CN113189053B - 一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测方法及装置，属于光学传感技术领域；检测装置包括FP腔，FP腔包括平行设置的上反射镜和下反射镜，上反射镜为透光材质；上反射镜内表面设有金属层，下反射镜内表面设有介电泳电极，介电泳电极为位于下反射镜中心的圆形金属层和其外周的负极电极；将待测细胞溶液注入腔内的空隙；在圆形电极上施加正弦电压，使细胞在强物质‑光作用区域形成团簇；将光束照射到圆形电极上产生共振，通过监测反射共振光谱的波长偏移来测量细胞浓度；本发明解决了低浓度范围的细胞溶液检测问题，实现了对低细胞浓度的精确测量。

Description

一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测方法及装置
技术领域
本发明属于光学传感技术领域，具体涉及一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测方法及装置。
背景技术
细胞是生物代谢和功能的基本单位之一，细胞浓度被认为是各种生理状态的重要指标。例如已有研究展示确定血小板浓度，对肌腱基质合成有重要意义，有助于早期干预和治疗；中枢神经***少突胶质细胞的数量与运动神经元的正常功能密切相关；在微生物工程中，酵母细胞的浓度会影响发酵过程的产物产量。因此，高分辨率细胞浓度检测方法的发展引起了广泛的研究兴趣。早期的细胞浓度检测手段主要采取人工计数的方式，将细胞液滴加在细胞计数板的矩形框内，使用光学显微镜数出待测样品局部的细胞数量，再通过特定的计算方法估算整体样品细胞的数量以及浓度。从统计学的角度来看，样品量太小，因此其可靠性也会降低。其次，该方法不仅工作量大，检验效率低，而且过分依赖操作人员的工作经验和工作状态，容易导致测量错误。基于荧光标记的流式细胞仪是另一种较为常见的细胞浓度检测手段，但由于检测仪器（流式细胞仪）的成本极其昂贵，同时，荧光标记也会对细胞造成污染，导致细胞丧失活性，直接限制了其广泛应用。
近年利用介质折射率敏感的现象实现细胞浓度检测引起了研究者的注意。该方法是一种实现无标签、低成本和实时细胞浓度检测的可行方法。例如，通过使用局部表面等离子体共振(LSPR)吸收峰的移动来测量人体免疫球蛋白的浓度；使用光纤布拉格光栅(FBG)检测光合细菌(PSB)密度。然而，由于LSPR和FBG传感器基于倏逝波工作，它们的空间相互作用本质上受到倏逝波衰减特性的限制，因此只能检测到与传感器表面接触的样品。在体折射率传感中，光波可以完全穿透悬浮在体溶液中的目标样品，这对于超低浓度生物分析物检测特别有价值。法布里-珀罗(FP)腔作为一种可用于体折射率检测的经典光学结构，结构简单，易于集成，是细胞浓度检测的首选。虽然增加FP腔腔长可以实现更强的光-分析物相互作用，但也增加了准直的难度和所需的样品量。基于经典FP腔的细胞浓度检测器已不适用于当前应用。
介电泳是由于粒子的偶极子和电场的空间梯度的相互作用，粒子在非均匀电场中的运动。在非均匀电场中，由于介电性质不同产生粒子诱导偶极矩的大小及方向不同，从而粒子受力向电场强度高或者低的地方运动。基于介电泳效应，可以区分不同类型的粒子，实现多个粒子向特定区域的聚集。根据细胞和悬浮介质的介电特性，细胞可以被导向最大场强的区域或者最弱场强区域（这被称为正介电泳或负介电泳），为实现高分辨率的细胞浓度检测提供了解决方案。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提出一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测方法及装置，以实现高分辨率的细胞浓度检测，解决低浓度范围的细胞溶液检测问题，使细胞浓度检测具有更低的检测极限和更大的检测范围。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测装置，包括FP腔，FP腔包括平行设置的上反射镜和下反射镜，上反射镜内表面设置有金属层，下反射镜内表面设置有介电泳电极，所述介电泳电极由位于中心作为正极的圆形金属层，和位于圆形金属层外周作为负极的金属层组成；圆形金属层与作为负极的金属层相间隔；所述上反射镜为透光材质。
优选地，下反射镜的圆形金属层厚度为90-110nm，上反射镜的金属层厚度为25-30nm。
优选地，所述介电泳电极为先在下反射镜镀一金属层，再采用金属剥离法去除一条环状的金属层，以在下反射镜中心形成圆形电极，同时在圆形电极外周形成负极电极。
优选地，介电泳电极的制备方法包括以下步骤：
S1：在下反射镜基底上旋涂上光刻胶，然后将基底和刻有圆形电极结构图案的掩膜板固定；
S2：对固定好的基底进行充分曝光；
S3：曝光后，对基底上的光刻胶进行显影；
S4：采用磁控溅射镀膜方法在基底上镀金，然后剥离形成圆形电极和***的负极电极。
优选地，所述的金属层和圆形金属层的材质均为金。
优选地，所述上反射镜和下反射镜均为白玻璃。
一种采用所述装置的细胞浓度检测方法，包括以下步骤：
a）将待测细胞溶液注入上反射镜和下反射镜之间的空隙。
b）在圆形电极上施加正弦电压，使细胞向圆形电极移动并聚集在圆形电极内。
c）将光束照射到圆形电极上产生共振，通过监测反射共振光谱的波长偏移来测量细胞浓度。
优选地，上反射镜和下反射镜在检测前进行平行校准。
优选地，采用可调谐红外光纤激光器发射光束。
本发明是一种基于介电泳与FP腔的折射率传感器用于细胞浓度检测，利用的原理为当细胞悬浮液填充到FP腔中，向在圆形电极上施加正弦电压，由于极化效应与介质接触的细胞表面上的电荷被诱导形成电偶极子，并且它们的电性质会随着电场的变化而不断反转，使细胞向圆形电极移动。细胞积累完成后，光束照射到圆形电极上产生共振，并在空间上限制在空腔内。最终，这些空间积累的细胞通过强光-分析物相互作用，通过监测反射共振光谱的波长偏移来测量，得到所测细胞浓度，从而可以获得超高分辨率的细胞浓度测量。
本发明的检测原理为，当入射角和谐振腔长度一定时，吸收峰会随着腔中分析物的浓度变化导致的折射率变化而移动，图7和图8显示了细胞浓度不同其各自不同的谐振峰位置及细胞浓度与谐振波长之间的关系（图示检测细胞为酵母菌细胞）。
本发明相对于现有技术所产生的有益效果为：
1、本发明通过介电泳效应对细胞进行富集，富集后获得的细胞浓度约为初始浓度的50倍，使之具有更高的灵敏度，更低的检测极限和更大的检测范围。
2、本发明利用法珀腔入射角和谐振腔长度一定时，以检测到的吸收峰随着腔中分析物的细胞浓度变化导致的偏移距离大小，实现对低细胞浓度的精确测量。
3、本发明所述的检测装置制作简单、成本低、灵敏度高。
本发明利用介电泳富集原理提高实现细胞在强物质-光作用区域的团簇，同时利用法珀腔折射率传感机制实现了对细胞溶液的浓度传感。
附图说明
图1为实施例1所述的细胞浓度检测器的结构示意图。
图2为图1的侧视图。
图3为实施例所述细胞浓度检测器的下反射镜的俯视图。
图4为实施例所述细胞浓度检测器的上反射镜的仰视图。
图5为实施例2所述的实验平台的结构示意图。
图6为利用介电泳效应富集前及富集后比较图，其中a是电极两端未施加电场图，b是电极两端施加电场10分钟后的富集效果图（图中细胞浓度为49.419amol/ml，施加交流信号频率为100Hz，电压幅值为9VP-P）。
图7为实施例2中固定入射角度及固定腔长的谐振波长与反射率曲线图。
图8为实施例2中谐振波长与细胞浓度曲线图。
图中，1为镀金的普通透光白玻璃，2为带有圆形图案的镀金白玻璃，3为函数信号发生器，4为FP腔，5为光纤衰减器，6为光纤偏振控制器，7为可调谐红外光纤激光器，8为数字存储示波器，9为光电探测器，10为圆形电极，11为负极电极，A为最大宽度，B为环状间隙的宽度。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合实施例及附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。
实施例1
如图1所示，一种基于介电泳机理和法珀腔的细胞浓度检测器，包括FP腔及FP腔下层反射镜上的介电泳芯片电极。
所述FP腔结构如图2，主要包括上反射镜和下反射镜，上反射镜为镀金的普通透光白玻璃1（如图4），下反射镜为带有圆形图案的镀金白玻璃2（如图3），两反射镜调平行后，与中间空腔形成FP腔。其中，带有圆形图案的镀金白玻璃2上的圆形图案为一位于中心的圆形电极10，和位于圆形电极10外周与圆形电极10相隔离的负极电极11，圆形电极10为正极，二者组成介电泳电极。
所述介电泳电极的制备方法为下反射镜采用金属剥离（Lift-off）工艺去除一条环状的金属层在基底上形成。以15 × 15mm普通白玻璃为基底，此微电极的结构需要借助光刻工艺和磁控溅射。在此之前，使用CAD完成对电极结构的设计并制作掩膜版。
为提供良好的非均匀电场，带有圆形图案的镀金白玻璃2的金属层厚度为100纳米，为满足一定的透光率，镀金的普通透光白玻璃1上的金属层厚度为30纳米，带有圆形图案的镀金白玻璃2上的圆形电极如图3所示，其最大宽度A为600微米，酵母菌细胞的富集区域使电极分割为两部分的环状间隙的宽度B为300微米。
将待分析物放于FP腔，固定入射角和谐振腔长度，干涉形成的反射率谱线的吸收峰会随着腔中分析物的浓度变化导致的折射率变化而移动。
实施例2
采用实施例1所述的细胞浓度检测器进行检测，将该细胞浓度检测器与其他部件连接，形成实验平台，所述实验平台如图5所示，两面反射镜在实验前需要通过五维平移台进行平行校准，两平行面互相逼近获得设计需要的间隙，在测试时，将待测液体注入空隙。同时需进行准直调节，使光从高反射镜射入，经过FP腔后发生干涉，收集反射光获得干涉谱线。
首先将函数信号发生器3接到FP腔4的下反射镜的圆形电极上以提供正弦信号，可调谐红外光纤激光器7作为实验光源，输出端经过光纤偏振控制器6和光纤衰减器5，利用单模光纤准直器对入射激光进行准直，从高反射镜射入并利用光纤环形器收集反射光。反射光由光电探测器9转换为电压信号，与来自激光器的同步信号一起由数字存储示波器8记录，并进一步传输为DEP-FP传感***的反射光谱。
分别配置浓度为0.92×106cells/ml、2.08×106cells/ml、3.24×106cells/ml、4.40×106cells/ml和5.56×106cells/ml的酵母菌细胞溶液，向谐振腔内分别注入，仿真圆形图拟合得出如图7波长与反射率之间的关系图，计算得出谐振波长与细胞浓度之间的线性关系。如图8所示，显示了细胞浓度不同其各自不同的谐振峰位置及细胞浓度与谐振波长之间的关系（图示检测细胞为酵母菌细胞），斜率为2×10-7nm/（cells/ml）。最终该传感器能区分悬浮液的浓度范围为3.65×105cells/ml到1.80×107cells/ml，最低检测浓度为3.65×105cells/ml。通过测量这五种溶液的RI值，进一步得到传感器的灵敏度为1722nm/RIU。所得DEP-FP结构获得的检测极限与FP、LSPR传感结构相当，但是与传统的FP腔传感结构相比，本研究获得了更低的检测极限，两者相差108倍。获得的灵敏度是TFBG的3倍多，以上数据充分说明了DEP-FP传感结构的优良性能。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。

Claims (9)

1.一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测装置，其特征在于，包括FP腔，FP腔包括平行设置的上反射镜和下反射镜，上反射镜内表面设置有金属层，下反射镜内表面设置有介电泳电极，所述介电泳电极由位于中心作为正极的圆形金属层，和位于圆形金属层外周作为负极的金属层组成；圆形金属层与作为负极的金属层相间隔；所述上反射镜为透光材质。
2.根据权利要求1所述的一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测装置，其特征在于，下反射镜的圆形金属层厚度为90-110nm，上反射镜的金属层厚度为25-30nm。
3.根据权利要求1所述的一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测装置，其特征在于，所述介电泳电极为先在下反射镜镀一金属层，再采用金属剥离法去除一条环状的金属层，以在下反射镜中心形成圆形电极，同时在圆形电极外周形成负极电极。
4.根据权利要求3所述的一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测装置，其特征在于，介电泳电极的制备方法包括以下步骤：
S1：在下反射镜基底上旋涂上光刻胶，然后将基底和刻有圆形电极结构图案的掩膜板固定；
S2：对固定好的基底进行充分曝光；
S3：曝光后，对基底上的光刻胶进行显影；
S4：采用磁控溅射镀膜方法在基底上镀金，然后剥离形成圆形电极和***的负极电极。
5.根据权利要求1所述的一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测装置，其特征在于，上反射镜内表面设置的金属层、圆形金属层以及位于圆形金属层外周作为负极的金属层的材质均为金。
6.根据权利要求1所述的一种基于介电泳和法珀腔的细胞浓度检测装置，其特征在于，所述上反射镜和下反射镜均为白玻璃。
7.一种采用如权利要求1-6任意一项所述装置的细胞浓度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）将待测细胞溶液注入上反射镜和下反射镜之间的空隙；
b）在圆形电极上施加正弦电压，使细胞向圆形电极移动并聚集在圆形电极内；
c）将光束照射到圆形电极上产生共振，通过监测反射共振光谱的波长偏移来测量细胞浓度。
8.根据权利要求7所述的细胞浓度检测方法，其特征在于，上反射镜和下反射镜在检测前进行平行校准。
9.根据权利要求7所述的细胞浓度检测方法，其特征在于，采用可调谐红外光纤激光器发射光束。
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