CN113189222A - 一种利用uhplc-qe-ms指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用UHPLC‑QE‑MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，属于生物技术领域，本发明包括样品制备、质谱检测、代谢物鉴定、指纹图谱建立和指纹图谱相关性及评价方法建立。本发明通过建立咖啡生豆指纹图谱，有益于全面反映所含化学成分的种类与数量，即能判断咖啡豆的共性，又能反映不同产地、不同品种、不同采收期、不同工艺的特性，还能对咖啡豆的质量作出全面***的评价，使其更加科学化、标准化。

Description

一种利用UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法
技术领域
本发明涉及一种利用UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，属于生物技术领域。
背景技术
咖啡为茜草科(Rubiaceae),咖啡属(coffea)热带作物，与茶叶、可可并称为世界三大 饮料，原产于埃塞俄比亚，主要分为小粒种、中粒种和大粒种。我国目前咖啡的主要种植地 在云南及海南地区，由于云南省气候兼具亚热带季风气候、热带季风气候、高原山地气候的 特点，区域差异和垂直变化十分明显，使得不同产区咖啡风味品质呈现多样化特点，并且云 南主要种植品种为阿拉比卡种(L.CoffeaArabica)，卡蒂姆亚种(Catimor)以及混有25％的 罗布斯塔(Robusta)血统的小粒咖啡，而海南也因为其特殊气候条件，主要种植中粒种罗布 斯塔咖啡。咖啡豆品质会在种植过程中会受到地理环境、气候、海拔、土壤肥沃程度等外界 因素影响，采摘过程中又经常将青果、黄果、病果、干果与正常果混合在一起，加工过程中 脱皮损伤、发酵过度、干燥程度、晒场超负荷工作、设备不足等都会对咖啡豆风味品质产生 显著影响。
代谢组学法是一种对植物中化合物分布进行全面探索的有效方法，它能够找出差异代谢 产物，对果实的品质和营养成分监控提供初步的理论支撑。指纹图谱分析法能够标示其化学 特征的色谱图或光谱图。已有前人将代谢组学方法如：核磁共振、同位素比率质谱、 (ESI)-(HR)MS(电子喷雾电离-质谱)、拉曼光谱、近红外光谱、LC-MS/MS和GC/MS等应用于咖啡品质评价及寻找特征标记物研究中，且每种方法都有各自己的优缺点。
建立不同地域、不同品种、不同年份咖啡豆的特征指纹图谱，对于全面地表征咖啡生豆 的物质组成及有效地控制咖啡生豆的质量，具有重要的意义。
发明内容
液相色谱-质谱被广泛应用于代谢组学分析并且性能稳定，本发明提供了一种利用 UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，相比ISSR指纹图鉴定法，更加灵敏、特异性强、 时间短、可同时快速分析鉴定多种化合物。本发明通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别咖啡 生豆的真伪或产地或品种；通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制定，能有效控制咖啡 生豆样品的质量均一性，确保样品质量的相对稳定性。该方法属于数字化鉴定，可以全面反 映咖啡生豆的物质成分，更高效便捷。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
所述的利用UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，该方法具体包括如下步骤：
(1)待测样品制备：咖啡生豆样品经液氮研磨后，称取20mg加入1000μL提取液中混匀；35Hz研磨处理4min，冰水浴超声5min，重复步骤3次；样品-40℃静置1h，4℃12000rpm 离心15min，得到上清液；
(2)UHPLC-QE-MS样品检测及质控：使用超高效液相色谱仪，通过Waters-ACQUITYUPLC HSS T3液相色谱柱对步骤(1)得到的上清液进行色谱检测和代谢物鉴定，采集质谱数据；
(3)对质谱数据进行数据处理，建立并获得指纹图谱及指纹图谱相关性分析，进行咖啡 生豆的品质、真伪、产地或品种的鉴定。
进一步的，步骤(1)中，提取液为甲醇、乙腈和水按体积比2：2：1制得，含同位素标记内标混合物(辛酸、Glutamic acid)。
进一步的，步骤(2)中，超高效液相色谱检测中流动相为：液相色谱A相为水相，含5mmol/L乙酸铵和5mmol/L乙酸，B相为甲醇。
进一步的，步骤(2)中，流动相的梯度洗脱程序为：0～1.2min,1％B；1.2-9.5min,1％～99％B； 9.5-11.8min,99％B；11.8-12.0min,99％～1％B；12-15min,1％B，进样体积2μL。
进一步的，步骤(2)中，采用ThermoQExactiveHFX质谱仪进行一级、二级质谱数据采 集；详细参数如下：Sheathgasflowrate:30Arb,Auxgasflowrate:10Arb,Capillarytemperature:350℃, Fullmsresolution:60000,MS/MSresolution:7500,Collisionenergy:10/30/60inNCEmode, SprayVoltage:4kV(positive)或-3.8kV(negative)。
进一步的，步骤(3)中，数据处理的具体方法：采用ProteoWizard软件及自主编写的R 程序包(内核为XCMS)进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB(V2.1)自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cutoff值设为0.3。
进一步的，步骤(3)中，指纹图谱建立的具体方法：采用“夹角余弦法”及自编R语言程序、Python分析。
进一步的，步骤(3)中，指纹图谱相关性及评估方法：与同位素内标混合物参比识别出 UHPLC-QE-MS测得的TIC图中的色谱峰化合物并进行相关性分析，相关系数大于0.9的化 合物可以作为判别咖啡生豆的特征标记及质量判别标记。
本发明还提供了一种3-羟基香豆素的新应用，即3-羟基香豆素作为评判指标在评判咖啡 生豆质量均一性方面的应用。
相对于现有技术，本发明的优点在于：
本发明通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别咖啡生豆的真伪或产地或品种；通过指纹图 谱主要特征峰的含量或比例的制定，能有效控制咖啡生豆样品的质量均一性，确保样品质量 的相对稳定性。该方法属于数字化鉴定，可以全面反映咖啡生豆的物质成分，更高效便捷。
本发明首次发现3-羟基香豆素也可作为评判咖啡生豆质量均一性的指标。
附图说明
图1是本发明的操作流程图；
图2是样品TIC图(A：正离子模式下；B：负离子模式下；C：QC质控样本正离子模 式下；D：QC质控样本负离子模式下)；
图3是QC样品PCA-X一维分布图；
图4是咖啡生豆PCA得分图；
图5是咖啡生豆的数字化UHPLC-QE-MS指纹图谱。
图6是咖啡生豆的热图，300dpi。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述。
如图1所示，一种咖啡生豆UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)原料选择及制备：将不同地区、不同品种、不同年份的咖啡生豆样品(表1)分别用液氮研磨后称取20mg，加入1000μL提取液(甲醇：乙腈：水＝2：2：1(V/V/V)，含 同位素标记内标混合物(辛酸、Glutamic acid)，涡旋混匀30s；35Hz研磨处理4min，超 声5min(冰水浴)；重复步骤3次；-40℃静置1h；将样品4℃，12000rpm离心15min； 取上清于进样瓶中上机检测。所有样品另取等量上清混合成QC样品上机检测。
表1咖啡样本
Figure BDA0003035971600000031
(2)UHPLC-QE-MS样品检测及质控：使用Vanquish(Thermo Fisher Scientific)超高效液 相色谱仪，通过WatersACQUITYUPLC HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相，含5mmol/L乙酸铵和5mmol/L乙酸，B 相为甲醇。采用梯度洗脱：0～1.2min,1％B；1.2-9.5min,1％～99％B；9.5-11.8min,99％B；11.8-12.0min,99％～1％B；12-15min,1％B，进样体积2μL。
Thermo Q Exactive HFX质谱仪进行一级、二级质谱数据采集。详细参数如下：Sheath gas flow rate:30Arb,Aux gas flow rate:10Arb,Capillary temperature:350℃,Full ms resolution: 60000,MS/MS resolution:7500,Collision energy:10/30/60in NCE mode,Spray Voltage:4kV (positive)或-3.8kV(negative)。
(3)数据处理及质控：原始数据经ProteoWizard软件转成mzXML格式后，使用自主编 写的R程序包(内核为XCMS)进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB(V2.1)自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cutoff值设为0.3。
(4)指纹图谱分析方法建立：将化合物鉴定列表中的正负离子各组原始数值分别进行排 序，以峰体积最大的化合物定为参比峰(分为正离子的和负离子的)，其他化合物均和参比 化合物做除法，得到与参比峰的比值，同时以中位数法建立共有峰(该共有峰组成为每个化 合物在其各产地峰体积中的中位数值)，然后对各个地区的每个化合物均按参比峰比值计算 RSD,按照RSD进行从小到大排序，按照化合物的数量(n),每间隔n/10个进行一次相似度计 算，计算方法采用“夹角余弦法”，并且用R语言软件分析。
(5)指纹图谱相关性及评估方法：经UHPLC-QE-MS测得咖啡生豆的总离子流质谱数据中的色谱峰进行质量数识别，以该色谱峰丰度最高的质谱峰所对应的精确质量数为该峰的 准分子离子峰(母离子)，每个母离子均为[M+H]+离子，因此以该准分子离子的精确质量数表示该色谱峰的质量数，将识别出TIC图中的色谱峰化合物进行相关性分析，相关系数大于0.9的化合物可以判别作为类似于身份认定的数字化信息物质，具有唯一性，能全面反映咖啡生豆的物质成分，可为咖啡生豆的特征标记及质量标准研究提供科学的数据。
结果分析
1.样品检测及过程质控
如图2(A，B)所示反应了样品在UHPLC-QE-MS中的离子流图状态(A，B)，以及 质控样品与离子流图之间的重叠性(C，D)，保证仪器稳定性，以及样品数据的准确性。由 图可知，QC样品TIC色谱峰保留时间和信号强度都重叠很好，说明仪器稳定性很好。
2.数据处理及数据质控
如图3所示，QC样品在PCA分析中的呈现。理论上讲，QC样品都是相同的，但是在 物质提取、检测分析过程中会有误差，导致QC样品间会有差异。这个差异越小说明整个方 法稳定性越好数据质量越高。QC样品全部位于±2STD之内，说明本次实验数据质量很高。
通过上述两个步骤都证明了咖啡豆样本质量状况良好，实验方法情况良好，仪器***稳 定性良好。
3.指纹图谱构建
本发明在正离子模式下从UPLC-QE-MS总离子色谱中提取了18622种化合物，负离子模 式下提取了12618种化合物。采用主成分分析(PCA)确定咖啡样品是否可以区分(如图4)。 咖啡样品的PCA得分图显示，咖啡样品可以分离成不同的组群。它还显示越南(YN)是一个离群值，但YN是罗布斯塔咖啡，其他的咖啡豆是属于阿拉比卡种豆，因此不能作为离群值删除。两种主成分(PC)解释了大部分变异，PC1和PC2分别解释了31.3％和15.0％，为 正离子模式，负离子模式为33.9％和17.0％。
接着对原始数据进行“夹角余弦法”计算咖啡豆各色谱图谱与参考色谱图谱(一组色谱图谱的代表性标准指纹色谱图谱)之间相似性的相关系数，并且使用R语言软件分析得到结果如 图5及表2所示。78种化合物的咖啡豆的相关系数均大于0.952，表现出不同咖啡豆之间品 质均一性及稳定性。这些已确定的化合物被分为多酚类化合物(17种)、脂肪酸类化合物(17 种)、生物碱类(7种化合物)、萜类(6种化合物)、糖类(5种化合物)、氨基酸(4种化合物)、 有机酸类和其他化合物。潜在的标记物包括多酚类(3-羟基香豆素、1,5-二咖啡酰奎宁酸和奎 宁酸)，这些化合物在预防疾病方面具有良好的效果。棕榈酰胺、亚油酰胺、油酰胺、LysoPC(18:1(11Z))属于脂肪酸，可以带来微妙而愉悦的味道，也是导致咖啡饮料质地和口感 的主要化合物。Melibiose不仅影响风味，还能提高免疫力对抗炎症。
4.咖啡生豆质量均一性指标评判确定
对正离子模式下从UPLC-QE-MS总离子色谱中提取了18622种化合物，负离子模式下提 取了12618种化合物。采用OPLS-DA法，对不同品种、不同产地、不同年份咖啡进行分类分析，将p-value值<0.05，Fold change≥2或≤0.5以及VIP值>1作为筛选标准。最终发现3-羟基香豆素、1,5-二咖啡酰奎宁酸和奎宁酸等化合物是主要差异代谢物(见图6)，可以被用于咖啡品质评价及产地溯源。
Figure BDA0003035971600000061
Figure BDA0003035971600000071
Figure BDA0003035971600000081
Figure BDA0003035971600000091
Figure BDA0003035971600000101
本发明方法表明：构建咖啡豆UPLC-QE-MS指纹图谱对于鉴别咖啡生豆产地、品种，控 制咖啡生豆样品的质量均一性，品质稳定性以及全面反映咖啡生豆的物质成分，更高效更便 捷。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种利用UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，其特征在于：该方法具体包括如下步骤：
（1）待测样品制备：咖啡生豆样品经液氮研磨后，称取20mg加入1000μL提取液中混匀；35Hz研磨处理4min，冰水浴超声5min，重复步骤3次；样品-40℃静置1h，4℃ 12000rpm离心15min，得到上清液；
（2）UHPLC-QE-MS样品检测及质控：使用超高效液相色谱仪，通过Waters-ACQUITY UPLCHSS T3液相色谱柱对步骤（1）得到的上清液进行色谱检测和代谢物鉴定，采集质谱数据；
（3）对质谱数据进行数据处理，建立并获得指纹图谱及指纹图谱相关性分析，进行咖啡生豆的品质、真伪、产地或品种的鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种利用UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，其特征在于：步骤（1）中，提取液为甲醇、乙腈和水按体积比2：2：1制得，含同位素标记内标混合物（辛酸、Glutamic acid）。
3.根据权利要求1所述的一种利用UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，其特征在于：步骤（2）中，超高效液相色谱检测中流动相为：液相色谱A相为水相，含5mmol/L乙酸铵和5mmol/L乙酸，B相为甲醇。
4.根据权利要求1或3所述的一种利用UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，其特征在于：步骤（2）中，流动相的梯度洗脱程序为：0~1.2min, 1%B; 1.2-9.5min, 1%~99%B;9.5-11.8min, 99%B; 11.8-12.0min, 99%~1%B; 12-15min, 1%B，进样体积2μL。
5.根据权利要求1所述的一种利用UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，其特征在于：步骤（2）中，采用ThermoQExactiveHFX质谱仪进行一级、二级质谱数据采集；详细参数如下：Sheathgasflowrate:30Arb, Auxgasflowrate:10Arb, Capillarytemperature:350℃, Fullmsresolution:60000, MS/MSresolution:7500, Collisionenergy:10/30/60inNCEmode, SprayVoltage:4kV(positive)或-3.8kV(negative)。
6.根据权利要求1所述的一种利用UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，其特征在于：步骤（3）中，数据处理的具体方法：采用ProteoWizard软件及自主编写的R程序包（内核为XCMS）进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB（V2.1）自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cutoff值设为0.3。
7.根据权利要求1所述的一种利用UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，其特征在于：步骤（3）中，指纹图谱建立的具体方法：采用“夹角余弦法”及自编R语言程序、Python分析。
8.根据权利要求1所述的一种利用UHPLC-QE-MS指纹图谱鉴定咖啡生豆的方法，其特征在于：步骤（3）中，指纹图谱相关性及评估方法：与同位素内标混合物参比识别出UHPLC-QE-MS测得的TIC图中的色谱峰化合物并进行相关性分析，相关系数大于0.9的化合物可以作为判别咖啡生豆的特征标记及质量判别标记。
9.3-羟基香豆素作为评判指标在评判咖啡生豆质量均一性方面的应用。
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