MMP）检测：传代后将细胞接种在6孔板中，培养至覆盖皿底80%后处理细胞。处理完毕后，PBS洗涤细胞一次，加入1 ml无血清培养基。按照线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）说明书要求配制JC-1染色工作液。6孔板中每孔加入1 ml JC-1染色工作液，充分混匀。在细胞培养箱中37 ℃孵育20 min。孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次，加入2 ml无血清培养基。使用激发波长485 nm，发射波长590 nm，在倒置荧光显微镜下观察拍照。

（8）脂质氧化（MDA）检测：与体内试验（6）相同。

（9）流式细胞术：细胞传代后，将细胞转移至60 mm培养皿中，培养至细胞覆盖皿底80%时，处理细胞。处理完毕后，按照传代的步骤离心收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数，使细胞总数为2×105个细胞/皿。1000 g离心5 min，弃去上清，加入195 μLAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。依次加入5 μLAnnexin V-FITC和10 μL碘化丙啶（PI）染色液，轻轻混匀。室温（20-25 ℃）避光孵育10-20 min，随后置于冰浴中。随后用流式细胞仪检测。

（10）透射电镜：细胞处理完毕，按照细胞传代步骤离心收集细胞。弃去上清加入1mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min，取出后弃去上清，将沉淀中加入2.5%戊二醛，4 ℃冰箱中固定24 h。去除戊二醛，用PBS洗三次，每次15 min，用1%锇酸室温下孵育4 h。PBS洗三次，每次10 min，进行梯度脱水、渗透。使用LR-White包埋，55 ℃聚合48 h。使用玻璃超微切片进行切片，利用5%乙酸铀酰染色20 min柠檬酸铅4 min。在透射电子显微镜下观察细胞内部结构变化。

实施例2体外试验结果表明：

（1）槲皮素类化合物预处理细胞，能减弱绿色荧光强度（图10），使AA引起的LC3的转化减弱，且槲皮素的减弱作用最强。对自噬上游的关键信号因子mTOR进行检测，四种槲皮素类化合物均能改善mTOR磷酸化水平（图9），减少细胞核周围自噬体（图11），抑制AA引起的自噬（图9）；

（2）槲皮素类化合物预处理细胞后，AA引起的ROS积累有所缓解（图12）。AA能上调HO-1、NQO1蛋白的表达，且槲皮素类化合物预处理均能减弱这种上调作用（图13）。AA处理能显著增强MDA含量，但四种槲皮素类化合物中，预处理槲皮苷不能降低MDA的上调（图14），有趣的是，槲皮苷在小鼠肝脏中具有更好的抑制AA引起的氧化应激的作用，这可能与槲皮苷在体内的生物利用度有关，具体机理值得进一步探讨；

（3）槲皮素类化合物能明显改善JC-1单体的增加，线粒体膜电位的下降，在这四种化合物中，槲皮素和金丝桃苷的减弱作用更加明显（图15），因此，可能对AA引起的细胞凋亡保护作用更强。AA处理能明显增加caspase-3的激活，而槲皮素类化合物预处理均能明显改善CHOP、BIP、xbp1的上调（图16）。且四种槲皮素类化合物预处理均能减弱细胞早期凋亡及晚期凋亡数量（图17）。由此可知，AA可以通过影响内质网应激，从而引发细胞凋亡，槲皮素类化合物预处理能减弱细胞凋亡。

Claims

1.槲皮素类化合物在保护丙烯酰胺（AA）引起的肝毒性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述丙烯酰胺（AA）引起的肝毒性为氧化应激、细胞自噬和细胞凋亡。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述槲皮素类化合物的应用为体内（昆明小鼠）和体外（HepG2细胞）两方面。

4.根据权利要求1、2、3所述的应用，其特征在于，槲皮素类化合物在体内保护的应用中所述槲皮素类化合物为槲皮素、槲皮苷及金丝桃苷，浓度为10 mg/kg bw/d。

5.根据权利要求1、2、3所述的应用，其特征在于，槲皮素类化合物在体外保护的应用中所述槲皮素类化合物为槲皮素、槲皮苷、槲皮素 3-β-D-葡萄糖苷及金丝桃，浓度为20 μM。