CN113186153B - Prmt5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用 - Google Patents

Prmt5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113186153B
CN113186153B CN202110407061.XA CN202110407061A CN113186153B CN 113186153 B CN113186153 B CN 113186153B CN 202110407061 A CN202110407061 A CN 202110407061A CN 113186153 B CN113186153 B CN 113186153B
Authority
CN
China
Prior art keywords
spermatogonial stem
stem cells
prmt5 inhibitor
epz015666
mouse
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110407061.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113186153A (zh
Inventor
赵小阳
李朝晖
姚昭锴
罗芳
万聪
常港
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Medical University
Original Assignee
Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Medical University filed Critical Southern Medical University
Priority to CN202110407061.XA priority Critical patent/CN113186153B/zh
Publication of CN113186153A publication Critical patent/CN113186153A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113186153B publication Critical patent/CN113186153B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了PRMT5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用。其中，所述PRMT5抑制剂包括EPZ015666和GSK3326595，所述PRMT5抑制剂的使用浓度为0.1～10μM。本发明中的PRMT5抑制剂在促进体外培养过程中精原干细胞的持续增殖有明显促进作用，而且对灵长类精原干细胞也有同样效果，从而可以用于精原干细胞的再生与体外长期培养，以及修复***导致的精原干细胞数量减少等问题，为不育症的临床治疗提供了一种新的药物选择。

Description

PRMT5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及PRMT5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用。
背景技术
精原干细胞是一种处于未分化状态的生殖细胞，存在于所有雄性哺乳动物的睾丸中，分布于睾丸曲细精管中的基底膜上。当雄性哺乳动物进入***后，睾丸中功能正常的精原干细胞将持续不断的产生***并进行自我更新以维持一定的干细胞数量。当精原干细胞受到损伤或存在功能缺陷时，则会影响到***的产生，从而引发不育。
不育症是一种全球性问题，约有15％的育龄夫妇存在不育症问题，而且，由于环境等外部因素的影响使这一比例呈现出逐年上升的趋势。其中，由男性因素导致的不育约占50％。男性的弱精、少精、无精症中部分由配子发生障碍导致的。这种情况多是因为病人没有高质量的精原干细胞进而无法得到健康成熟的雄性配子导致的。而相关技术中，尚不具有效药物或手术等辅助生殖技术进行治疗的方法。目前临床上的解决办法是使用***库的供精生育，因此，对于这些病人而言，实际上无法得到真正生物学意义的后代。
因此，为了解决上述问题，开发一种能够基于药物手段治疗因精原干细胞损伤导致的不育症的方法对于临床医学和不育症患者具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出PRMT5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用，能够基于药物治疗的方式实现对精原干细胞体内损伤后再生及体外培养中可维持持续增殖的技术效果，具有极高的临床应用价值。
本发明的第一个方面，提供PRMT5抑制剂在制备促进精原干细胞损伤再生试剂中的应用。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述化合物包括以下(1)至(4)中的至少一种：
(1)EPZ015666或其药学上可接受的盐；
(2)GSK3326595及其药学上可接受的盐；
(3)EPZ015666同系物；
(4)GSK3326595同系物。
本发明中所述的PRMT5抑制剂包括但不局限于EPZ015666和GSK3326595，及其盐和同系物。
其中，EPZ015666的CAS号为：1616391-65-1，化合物名称为N-[(2S)-3-(3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)-2-羟基丙基]-6-(3-氧杂环丁基氨基)-4-嘧啶甲酰胺，其结构式如式I所示：
其中，GSK3326595的CAS号为：1616392-22-3，化合物名称为6-[(1-acetylpiperidin-4-yl)amino]-N-[(2S)-3-(3,4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl)-2-hydroxypropyl]pyrimidine-4-carboxamide，其结构式如式II所示：
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述PRMT5抑制剂的使用浓度为0.1～10μM。
在本发明的一些优选实施方式中，所述PRMT5抑制剂的使用浓度为1～2μM。
本发明利用小鼠精原干细胞的体外培养体系，在培养成分中去除对精原干细胞自我更新的维持起关键作用的细胞因子(GDNF细胞因子)，从而在体外建立一种精原干细胞无法维持长期自我更新的“困境”体系，进而运用此体系，发现EPZ015666和GSK3326595等PRMT5抑制剂可在此体系下有效维持有功能的精原干细胞的长期自我更新。发明人进一步对此进行探索发现，这些PRMT5抑制剂在灵长类动物实验上也可在体外培养过程中有效维持精原干细胞的存活，具有极高的泛用性和普适性。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述精原干细胞损伤包括因化疗药物引起的精原干细胞损伤。
在本发明的一些优选实施方式中，所述化疗药物包括白消安。
本发明的第二个方面，提供PRMT5抑制剂在制备促进精原干细胞增殖试剂中的应用。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述化合物包括以下(1)至(4)中的至少一种：
(1)EPZ015666或其药学上可接受的盐；
(2)GSK3326595及其药学上可接受的盐；
(3)EPZ015666同系物；
(4)GSK3326595同系物。
本发明中所述的PRMT5抑制剂包括但不局限于EPZ015666和GSK3326595，及其盐和同系物。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述PRMT5抑制剂的使用浓度为0.1～10μM。
在本发明的一些优选实施方式中，所述PRMT5抑制剂的使用浓度为1～2μM。
本发明先利用小鼠精原干细胞的体外培养体系，在培养成分中去除对精原干细胞自我更新的维持起关键作用的细胞因子(GDNF细胞因子)，从而在体外建立一种精原干细胞无法维持长期自我更新的“困境”体系，进而运用此体系，发现EPZ015666和GSK3326595等PRMT5抑制剂可在此体系下有效促进正常状态或病理状态下的精原干细胞持续增殖。发明人进一步对此进行探索发现，这些PRMT5抑制剂在灵长类动物实验上也能够显示出良好的促增殖效果，具有极高的泛用性和普适性。
本发明的第三个方面，提供PRMT5抑制剂在制备男性避孕药物中的应用。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述化合物包括以下(1)至(4)中的至少一种：
(1)EPZ015666或其药学上可接受的盐；
(2)GSK3326595及其药学上可接受的盐；
(3)EPZ015666同系物；
(4)GSK3326595同系物。
本发明中所述的PRMT5抑制剂包括但不局限于EPZ015666和GSK3326595，及其盐和同系物。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述PRMT5抑制剂的使用浓度为0.1～10μM。
在本发明的一些优选实施方式中，所述PRMT5抑制剂的使用浓度优选为1～2μM。
本发明中的PRMT5抑制剂能够抑制靶点Prmt5酶活性，进而抑制精原干细胞的分化启动，解除药物使用后，精原干细胞可重新恢复分化启动能力，不影响生育力的恢复，从而可以作为潜在男性避孕药物使用。
本发明的有益效果是：
本发明公开了PRMT5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用，通过试验验证，本发明中的PRMT5抑制剂(EPZ015666和GSK3326595)在促进体外培养过程中精原干细胞的持续增殖有明显促进作用，而且该促进作用对灵长类精原干细胞也有同样效果，从而可以用于精原干细胞的再生与体外长期培养，以及修复***导致的精原干细胞数量减少等问题，为不育症的临床治疗提供了一种新的药物选择。
附图说明
图1为本发明实施例中的小鼠精原干细胞克隆细胞的细胞成像图，其中，明场标尺为100μm，局部放大标尺为20μm；
图2为本发明实施例中的小鼠精原干细胞克隆细胞的培养天数与存活细胞数关系图；
图3为本发明实施例中的小鼠精原干细胞克隆细胞的免疫荧光图像；
图4为本发明实施例中的不同浓度梯度的EPZ015666和GSK3326595对细胞活性的影响；
图5为本发明实施例中的精原干细胞移植后的小鼠照片；
图6为本发明实施例中的小鼠体内精原干细胞移植情况，A为精原干细胞在小鼠睾丸的分布情况，B为移植的精原干细胞的免疫荧光图像；
图7为本发明实施例中的小鼠体内精原干细胞增殖的免疫荧光图像；
图8为PRMT5抑制剂对正常生理状态小鼠的促进精原干细胞再生的实验示意图；
图9为本发明实施例中的不同浓度EPZ015666对正常生理状态小鼠的促进精原干细胞再生效果对比图；
图10为PRMT5抑制剂对白消安诱导化疗模型小鼠的促进精原干细胞再生的实验示意图；
图11为本发明实施例中的EPZ015666对白消安诱导化疗模型小鼠的促进精原干细胞再生效果对比图；
图12为PRMT5抑制剂处理后的人曲细精管中精原干细胞存活情况的免疫荧光图像(A)和对应的统计图(B)；
图13为本发明实施例中的PRMT5抑制剂处理后的人曲细精管中精原干细胞增殖情况的免疫荧光图像(A)和对应的统计图(B)。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实验材料
1.小鼠精原干细胞系的构建：
本发明实施例中所用的小鼠精原干细胞系包括任意根据现有技术中已公开的可长期体外传代的具有精原干细胞特性的小鼠源精原干细胞系，并无限制要求。
其中，本发明实施例中所用的小鼠精原干细胞系的构建可参考2003年发表在国际期刊Biology of Reproduction上由Mito Kanatsu-Shinohara等发表的名为《Long-TermProliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male GermlineStem Cells》的方法。建立可持续传代的小鼠精原干细胞系用于体外药物筛选。
2.饲养层细胞：
本发明实施例中所用的饲养层细胞包括利用13.5天胚胎中的胎鼠表皮制作的胎鼠成纤维细胞(经由丝裂霉素C处理，以抑制其增殖特性)等一类细胞，属于小鼠胚胎干细胞系、小鼠精原干细胞细胞系中提供细胞营养的一类共培养细胞。
3.PRMT5抑制剂：
本发明实施例中所用的PRMT5抑制剂包括EPZ015666和GSK3326595。
其中，EPZ015666的CAS号为：1616391-65-1，化合物名称为N-[(2S)-3-(3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)-2-羟基丙基]-6-(3-氧杂环丁基氨基)-4-嘧啶甲酰胺，其结构式如式I所示：
其中，GSK3326595的CAS号为：1616392-22-3，化合物名称为6-[(1-acetylpiperidin-4-yl)amino]-N-[(2S)-3-(3,4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl)-2-hydroxypropyl]pyrimidine-4-carboxamide，其结构式如式II所示：
PRMT5抑制剂对体外培养小鼠精原干细胞的自我更新能力促进效果
(1)EPZ015666对体外培养小鼠精原干细胞的自我更新能力促进效果：
本实施例中以EPZ015666为例，展示PRMT5抑制剂对体外培养小鼠精原干细胞的自我更新能力促进效果，具体步骤为：
①构建精原干细胞体外培养体系(培养基)，培养基具体配方(50mL体系)如表1所示：
表1精原干细胞体外培养培养基组分及其含量
其中，所述非必需氨基酸购自Gibco，含有750mg/L甘氨酸、890mg/L丙氨酸、1320mg/L L-天冬酰胺、1330mg/L L-天门冬氨酸、1470mg/L谷氨酸、1150mg/L脯氨酸、1050mg/LL-丝氨酸。所述维生素购自Gibco，含有100mg/L氯化胆碱、100mg/L D-泛酸钙、100mg/L叶酸、100mg/L烟酰胺、100mg/L盐酸吡哆醛、10mg/L核黄素、100mg/L盐酸硫胺素、200mg/L肌醇、8500mg/L氯化钠。
②精原干细胞及饲养层细胞的准备：
在96孔培养板中接种小鼠精原干细胞及饲养层细胞，饲养层细胞作为培养小鼠精原干细胞并为其提供细胞营养的共培养细胞。
②检测精原干细胞克隆形成能力：
利用高内涵Cytation 5细胞成像检测培养板中的小鼠精原干细胞形成克隆的数量。
以培养基中添加GDNF细胞因子(也称胶质细胞源性神经营养因子)为阳性对照，以培养基中撤出GDNF细胞因子并添加小分子溶剂DMSO为阴性对照。
结果如图1和图2所示。
如图1所示，EPZ015666可以在无外源添加GDNF细胞因子的情况下，维持明显较多(相较于阴性对照组)小鼠精原干细胞的克隆形成，进而说明其促进并维持了小鼠精原干细胞的自我更新。进一步地，如图2所示，通过持续传代培养对不同培养基中精原干细胞进行细胞生长曲线绘制，证实了EPZ015666可以在无外源添加GDNF细胞因子的情况下，持续的维持小鼠精原干细胞的自我更新。
进一步对克隆的细胞分别使用Ddx4基因标记物(生殖细胞特异性基因，显紫色荧光)、Plzf基因标记物(精原干细胞特异性基因，显红色荧光)、细胞来源标记物(用于显示活细胞，显绿色荧光)、DNA染剂(用于显示DNA，显蓝色荧光)，观察其荧光反应。
结果如图3所示。
在经过长期体外培养后，通过Ddx4基因标记物、Plzf基因标记物、细胞来源标记物、DNA染剂的标记，本实施例中的克隆细胞在特定波长下能分别显示出紫色、红色、绿色和蓝色荧光，说明本实施例中的克隆细胞为生殖细胞、精原干细胞、活细胞且DNA完整。说明本实施例中的EPZ015666可以在无外源添加GDNF细胞因子的情况下，小鼠精原干细胞可很好的维持其干细胞身份。
(2)GSK3326595对体外培养小鼠精原干细胞的自我更新能力促进效果：
本实施例中以GSK3326595为例，展示PRMT5抑制剂对体外培养小鼠精原干细胞的自我更新能力促进效果，具体步骤如EPZ015666。
在检测精原干细胞克隆形成能力时，将小鼠精原干细胞接种在预先准备有饲养层细胞的96孔培养板孔中，接种密度为2×105细胞/孔，分为两组，分别加入不同浓度梯度的EPZ015666和GSK3326595(浓度均为：0、0.1、0.5、1、2、5、10μM，稀释溶液为DMSO)。同时设立阴性对照，即在培养液中加入等体积的DMSO。试验组和对照组的细胞均置于5％CO2，37℃恒温细胞培养箱中，隔日换液。利用MTT显色试剂标记培养6天的细胞，利用酶标仪在570nm处检测培养板中各孔精原干细胞活性，绘制细胞活性曲线。
结果图4所示。
如细胞活性检测折线图所示，EPZ015666和GSK3326595均可在无外源添加GDNF细胞因子的情况下，促进小鼠精原干细胞的自我更新。其中，在添加浓度为1μM或更小浓度时，GSK3326595对小鼠精原干细胞体外自我更新并形成克隆的促进作用比EPZ015666更强，而当浓度上升至2μM，EPZ015666对小鼠精原干细胞体外自我更新并形成克隆的促进作用则比GSK3326595更强。在0～10μM浓度内，在培养基中添加2μM EPZ015666或1μM GSK3326595对小鼠精原干细胞体外自我更新并形成克隆的促进作用最佳。
PRMT5抑制剂对体外培养小鼠精原干细胞的自我更新能力的稳定性实验
本实施例中以EPZ015666为例，展示PRMT5抑制剂对体外培养小鼠精原干细胞的自我更新能力促进效果，具体步骤和反应体系如上述实施例。
其中，在使用EPZ015666体外培养精原干细胞及传代的具体操作为：将小鼠精原干细胞接种在预先准备有饲养层细胞的96孔培养板孔中，接种密度为2×105细胞/孔，实验组加入1μM的EPZ015666(稀释溶液为DMSO)。同时设立对照组，即在培养液中加入等体积的DMSO(阴性对照)或鼠源GDNF细胞因子(阳性对照，浓度为10mg/mL)。试验组和对照组的细胞均置于5％CO2，37℃恒温细胞培养箱中，隔日换液。6天传代一次。传代过程中统计各组细胞数量。
将传代得到的细胞进行体内移植，具体操作为：
①构建白消安受体小鼠模型：
准备ICR小鼠，在ICR小鼠交配后，于第二天检查***栓(记为交配后0.5天)，在交配后12.5天时，以40mg/kg浓度给孕鼠腹腔注射白消安(又名马利兰)进行造模。在小鼠出生后第10天，将上述传代得到的精原干细胞移植入新生小鼠睾丸内。
②精原干细胞移植：
将受体小鼠(新生小鼠)麻醉后，将玻璃针在内径约40μm处断针，装入口吸管内，吸入5μL上述传代得到的精原干细胞悬液。剖开受体小鼠下腹部，于膀胱旁边寻找与睾丸相连的脂肪垫，轻轻拖出腹腔，在体式显微镜镜下，沿***平行方向找到输出小管，一手持显微镊夹起输出小管，另一手执口吸管，将针头戳入输出小管，并沿输出小管向***方向插进后，将上述传代得到的精原干细胞吹入睾丸的曲细精管中。注射结束后，将睾丸及脂肪垫小心送入腹腔，勿使睾丸扭转，然后逐层缝合，最后将酒精棉敷于小鼠腹部防止感染。将小鼠置于37℃温台上，待其苏醒后放回饲养室(移植后的小鼠如图5所示)。在移植完成60天后，处死小鼠，取受体小鼠双侧睾丸，检测睾丸外缘移植的精原干细胞定植、分化情况。
结果如图6和7所示。
通过荧光标记，能够明显观察到EPZ015666和精原干细胞已经成功定殖于受体小鼠睾丸曲细精管的基底膜处。通过对取自受体小鼠双侧睾丸组织进行观察，可以发现，这些细胞有部分可以显示出对应于细胞来源标记物、Plzf基因标记物、DNA染剂的荧光，说明无外源添加GDNF细胞因子并使用EPZ015666长期体外培养的细胞，在移植体内后，精原干细胞可执行正常的生精功能，与雌鼠交配产生可育后代，说明EPZ015666在促进精原干细胞增殖的同时，有效的维持了精原干细胞的身份和功能。同时，如图7所示，通过对取自受体小鼠双侧睾丸组织进行切片观察，可以发现，体外植入的细胞可以显示出对应于细胞来源标记物、联会复合体标记物SYCP3、DNA双链断裂修复蛋白γH2AX、DNA染剂的荧光。说明无外源添加GDNF细胞因子并使用EPZ015666长期体外培养的细胞，具有启动分化进入减数***的***发生过程的能力。
PRMT5抑制剂的促进精原干细胞再生效果验证
本实施例中以EPZ015666为例，展示PRMT5抑制剂的促进精原干细胞再生效果。
(1)PRMT5抑制剂对正常生理状态小鼠的促进精原干细胞再生效果：
取生理状态指标正常的小鼠(8周龄)，每日在实验组小鼠腹腔内分别注射质量比为10mg/kg小鼠体重、20mg/kg小鼠体重的EPZ015666，同时在对照组小鼠的相同位置注射等剂量DMSO，连续注射5日。于实验第6日取各组小鼠睾丸组织，通过免疫荧光染色检测其曲细精管中精原干细胞(SSC)增殖情况及生精恢复情况。
实验示意图如图8所示。
实验结果如图9所示。
从结果中可以发现，以EPZ015666为例的PRMT5抑制剂类化合物能够直接施用于正常生理状态下的小鼠体内以促进精原干细胞再生。其中，在正常生理状态下的小鼠体内注射20mg/kg体重浓度的EPZ015666对精原干细胞增殖的促进效果最优。
(2)PRMT5抑制剂对白消安诱导化疗模型小鼠的促进精原干细胞再生效果：
取生理状态指标正常的小鼠(8周龄)，在小鼠腹腔注射白消安10mg/kg小鼠体重，共注射10天构建白消安诱导化疗模型小鼠。注射10天后，每日对实验组小鼠腹腔内注射EPZ015666(浓度为10mg/kg小鼠体重，注射量为20μL/剂)，在对照组小鼠的相同位置注射等剂量DMSO，连续注射10天。在第10天后，取各组小鼠睾丸组织，通过免疫荧光染色检测并统计其曲细精管中精原干细胞(SSC)增殖情况及生精恢复情况。
实验示意图如图10所示。
实验结果如图11所示。
在连续注射10天EPZ015666后，通过观察实验组和对照组小鼠睾丸曲细精管中精原干细胞的数量，发现与对照组相比，EPZ015666治疗的小鼠在连续注射5天后，精原干细胞数量显著恢复。这说明，以EPZ015666为例的PRMT5抑制剂类化合物可促进病理状态下的小鼠体内精原干细胞再生。
PRMT5抑制剂对人曲细精管中精原干细胞的维持与增殖的促进作用
本实施例中以EPZ015666为例，展示PRMT5抑制剂对人曲细精管中精原干细胞的维持与增殖的促进作用。
具体步骤如下：
(1)人睾丸曲细精管组织的体外培养：
将活检取材的人睾丸组织样品用PBS清洗后，用尖头镊将组织中曲细精管分离形成约2mm/段的管腔样品。管腔置于1％琼脂糖凝胶块上，加入精原干细胞培养液，实验组培养液中添加1μM的EPZ015666，对照组则加入等剂量的DMSO。将各组均置于35℃培养箱中培养，隔日换液。
(2)免疫荧光染色检测：
收集体外培养14天后的人睾丸组织，用4％的多聚甲醛溶液室温固定24小时，进行石蜡包埋，组织切片。对组织切片进行免疫荧光染色，目的抗体具体为：添加一抗(anti-UTF1或anti-DDX4或anti-KI67)，抗体稀释比为1:400，置于4℃冰箱过夜；添加二抗，抗体稀释比1:400，室温静置1h；使用DNA染剂(Hoechst 33342)染核，稀释比1:1000，室温染10min；切片观察及拍照统计。
结果如图12和13所示。
通过对UTF1和DDX4标记物共标记的细胞进行统计，可以得到精原干细胞的占比情况，进一步基于DNA染剂，可以有效获得精原干细胞的存活情况。根据统计结果，可以看出，EPZ015666培养的人睾丸曲细精管组织，可很好维持精原干细胞的存活。而通过对KI67和DDX4标记物共标记的细胞进行统计，可以得到处于增殖状态的精原干细胞的占比情况，进一步基于DNA染剂，可以有效获得增殖状态的精原干细胞的存活情况。根据统计结果，可以看出，EPZ015666可促进人睾丸曲细精管组织中的人精原干细胞的增殖。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1. PRMT5抑制剂在制备体外培养促进小鼠或灵长类动物精原干细胞损伤再生试剂中的应用，其特征在于，所述PRMT5抑制剂为0.1～5 μM的EPZ015666 或0.1～1 μM的GSK3326595。
2. PRMT5抑制剂在制备体外培养促进小鼠或灵长类动物精原干细胞增殖试剂中的应用，其特征在于，所述PRMT5抑制剂为0.1～5 μM的EPZ015666 或0.1～1 μM的GSK3326595。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小鼠或灵长类动物精原干细胞损伤包括因化疗药物引起的精原干细胞损伤。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述化疗药物包括白消安。
CN202110407061.XA 2021-04-15 2021-04-15 Prmt5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用 Active CN113186153B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110407061.XA CN113186153B (zh) 2021-04-15 2021-04-15 Prmt5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110407061.XA CN113186153B (zh) 2021-04-15 2021-04-15 Prmt5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113186153A CN113186153A (zh) 2021-07-30
CN113186153B true CN113186153B (zh) 2023-09-08

Family

ID=76977263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110407061.XA Active CN113186153B (zh) 2021-04-15 2021-04-15 Prmt5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113186153B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113546173B (zh) * 2021-08-19 2022-08-23 徐州医科大学 Prmt5抑制剂在制备治疗冠状病毒感染所引起的疾病的药物中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014145214A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Ohio State Innovation Foundation Inhibitors of prmt5 and methods of their use
WO2018152501A1 (en) * 2017-02-20 2018-08-23 Prelude Therapeutics, Incorporated Selective inhibitors of protein arginine methyltransferase 5 (prmt5)
CN109803971A (zh) * 2016-10-03 2019-05-24 詹森药业有限公司 用作prmt5抑制剂的新颖的单环和双环***取代的卡巴核苷类似物
WO2019107576A1 (ja) * 2017-11-30 2019-06-06 国立大学法人京都大学 始原生殖細胞／始原生殖細胞様細胞の維持増幅及び分化誘導方法
CN112472695A (zh) * 2020-12-10 2021-03-12 南方医科大学 他汀类化合物在制备促进哺乳动物精原干细胞再生功能的药物中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050120397A1 (en) * 2003-11-24 2005-06-02 Hermann Steller Compounds and methods for regulation of spermatid differentiation
US20160137975A1 (en) * 2013-07-10 2016-05-19 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Generation of male germ cells
WO2016038550A1 (en) * 2014-09-11 2016-03-17 Novartis Ag Inhibition of prmt5 to treat mtap-deficiency-related diseases

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014145214A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Ohio State Innovation Foundation Inhibitors of prmt5 and methods of their use
CN109803971A (zh) * 2016-10-03 2019-05-24 詹森药业有限公司 用作prmt5抑制剂的新颖的单环和双环***取代的卡巴核苷类似物
WO2018152501A1 (en) * 2017-02-20 2018-08-23 Prelude Therapeutics, Incorporated Selective inhibitors of protein arginine methyltransferase 5 (prmt5)
WO2019107576A1 (ja) * 2017-11-30 2019-06-06 国立大学法人京都大学 始原生殖細胞／始原生殖細胞様細胞の維持増幅及び分化誘導方法
CN112472695A (zh) * 2020-12-10 2021-03-12 南方医科大学 他汀类化合物在制备促进哺乳动物精原干细胞再生功能的药物中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
蛋白质精氨酸甲基转移酶5抑制剂的研究进展;黄美玲 等;《现代肿瘤医学》;20190304;第27卷(第8期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113186153A (zh) 2021-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021208130A1 (zh) 一种用于食管鳞癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用
WO2021088119A1 (zh) 原代乳腺上皮细胞培养基、培养方法及其应用
CN103562378A (zh) 用于自体种系线粒体能量转移的组合物和方法
Nowroozi et al. In vitro colonization of human spermatogonia stem cells: effect of patient's clinical characteristics and testicular histologic findings
CN113186153B (zh) Prmt5抑制剂在促进精原干细胞损伤再生和增殖中的应用
WO2023060774A1 (zh) ***类器官的培养基、及其培养方法和应用
US20210345602A1 (en) Mammal cell preserving solution containing acarbose or stachyose
CN103237887A (zh) 胚胎干细胞来源的心肌细胞以及包含所述心肌细胞作为活性成分的细胞治疗剂
CN106047798A (zh) 一种适用于高密度细胞培养体系的羊水细胞培养基
WO2006117237A2 (en) Regeneration system, its production and use
Bai et al. Evidence for the existence of CD34+ angiogenic stem cells in human first‐trimester decidua and their therapeutic for ischaemic heart disease
CN108048390B (zh) 一种制备血管内皮细胞的方法及其专用试剂盒
EP3778871A1 (en) Method for producing stem cell-derived lacrimal gland tissue
WO2023060764A1 (zh) 胃癌原代细胞的培养基和培养方法
WO2023279455A1 (zh) 一种用于肺癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用
CN113322227B (zh) 基于微针的睾丸组织体外培养方法及其应用
CN112472695A (zh) 他汀类化合物在制备促进哺乳动物精原干细胞再生功能的药物中的应用
JP7107595B2 (ja) 多能性幹細胞由来結膜細胞の誘導方法
KR101590615B1 (ko) 돼지 정원줄기세포를 체외 배양하기 위한 배양액 조성물 및 배양방법
CN113201494B (zh) 一种黏膜黑色素瘤细胞及其用途
WO2023060681A1 (zh) 一种用于***原代细胞的培养基和培养方法
EP3412767B1 (en) Method for obtaining female reproductive stem cells from follicular extracts
CN115074307B (zh) 小分子化合物诱导成纤维细胞重编程为睾丸支持细胞的方法及其应用
JP2010535020A (ja) 頚動脈小体由来の幹細胞及びその使用
CN114736862B (zh) 一种造血干细胞培养基和造血干细胞的体外扩增方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant