CN113207694A - 一种用于烟草愈伤组织培养的培养基及其制备方法和烟草愈伤组织培养的方法 - Google Patents

一种用于烟草愈伤组织培养的培养基及其制备方法和烟草愈伤组织培养的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于烟草愈伤组织培养的培养基及其制备方法和烟草愈伤组织培养的方法，属于植物组织培养技术领域。本发明提供的用于烟草愈伤组织培养，包括如下含量的组分：MS粉4.70～4.80g/L、蔗糖28～32g/L、NAA0.5～1.5mg/L、6‑BA0.2～0.5mg/L和琼脂6.5～7.5g/L；所述NAA和6‑BA的浓度比为(2～3):1；所述培养基的pH值为5.7～5.8。本发明提供的培养基诱导率高，且得到的烟草愈伤组织脱分化程度高、疏松程度好，生长速度快。实施例的结果表明，在本发明的培养基诱出率在70％以上，愈伤组织脱分化程度高、疏松程度良好，且呈白色，无褐变。

Description

一种用于烟草愈伤组织培养的培养基及其制备方法和烟草愈 伤组织培养的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种用于烟草愈伤组织培养的培养基及其制备方法和烟草愈伤组织培养的方法。
背景技术
植物组织培养技术，作为植物无菌培养技术的一种，是根据植物细胞全能性，在适宜的温度、湿度等条件下进行愈伤组织诱导的过程。诱导出的愈伤组织可在适宜培养基上进行继代培养，从而能够继续生长发育。
烟草属茄科烟草属的双子叶植物，是我国重要的经济作物。为了保证其优良性状的存在，也为了满足实验研究所需的快速大批量繁殖，黄花烟草的组织培养被广泛使用。由于不同外植体诱导愈伤的能力不同，不同培养基诱导愈伤的能力也不同。为减少客观因素对外植体诱导愈伤能力的影响，目前急需一种专门针对烟草愈伤组织培养的培养基和培养方法来提高烟草愈伤组织的诱导率，以保证其长势良好、脱分化程度高、疏松程度好。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于烟草愈伤组织培养的培养基及其制备方法和烟草愈伤组织培养的方法。本发明提供的培养基得到的烟草愈伤组织的诱导率和脱分化程度高、疏松程度良好，且生长速度快，方便后续实验的进行，提高工作效率和经济效益。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种用于烟草愈伤组织培养的培养基，包括如下含量的组分：MS粉4.70～4.80g/L、蔗糖20～30g/L、NAA 0.5～1.5mg/L、6-BA 0.2～0.5mg/L和琼脂6.5～7.5g/L；所述NAA和6-BA的浓度比为(2～3):1；所述培养基的pH值为5.7～5.8。
本发明提供了上述技术方案所述培养基的制备方法，包括如下步骤：将MS粉和蔗糖用超纯水溶解，调节pH，定容，添加琼脂，灭菌，在灭菌后的溶液中添加NAA和6-BA，得到培养基。
本发明提供了一种烟草愈伤组织的培养方法，采用上述技术方案中所述的培养基对烟草叶片依次进行诱导培养和继代培养，得到烟草愈伤组织。
优选的，所述烟草的种类包括黄花烟草和红花烟草。
优选的，包括如下步骤：
1)将烟草叶片进行切割，得到切割后的叶片组织；
2)将切割后的叶片组织接种到上述技术方案所述的培养基进行诱导培养；
3)将步骤2)诱导出的愈伤组织进行切割，得到愈伤组织块；
4)将步骤3)得到的愈伤组织块接种到上述技术方案所述的培养基中进行继代培养，得到烟草愈伤组织。
优选的，步骤1)所述烟草叶片选择培养50～60d的无菌苗的幼叶；所述切割后的叶片组织的边长为3～5mm。
优选的，步骤2)所述切割后的叶片组织的接种量为8～10个/60cm2。
优选的，步骤2)所述诱导培养的温度为22～28℃，诱导培养的时间为18～22d。
优选的，步骤3)所述愈伤组织块的大小为(5～10)mm×(5～10)mm×(5～10)mm。
优选的，步骤4)所述愈伤组织块的接种量为8～10个/60cm2。
优选的，步骤4)所述继代培养的温度为22～28℃，所述继代培养的时间为16～22d。
有益效果：
本发明提供了一种用于烟草愈伤组织培养的培养基，包括如下含量的组分：MS粉4.70～4.80g/L、蔗糖20～30g/L、NAA 0.5～1.5mg/L、6-BA 0.2～0.5mg/L和琼脂6.5～7.5g/L；所述NAA和6-BA的浓度比为(2～3):1；所述培养基的pH值为5.7～5.8。本发明提供的培养基诱导烟草愈伤的诱导率高，且得到的烟草愈伤组织的脱分化程度高、疏松程度良好，生长速度快。实施例的结果表明，在本发明的培养基进行烟草愈伤组织的诱导培养和继代培养，诱出率在70％以上，愈伤组织脱分化程度高、疏松程度良好，且呈白色，无褐变。
附图说明
图1为不同培养基对红花大金元愈伤诱导的结果图，其中第一排自左向右依次为采用对比例1、对比例8和实施例1培养基的结果；第二排自左向右依次为采用对比例2、对比例3和对比例4培养基的结果；第三排自左向右依次为采用对比例5、对比例6和对比例7培养基的结果；
图2为不同培养基对阳高小兰花愈伤诱导的结果图，其中第一排自左向右依次为采用实施例2、对比例9和对比例10培养基的结果；第二排自左向右依次为采用对比例8、实施例1和实施例3培养基的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于黄花烟草愈伤组织培养的培养基，包括如下含量的组分：MS粉4.70～4.80g/L、蔗糖20～30g/L、NAA 0.5～1.5mg/L、6-BA 0.2～0.5mg/L和琼脂6.5～7.5g/L；所述NAA和6-BA的浓度比为(2～3):1；所述培养基的pH值为5.7～5.8。
本发明优选在MS培养基的基础上进行配制。在本发明中，所述用于烟草愈伤组织培养的培养基中MS粉的浓度为4.70～4.80g/L，进一步优选为4.74g/L；所述蔗糖的浓度为20～30g/L，进一步优选为25～30g，更进一步优选为30g/L；所述NAA的浓度为0.5～1.5mg/L，进一步优选为0.75～1.0mg/L，更进一步优选为1.0mg/L；所述6-BA的浓度为0.2～0.5mg/L，进一步优选为0.3～0.5mg/L，更进一步优选为0.5mg/L；所述琼脂的浓度为6.5～7.5g/L，进一步优选为6.8～7.2g/L，更进一步优选为7g/L。在本发明中，所述NAA和6-BA的浓度比为(2～3):1，进一步优选为2:1。本发明对各组分的来源没有特殊要求，采用常规市售产品即可。在本发明中，MS粉提供组织细胞所需的基本营养物质；蔗糖能够提供细胞所需的碳源和能量；NAA是一种生长调节剂，能够促进细胞***与扩大；6-BA是细胞***素，可促进植物细胞生长，抑制植物叶绿素的降解，延缓叶片衰老。本发明将NAA和6-BA的浓度和比例调节到合适的范围，能够提高黄花愈伤组织的诱导率，且能够使愈伤组织保持良好的分化能力，且脱分化程度高、疏松程度良好，生长速度快等特性。
在本发明中，所述烟草的种类优选为黄花烟草和红花烟草。在本发明中，所述黄花烟草进一步优选包括阳高小兰花和马合烟，更进一步优选为阳高小兰花；在本发明中，所述红花烟草进一步优选包括红花大金元、K326和中烟100，更进一步优选为红花大金元。采用本发明的培养基培养阳高小兰花，诱导率和获得的愈伤组织的生长状况更好。
本发明提供了上述技术方案所述培养基的制备方法，包括如下步骤：将MS粉和蔗糖用超纯水溶解，调节pH，定容，添加琼脂，灭菌，在灭菌后的溶液中添加NAA和6-BA，得到培养基。本发明将MS粉和蔗糖用超纯水溶解，本发明对溶解的方式没有限定，能够充分溶解即可。溶解后，本发明调节溶液的pH并定容。定容后，本发明在定容后的溶液中添加琼脂。添加琼脂后，本发明将添加琼脂的溶液进行灭菌。在本发明中，所述灭菌优选为高压灭菌，所述高压灭菌的压力为0.12～0.12.5MPa，进一步优选为0.12Mpa；所述高压灭菌的温度优选为120～121℃，进一步优选为121℃；所述高压灭菌的时间优选为8～30min，进一步优选为15min。高压灭菌后，本发明将灭菌后并晾凉的溶液中添加NAA和6-BA，得到本发明的培养基。本发明将NAA和6-BA在灭菌后再添加，可以防止高温灭菌使NAA和6-BA高温分解，失去效力。
本发明提供了一种烟草愈伤组织的培养方法，采用上述技术方案中所述的培养基对烟草叶片依次进行诱导培养和继代培养，得到烟草愈伤组织。
在本发明中，烟草的类型优选与前述技术方案一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述所述烟草愈伤组织的培养方法，优选包括如下步骤：
1)将烟草叶片进行切割，得到切割后的叶片组织；
2)将切割后的叶片组织接种到上述技术方案所述的培养基进行诱导培养；
3)将步骤2)诱导出的愈伤组织进行切割，得到愈伤组织块；
4)将步骤3)得到的愈伤组织块接种到上述技术方案所述的培养基中进行继代培养，得到烟草愈伤组织。
本发明将烟草叶片进行切割，得到切割后的叶片组织。在本发明中，所述烟草叶片优选培养50～60d的无菌苗的幼叶，进一步优选为45d，选择此时期的叶片，愈伤组织的诱导效果最佳；在本发明中，所述切割后的叶片组织的边长为3～5mm，进一步优选为5mm，本发明对叶片组织进行切割，使叶片组织受到创伤刺激，促使新生组织形成。
得到切割后的叶片组织后，本发明将切割后的叶片组织接种到上述技术方案所述的培养基进行诱导培养。在本发明中，所述切割后的叶片组织的接种量优选为8～10个/60cm2，进一步优选为9个/60cm2。本发明特定的接种量既可保障愈伤组织合理的诱导率，又能保证诱导出结构松散的愈伤组织。在本发明中，所述诱导培养的温度优选为22～28℃，进一步优选为28℃；所述诱导培养的时间优选为18～22d，进一步优选为18d。本发明特定的诱导条件能够得到结构松散、快速***的愈伤组织。
诱导培养后，本发明将诱导出的愈伤组织进行切割，得到愈伤组织块。在本发明中，所述愈伤组织块的大小优选为(5～10)mm×(5～10)mm×(5～10)mm，进一步优选为5mm×5mm×5mm。对愈伤组织切割可增加基础愈伤组织的个数，增加愈伤组织与培养基的接触面积，提高愈伤组织总量。
得到愈伤组织块后，本发明将得到的愈伤组织块接种到上述技术方案所述的培养基中进行继代培养，得到黄花烟草愈伤组织。在本发明中，所述愈伤组织块的接种量优选为8～10个/60cm2，进一步优选为9个/60cm2。在本发明中，所述继代培养的温度优选为22～28℃，进一步优选为28℃；所述继代培养的时间优选为16～22d，进一步优选为18d。本发明特定的继代培养条件可有效保证愈伤组织的***活性。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种用于烟草愈伤组织培养的培养基及其制备方法和烟草愈伤组织培养的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种用于烟草愈伤组织培养的培养基，由如下含量的组分组成：MS 4.74g/L、蔗糖30g/L、NAA 1mg/L、6-BA 0.5mg/L和琼脂7g/L，所述诱导培养基的pH值为5.8。
制备方法：
将按照配比称量好的蔗糖、MS用超纯水溶解，然后调节溶液pH到5.8，用超纯水对调节pH值后的溶液进行定容；将定容后的液体倒入灭菌瓶中，将称量的琼脂粉倒入灭菌瓶中密封；将密封后的溶液放在高压灭菌锅里120℃条件下灭菌30min；将灭好菌的溶液在超净工作台里待冷却至60℃左右，在冷却后的溶液中加入NAA、6-BA摇匀，冷却凝固，得到上述培养基。
实施例2
一种用于烟草愈伤组织培养的培养基，由如下含量的组分组成：MS 4.74g/L、蔗糖30g/L、NAA 0.5mg/L、6-BA 0.2mg/L和琼脂7g/L，所述诱导培养基的pH值为5.8。
制备方法同实施例1。
实施例3
一种用于烟草愈伤组织培养的培养基，由如下含量的组分组成：MS 4.74g/L、蔗糖30g/L、NAA 1.5mg/L、6-BA 0.5mg/L和琼脂7g/L，所述诱导培养基的pH值为5.8。
制备方法同实施例1。
对比例1
培养基的配方同实施例1，不同之处在于：激素只添加6-BA，不添加NAA，6-BA的浓度为0.5mg/L。
制备方法同实施例1。
对比例2
培养基的配方同实施例1，不同之处在于：将NAA替换为2,4-D，其中，6-BA的浓度为0.5mg/L，2,4-D的浓度为0.5mg/L。
制备方法同实施例1。
对比例3
培养基的配方同实施例1，不同之处在于：激素同时添加NAA、6-BA和2,4-D，其中NAA的浓度为0.5mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，2,4-D的浓度为0.5mg/L。
制备方法同实施例1。
对比例4
培养基的配方同实施例1，不同之处在于：激素同时添加NAA、6-BA和2,4-D，其中NAA的浓度为1mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L(NAA：6-BA＝2)，2,4-D的浓度为0.5mg/L。
制备方法同实施例1。
对比例5
培养基的配方同实施例1，不同之处在于：将NAA替换为2,4-D，其中，6-BA的浓度为0.5mg/L，2,4-D的浓度为1mg/L。
制备方法同实施例1。
对比例6
培养基的配方同实施例1，不同之处在于：激素同时添加NAA、6-BA和2,4-D，其中NAA的浓度为0.5mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L(NAA：6-BA＝1)，2,4-D的浓度为1mg/L。
制备方法同实施例1。
对比例7
培养基的配方同实施例1，不同之处在于：激素同时添加NAA、6-BA和2,4-D，其中NAA的浓度为1mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L(NAA：6-BA＝2)，2,4-D的浓度为1mg/L。
制备方法同实施例1。
对比例8
培养基的配方同实施例1，不同之处在于：NAA的浓度为0.5mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L。
制备方法同实施例1。
对比例9
培养基的配方同实施例1，不同之处在于：NAA的浓度为1.0mg/L，6-BA的浓度为0.2mg/L。
制备方法同实施例1。
对比例10
培养基的配方同实施例1，不同之处在于：NAA的浓度为1.5mg/L，6-BA的浓度为0.2mg/L。
制备方法同实施例1。
实施例4
一种烟草愈伤组织的培养方法
烟草无菌苗的栽培
将烟草种子进行消毒灭菌处理，灭菌方法如下：在超净工作台里用消毒溶液消毒7min；将消毒后的种子用无菌水清洗3遍，无菌滤纸吸干种子上的水分；然后用灭菌后的牙签将种子点到MS培养基上，在28℃光照培养箱中培养一周，将长出母叶的幼苗在超净工作台中转到MS培养瓶中进一步生长直至长成健壮的植株。
其中，消毒溶液的配制方法为：将5mL次氯酸钠消毒液和50μLTween20加入无菌水定容到100mL，得到消毒溶液。
MS培养基由如下含量的组分构成：蔗糖30g/L、MS粉4.74g/L和琼脂7g/L。
愈伤组织培养
在超净工作台里，取上述培养得到的无菌苗外植体幼嫩叶片用手术刀将叶片进行切割，切割后的叶片组织的边长为3～5mm，得到切割后的叶片组织；将切割后的叶片组织接种到本发明的培养基进行诱导培养，其中，切割后的叶片组织的接种量为9个/60cm2，培养温度为28℃，培养时间为18d；在超净工作台里，用灭菌后的手术刀将诱导出的长势良好的愈伤组织与叶片分离，然后将长势良好的愈伤组织切割成大小5mm×5mm×5mm的小块，得到愈伤组织块；将得到的愈伤组织块接种到本发明的培养基中进行继代培养，愈伤组织块的接种量为9个/60cm2，继代培养的温度为28℃，继代培养的时间为7～21d，得到烟草愈伤组织。
实施例5
采用实施例1～3和对比例1～8的培养基培养“红花大金元”愈伤组织，培养方法同实施例4，考察不同配方的培养基对“红花大金元”愈伤组织培养的影响。不同培养基中激素的含量如表1，检测结果见表2和图1。
表1不同培养基中激素的含量
Figure BDA0003110287150000091
表2不同培养基对红花大金元愈伤诱导的影响
Figure BDA0003110287150000092
Figure BDA0003110287150000101
注：愈伤组织诱导率＝长出的愈伤组织块数/接种外植体总块数×100％。--表示没有数据可以记录。
图1为不同培养基对红花大金元愈伤诱导的结果图，其中第一排自左向右依次为采用对比例1、对比例8和实施例1培养基的结果；第二排自左向右依次为采用对比例2、对比例3和对比例4培养基的结果；第三排自左向右依次为采用对比例5、对比例6和对比例7培养基的结果。由表2和图1的结果可知，实施例1～3的诱导红花大金元愈伤组织的效果比对比例1～8的效果好，诱导率显著高于对比例，诱导后叶片膨大、增厚、出现白色愈伤。
实施例6
采用实施例1～3和对比例8～10的培养基培养“阳高小兰花”愈伤组织，培养方法同实施例4，考察不同配方的培养基对“阳高小兰花”愈伤组织培养的影响。不同培养基中激素的含量如表4，检测结果见表4和图2。
表3不同培养基中激素的含量
激素处理 NAA(mg/L) 6-BA(mg/L)
实施例1 1 0.5
实施例2 0.5 0.2
实施例3 1.5 0.5
对比例8 0.5 0.5
对比例9 1 0.2
对比例10 1.5 0.2
表4不同培养基对阳高小兰花愈伤诱导的影响
Figure BDA0003110287150000111
图2为不同培养基对阳高小兰花愈伤诱导的结果图，其中第一排自左向右依次为采用实施例2、对比例9和对比例10培养基的结果；第二排自左向右依次为采用对比例8、实施例1和实施例3培养基的结果。由图2和由表4可知，实施例1～3得到的愈伤组织生长状况良好，诱导率可达70～265％。对比例8和对比例10虽然愈伤组织诱导率较高，但是愈伤组织生长状况一般，对比例8的愈伤组织质地不够松散，出现颗粒状愈伤，对比例10的愈伤组织生长呈颗粒状，不利于叶片和愈伤组织的分离；对比例9愈伤组织生长一般，且诱导率也没有优势。
由以上实施例和应用例可知，本发明提供的培养基得到的烟草愈伤组织的诱导率和脱分化程度高(即愈伤组织的***活性高，***能力强，愈伤组织大，愈伤组织变大快)、疏松程度良好，且生长速度快。实施例的结果表明，在本发明的培养基进行烟草愈伤组织的诱导培养和继代培养，诱出率在70％以上，愈伤组织脱分化程度高、疏松程度良好，且呈白色，无褐变。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种用于烟草愈伤组织培养的培养基，其特征在于，包括如下含量的组分：MS粉4.70～4.80g/L、蔗糖20～30g/L、NAA 0.5～1.5mg/L、6-BA0.2～0.5mg/L和琼脂6.5～7.5g/L；所述NAA和6-BA的浓度比为(2～3):1；所述培养基的pH值为5.7～5.8。
2.权利要求1所述培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将MS粉和蔗糖用超纯水溶解，调节pH，定容，添加琼脂，灭菌，在灭菌后的溶液中添加NAA和6-BA，得到培养基。
3.一种烟草愈伤组织的培养方法，其特征在于，采用权利要求1所述的培养基对烟草叶片依次进行诱导培养和继代培养，得到烟草愈伤组织。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述烟草的种类包括黄花烟草和红花烟草。
5.根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将烟草叶片进行切割，得到切割后的叶片组织；
2)将切割后的叶片组织接种到所述的培养基进行诱导培养；
3)将步骤2)诱导出的愈伤组织进行切割，得到愈伤组织块；
4)将步骤3)得到的愈伤组织块接种到所述的培养基中进行继代培养，得到烟草愈伤组织。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤1)所述烟草叶片选择培养50～60d的无菌苗的幼叶；所述切割后的叶片组织的边长为3～5mm。
7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤2)所述切割后的叶片组织的接种量为8～10个/60cm2；
步骤2)所述诱导培养的温度为22～28℃，诱导培养的时间为18～22d。
8.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤3)所述愈伤组织块的大小为(5～10)mm×(5～10)mm×(5～10)mm。
9.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤4)所述愈伤组织块的接种量为8～10个/60cm2。
10.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤4)所述继代培养的温度为22～28℃，所述继代培养的时间为16～22d。
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