CN113185597A

CN113185597A - 一种可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原及其应用

Info

Publication number: CN113185597A
Application number: CN202110366803.9A
Authority: CN
Inventors: 宋尔卫; 苏士成; 朱晓峰; 黄迪
Original assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-04-06
Filing date: 2021-04-06
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2041-04-06
Also published as: CN113185597B

Abstract

本发明属于生物医药卫生领域，特别涉及一种可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原及其应用。本发明一方面公开了circFam53b所编码的多肽作为一种新的肿瘤抗原在肿瘤免疫治疗中的用途。本发明另一方面提供了一种筛选circRNA来源的肿瘤抗原的方法，以肿瘤中高表达的circRNA分子的作为肿瘤抗原来源的新对象，挑选具有编码能力的circRNA分子为候选初筛circRNA，再证明目标circRNA的编码能力，并证明circRNA所编码多肽的免疫原性。本发明为肿瘤免疫治疗特别是肿瘤疫苗治疗提供了新的靶点，为作为肿瘤免疫治疗及肿瘤疫苗治疗靶点的circRNA所编码的肿瘤抗原的筛选提供了新的方法。

Description

一种可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药卫生领域，具体涉及一种可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原及其应用。

背景技术

目前，恶性肿瘤极大的威胁着人类的生命健康。随着科学研究的发展，人类在抗肿瘤治疗中取得了很大的进步。但是，目前抗肿瘤治疗的效果仍不能令人十分满意。传统的治疗恶性肿瘤的方法，包括手术治疗、放疗和化疗。这些治疗都存在各自的不足。为了增强疗效和减少副作用，研究人员一直在不断寻找新的治疗方法。其中，免疫治疗由于其精确性及相对于传统治疗方法更少的副作用，在抗肿瘤方面被认为具有划时代的意义。近年来，随着抗PD-1和抗CTLA-4等免疫检测点阻断抗体在肿瘤免疫治疗中得到应用，肿瘤免疫治疗已经取得突破性的进展。目前，单克隆抗体治疗、免疫检查点阻断治疗、过继T细胞疗法、嵌合抗原受体修饰T细胞疗法(CAR-T细胞治疗)及肿瘤疫苗等免疫治疗方法在抗肿瘤治疗中不断取得新的突破。

治疗性的肿瘤疫苗也在临床治疗恶性肿瘤中得到了应用。肿瘤疫苗治疗是将肿瘤抗原以疫苗导入患者体内，激活患者自身的免疫***，诱导机体免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。选择更好的抗原作为肿瘤疫苗治疗的靶点，一直被认为是提高肿瘤疫苗治疗的关键。而良好的作为治疗靶点的肿瘤抗原不但是肿瘤疫苗治疗的关键，同样也是肿瘤免疫治疗的关键之一。

但是，目前发现的能够较好地诱导机体免疫应答的肿瘤抗原数量十分有限。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原。

本发明的另一目的在于提供上述可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原的应用。

本发明的再一目的在于提供上述可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原的体外筛选方法。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：一种可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原，其氨基酸序列如下所示：ALFRLTNRA。

编码上述可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原的核苷酸序列。

所述的核苷酸序列包括核糖核酸序列和脱氧核糖核酸序列；优选如下所示：GCCCTCTTCAGATTGACCAACCGAGCA。

上述可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原可起到以下作用中的一项或多项：

1)激活CD8 T细胞对肿瘤的杀伤活性；

2)刺激CD8 T细胞的效应功能；

3)刺激CD8 T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)；

4)刺激CD8 T细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；

5)刺激CD8 T细胞释放细胞毒颗粒；

6)加入树突状细胞后，树突状细胞激活CD8 T细胞；

7)刺激CD8 T细胞细胞质膜上T细胞抗原受体(TCR)成簇；

8)过继该多肽激活的T细胞可抑制肿瘤生长；

9)可作为多肽疫苗激活人体抗肿瘤免疫；

10)可根据多肽序列制作需要mRNA疫苗激活人体抗肿瘤免疫；

11)circFam53b可作为疫苗激活人体抗肿瘤免疫

12)可用作制作树突状细胞(DC)疫苗激活人体抗肿瘤免疫；

13)可用作制作DNA疫苗激活人体抗肿瘤免疫；

14)可作为免疫原激活CD8细胞后测序得到TCR序列用于TCR-T治疗。

所述的肿瘤包括circFam53b过表达或者有circFam53b编码多肽表达的实体瘤和非实体瘤，包括但不限于：鼻腔及鼻窦恶性肿瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、涎腺肿瘤、颅内肿瘤、甲状腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、贲门癌、乳腺癌、纵膈肿瘤、胃癌、大肠癌、乙状结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌与壶腹周围癌、胆道癌、小肠恶性肿瘤、肾癌、***癌、膀胱癌、睾丸恶性肿瘤、***癌、子***、子宫内膜癌、卵巢癌、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、皮肤恶性黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病等。

所述的可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原和/或上述核苷酸序列在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种抗肿瘤药物，包括上述可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原，和/或上述核苷酸序列。

所述的抗肿瘤药物，还包括T细胞和树突状细胞中的一种或两种。

所述的T细胞和所述的树突状细胞优选来源于患者；优选来源于自体患者。

上述可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原的体外筛选方法，包括如下步骤：取癌组织和癌旁组织进行circRNA高通量测序；对高通量测序的结果进行生物信息学分析，通过分析circRNA的测序结果，选择在肿瘤组织中高表达并具有编码功能的circRNA；通过实验确定生物信息学分析的结果，以筛选得到的circRNA所编码的多肽作为肿瘤免疫治疗的作用对象，挑选出circRNA所编码的部分或全部多肽用于制作多肽疫苗，得到可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原。

所述的癌组织优选为乳腺癌组织。

所述的circRNA优选为circFam53b。

所述的circFam53b所编码的多肽的氨基酸序列为：

MSSCRTSWRPLGSKVWTPVEKRRCYSGGSVQRYSNGFSTMQRSSSFSLPSRANVLSSPCDQAGLHHRFGGQPCQGVPGSAPCGQAGD TWSPDLHPVGGGRLDLQRSLSCSHEQFSFVEYCPPSANSTPASTPELARRSSGLSRSRSQPCVLNDKKVGVKRRRPEEVQEQRPSLDLAKM AQKMTDGETWTGNALFRLTNRAPASGNACLKRTAHYGTGRQ。

所述的circFam53b的碱基序列为：

所述的circFam53b编码多肽的开放阅读框(ORF)碱基序列为：

ATGTCCAGTTGCCGGACATCATGGAGGCCCTTGGGCTCCAAAGTCTGGACTCCCGTGGAAAAGAGACGCTGCTACAGCGGGGGCAGC GTCCAGCGCTATTCCAACGGCTTCAGCACCATGCAGAGGAGTTCCAGCTTCAGCCTCCCTTCCCGGGCCAACGTGCTCTCCTCACCCTGCG ACCAGGCAGGACTCCACCACCGATTTGGAGGGCAGCCCTGCCAAGGGGTGCCAGGCTCAGCCCCGTGTGGACAGGCAGGTGACACCTGGAG CCCTGACCTGCACCCCGTGGGAGGAGGCCGGCTGGACCTGCAGCGGTCCCTCTCTTGCTCACATGAGCAGTTTTCCTTTGTGGAATACTGT CCTCCCTCAGCCAACAGCACACCTGCCTCAACACCAGAGCTGGCGAGACGCTCCAGCGGCCTTTCCCGCAGCCGCTCCCAGCCGTGTGTCC TTAACGACAAGAAGGTCGGTGTTAAAAGGCGGCGCCCTGAAGAAGTGCAAGAGCAGAGGCCTTCTCTAGACCTTGCCAAGATGGCACAGAA AATGACAGATGGCGAGACCTGGACAGGAAATGCCCTCTTCAGATTGACCAACCGAGCACCAGCATCTGGGAATGCCTGCCTGAAAAGGACA GCTCACTATGGCACCGGGAGGCAGTGA。

所述的实验包括但不限于以下实验：检测circRNA的编码多肽在组织中是否存在表达，检测circRNA 所编码的部分或全部多肽的免疫原性，检测circRNA所编码的部分或全部多肽激活抗肿瘤免疫活性，得到可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原。

所述的检测circRNA的编码多肽在组织中是否存在表达可采用现有技术进行，方法包括：制作带Flag 的过表达载体western blot测定、质谱测定法和制作抗体免疫印迹实验(western blot)测定。

所述的检测circRNA所编码的多肽的免疫原性亦可利用现有技术进行，方法包括：酶联免疫斑点实验 (elispot)，流式实验检测CD8 T细胞因子，五聚体检测抗原特异性T细胞。

所述的检测circRNA所编码的多肽激活抗肿瘤免疫活性的方法包括：建立病人来源的异体移植物PDX 动物模型后过继circRNA抗原表位激活过的T细胞检测肿瘤生长情况；可制作基于circRNA抗原表位的疫苗，包括多肽疫苗、DC疫苗、mRNA疫苗、circRNA疫苗、DNA疫苗在circRNA所编码的多肽表达的肿瘤患者中进行临床试验，观察免疫反应情况和患者疗效。

本发明相对于现有技术具有如下优点和有益效果：

(1)肿瘤免疫治疗的关键是肿瘤抗原被免疫细胞识别并激活抗肿瘤免疫。目前，肿瘤抗原可分为外源性的肿瘤病原微生物的抗原和内源性的肿瘤睾丸抗原、肿瘤相关抗原以及肿瘤基因突变产生的新抗原。肿瘤睾丸抗原和肿瘤相关抗原由于在一些健康组织中也有少量表达，且经过中枢免疫耐受。因此，针对这些抗原的治疗存在免疫原性不强，容易引起副反应等缺点。而新抗原疫苗的治疗因为不同个体需要进行单独的测序及个体化的疫苗制作，导致了成本高昂和个体化疫苗制作周期长等不足。本发明发现了具有编码功能的circFam53b可编码具有免疫原性的多肽，并能激活体内的免疫反应。这将为肿瘤免疫治疗发现新的抗原来源。CircFam53b所编码的抗原在具有强的免疫原性的同时能在不同患者甚至不同肿瘤中表达，在保证有效性的同时具有更广泛的适用性。

(2)在高突变负荷肿瘤的免疫治疗中，来源于突变的肿瘤新抗原被认为是激活抗肿瘤免疫的关键。在低突变负荷的乳腺癌中circRNA编码的抗原可被应用激活抗肿瘤免疫，能为低突变负荷肿瘤的免疫治疗提供新的依据。

(3)在动物水平上，建立PDX动物模型，过继添加过circFam53b所编码抗原表位多肽的T细胞可抑制肿瘤的生长，在肿瘤免疫治疗上有着潜在的临床应用价值。

(4)circRNA是由反向剪切作用形成的环状的RNA分子。当circRNA的首尾结合处位于开放阅读框之内会使编码区相对于亲本mRNA产生一个类似移码突变或剪切位点突变的改变，其翻译的多肽将不同于亲本mRNA所翻译的蛋白，有可能激活免疫反应。本发明发明人发现肿瘤细胞中部分高表达circFam53b所编码的多肽具有免疫原性，来源于这些多肽的抗原表位可以激活抗肿瘤免疫，杀伤肿瘤细胞。并且高通量测序、Western Bolt、质谱检验、elispot实验和流式实验等方法，证明了circRNA能编码具有免疫原性的多肽，这些多肽可被应用激活抗肿瘤免疫。这些发现开拓新的肿瘤抗原来源，为肿瘤的治疗特别是免疫治疗提供了新的靶点。

附图说明

图1是检测circRNA编码多肽的结果图；其中，A为分别在肿瘤组织和癌旁组织检测circFam53的相对表达量，结果显示circFam53在肿瘤组织中高表达；B为通过免疫印迹实验(Western Blot)检测得到带有Flag的过表达circFam53b所编码的多肽；C为通过抗体可检测乳腺癌癌组织中circFam53b所编码的多肽。

图2是目的载体pHBLV-CMV-Circ-MCS-EF1-zsgreen-t2a-puro的结构示意图。

图3是验证circRNA编码的多肽具有抗原性的结果图；其中，A为酶联免疫斑点(elispot)实验检测 circFam53b所编码的多肽的免疫原性；B为流式实验检测circFam53b所编码的多肽的抗原表位刺激CD8 T 细胞产生细胞因子IFN-r；C为流式实验检测circFam53b所编码的多肽的抗原表位刺激CD8 T细胞产生细胞因子TNF-a；D为流式实验检测circFam53b所编码的多肽的抗原表位刺激分化出抗原特异性CD8 T细胞。

图4是验证circRNA编码的多肽激活抗肿瘤免疫反应的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明通过分子水平、细胞水平和动物模型多方面的技术手段可实现，证明circFam53b所编码的多肽在肿瘤组织中表达，证实circFam53b所编码多肽的免疫原性，并证明circFam53b及其所编码的多肽在抗肿瘤免疫中的作用及其具体作用机制。

1.人乳腺癌组织和癌旁组织中的测序：

a.取乳腺癌组织及癌旁组织进行circRNA高通量测序。

b.对高通量测序的结果进行生物信息学分析。通过分析circRNA的测序结果，选择在肿瘤组织中高表达并具有编码功能的circRNA。应用NetMHC等网站预测并按新生抗原的IC₅₀值标准，分析来源于circRNA 所预期编码多肽的抗原表位。

c.初步确定目标circRNA—circFam53b。

2.验证乳腺癌组织和癌旁组织中circRNA表达差异：

a.提取乳腺癌组织和癌旁组织中的RNA，并合成相关引物。通过qRT-PCR验证这些circRNA的表达差异。

b.应用可以水解线性RNA的RNase R处理总RNA，取RNA进行Northern Blot验证目标circRNA条带依然存在。再取RNase R处理后的RNA进行逆转录，然后进行荧光定量PCR，再次证明目标为RNase R所不能水解的circRNA。

c.将普通PCR的产物，通过一代测序，验证这些circRNA的接头处的序列，确定circRNA的序列。

3.证明circFam53b编码多肽的功能：

a.根据circBase、circRNADb等数据库的数据，预测circFam53b的ORF和IRES序列等。

b.构建FLuc-IRES-RLuc双荧光素酶标记的质粒，并在质粒内分别克隆空载、野生型IRES序列和突变型 IRES序列。通过双荧光素酶报告实验，证明circFam53b的IRES序列活性强，具有编码蛋白的潜力。

c.制备Flag标记在ORF终止密码前的circFam53b的质粒及空载质粒，并将质粒通过Lipo 3000转染至 HEK293T细胞内，48小时后提取细胞中的总蛋白，通过Western Blot实验，验证Flag所标记的蛋白。

d.转染同样的质粒后，通过Western Bolt实验得到电泳胶，通过考马斯亮蓝染色后，将相应位置的胶条进行质谱检测。通过分析质谱检测的结果，验证circRNA所编码的特异性的肽段是否存在。

e.通过circBase、circRNADb等数据库的数据可以知道circRNA可能编码的多肽的氨基酸序列。制作与该多肽特异性结合的抗体，并通过Western Blot验证这些多肽在肿瘤组织中的表达。

4.CircFam53b所编码多肽的免疫原性的验证：

a.通过NetMHC网站预测circFam53b所编码的多肽中其特异性的多肽序列与HLA I类分子的亲和性。根据NetMHC的预测结果，按亲和力的高低选择circRNA所编码多肽的抗原表位进行研究。

b.化学合成包含circRNA所编码多肽抗原表位的多肽。

c.分离出乳腺癌患者的PBMC(外周血单个核细胞)及T细胞。PBMC在加入1％双抗(青霉素和链霉素) 和10％AB血型的人血清的DMEM培养基中培养，并通过50ng/ml的GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子) 和IL-4(20ng/mL)诱导，6天后加入合成的多肽，每三天更换细胞因子和多肽，与培养后的T细胞按1：1 的比例(个数/个数)，9天后种入包埋有INF-r抗体的elispot试剂盒的培养板内。24小时后弃去上清，PBS 清洗5次后加入一抗孵育2小时，PBS清洗5次后加入二抗孵育1小时，最后加入TMB显色液，待斑点出现后去离子水冲洗。通过酶联免疫斑点检测仪观察培养板内INF-r斑点形成情况。

d.PBMC在加入1％双抗和10％AB血型的人血清的DMEM培养基中培养，并通过50ng/ml的GM-CSF和 IL-4(20ng/mL)诱导，取培养后的T细胞1×10⁶个按1:1的比例与PBMC共培养，每三天更换细胞因子和多肽，并用20μg/ml的合成多肽进行刺激，9天后，加入Brefeldin A处理，抑制细胞因子分泌。24小时后，收集处理过的细胞进行CD3、CD8及CD4分子染色固定后，破膜剂进行破膜，然后分别进行IFN-γ、 TNF-α及IL-2的染色。进行流式细胞仪检测，分析CD4+、CD8+T细胞的激活情况和细胞因子产生情况。

e.本实施例的目的是为了检测circFam53b所编码的多肽可刺激产生抗原特异性T细胞。通过淋巴细胞分离液分离出乳腺癌患者外周血中的PBMC(外周血单个核细胞)及T细胞。磁珠分选得到的CD8 T细胞重悬于含10％v/v AB血型的人血清的DMEM完全培养基中，加入相应浓度的IL-2(20ng/mL)，37℃、CO2 培养箱中培养，得到培养后的T细胞。剩下的单核细胞重悬于含10％v/v AB血型的人血清的DMEM完全培养基中并加入适当浓度的GM-CSF(50ng/mL)与IL-4(20ng/mL)，每3天更换细胞因子，37℃、CO2培养箱中培养6天，得到DC细胞。将DC细胞和T细胞按照1:1的比例在24孔板中共培养并加入circFam53b 所编码的抗原表位多肽(浓度为20μg/mL，每孔添加100μL)，并且共同培养3周。培养结束后收集细胞，进行细胞死活，CD3和CD8抗体表面标记，然后用在Proimmune公司定制的MHC I类分子五聚体进行流式染色，最后通过流式检测检测CD8阳性细胞中五聚体阳性的抗原特异性CD8+T细胞的比例。

5.来源于circFam53b所编码多肽能激活T细胞抗肿瘤免疫：

a.取健康NOD/SCID小鼠，取乳腺癌患者组织，植入小鼠***脂肪垫，建立PDX小鼠模型。随机分为空白对照组(不处理)、阴性对照组(过继患者T细胞及树突状细胞)和实验组(过继患者T细胞及树突状细胞并plus过circFam53b所编码的多肽)。

b.PDX模型建立成功后，在肿瘤组织可触及时开始进行实验处理。空白对照组不进行任何处理；阳性对照组予以过继患者T细胞及树突状细胞；实验组予以过继患者T细胞及树突状细胞并plus过circFam53b 所编码的多肽，观察记录小鼠的肿瘤生长情况。

c.将肿瘤组织制作成切片并观察T细胞浸润情况。

实施例1证明circFam53b在肿瘤组织中高表达并编码多肽

试验方法：

(1)提取乳腺癌组织和癌旁组织的RNA并进行高通量测序。分析测序结果，确定目标分子―― circFam53b。液氮研磨后应用Trizol试剂提取乳腺癌组织和癌旁组织的RNA，并且进行荧光定量PCR验证 circFam53b的表达量。引物如下：上游引物F1：5’-ACGACAAGAAGGTCGGTGTT-3’，下游引物R1： 5’-CCATCTGTCATTTTCTGTGCCA-3’。反应条件为TAKARA TB Green^TM Premix Ex Taq^TM II荧光定量PCR试剂盒所推荐实验条件。结果如图1A所示，提示circFam53b在肿瘤组织中高表达，明显高于正常组织。通过 circBase、circRNADb等数据库分析circFam53b是否有ORF和IRES序列。发现circFam53b具有IRES序列及 ORF，提示circFam53b具有编码多肽的潜能。

(2)证明circFam53b编码多肽的功能：首先验证circRNA的IRES序列的活性，构建Luc-IRES-RLuc 双荧光素酶标记的质粒，载体为psiCHECK-2，并在质粒内分别克隆空载、野生型IRES序列和突变型IRES 序列，IRES是克隆到载体psiCHECK-2的Luc与RLuc之间。其中，野生型IRES的序列为： CCTGAAAAGGACAGCTCACTATGGCACCGGGAGGCAGTGACCGCCTGCGCTGTGACCAGTCTGATCAAAGACCTCAGCATCAGCGACCACA ACGGGAACCCCTCAGCACCCCCTAGCAAGCGCCAGTGCCGCTCACTGTCCTTCTCCGA。突变型IRES的序列为： CCTGTTTTGGACAGCTTACTATCCTGCCGGGACCCAGTGACCTTTTGCGCTGTGAGGTGTCTGATCGGGGACCTCAGCATCTTTGCACACA ACGGGAATTTTTCAGCATTTAACTGCCAGCGCCAGTGCCGCTCATTGTCCTTCTCACG。通过双荧光素酶报告实验，如结果显示野生型质粒RLuc/Luc荧光活性高于空载组及突变型，则证明circRNA的IRES序列活性强，具有编码蛋白的潜力。

(3)再证明circRNA能否直接编码多肽：

1)制备Flag标记的circRNA的质粒及空载质粒，空载质粒为汉恒生物的 pHBLV-CMV-MCS-EF1-zsgreen-t2a-puro，目的载体为：pHBLV-CMV-Circ-MCS-EF1-zsgreen-t2a-puro，如图2所示。

目的载体是通过基因合成公司制备得到，是将直接合成得到目的序列(如下所示)，通过HB infusionTM 无缝克隆到XhoI酶切线性化的载体pHBLV-CMV-MCS-EF1-zsgreen-t2a-puro上，得到目的载体。

CCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGC TTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGAAAAGTGCTGAGATTACAGGCGTGAGCCACCACCCCCGGCCCAC TTTTTGTAAAGGTACGTACTAATGACTTTTTTTTTATACTTCAGAAAATGACAGATGGCGAGACCTGGACAGGAAATGCCCTCTTCAGATT GACCAACCGAGCACCAGCATCTGGGAATGCCTGCCTGAAAAGGACAGCTCACTATGGCACCGGGAGGCAGGACTACAAGGATGACGATGAC AAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGACCGCCTGCGCTGTGACCAGTCTGATCAAAGACCTCAG CATCAGCGACCACAACGGGAACCCCTCAGCACCCCCTAGCAAGCGCCAGTGCCGCTCACTGTCCTTCTCCGATGAGATGTCCAGTTGCCGG ACATCATGGAGGCCCTTGGGCTCCAAAGTCTGGACTCCCGTGGAAAAGAGACGCTGCTACAGCGGGGGCAGCGTCCAGCGCTATTCCAACG GCTTCAGCACCATGCAGAGGAGTTCCAGCTTCAGCCTCCCTTCCCGGGCCAACGTGCTCTCCTCACCCTGCGACCAGGCAGGACTCCACCA CCGATTTGGAGGGCAGCCCTGCCAAGGGGTGCCAGGCTCAGCCCCGTGTGGACAGGCAGGTGACACCTGGAGCCCTGACCTGCACCCCGTGGGAGGAGGCCGGCTGGACCTGCAGCGGTCCCTCTCTTGCTCACATGAGCAGTTTTCCTTTGTGGAATACTGTCCTCCCTCAGCCAACAGCA CACCTGCCTCAACACCAGAGCTGGCGAGACGCTCCAGCGGCCTTTCCCGCAGCCGCTCCCAGCCGTGTGTCCTTAACGACAAGAAGGTCGG TGTTAAAAGGCGGCGCCCTGAAGAAGTGCAAGAGCAGAGGCCTTCTCTAGACCTTGCCAAGATGGCACAGGTAAGAAGCAAGGAAAAGAAT TAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCATAGCTTAAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCT。

2)将得到的阳性克隆再进行测序；

3)测序比对结果：

测序结果表明：测序结果与目的序列一致，则获得目的载体。

4)质粒抽提

测序成功之后，根据项目要求安排菌液扩增，进行质粒抽提纯化，质粒抽提的方案按照抽提试剂盒的说明书为准。抽提的质粒需要QC验证合格之后用于转染细胞。

5)将质粒通过Lipo 3000转染至HEK 293T细胞内，48小时后提取细胞中的总蛋白，通过Western Blot 实验，验证Flag所标记的蛋白。Western Blot实验中应用抗Flag标签抗体，证明目标circRNA的ORF具有编码多肽的功能(如图1B所示)。通过特异性的抗体，该抗体为定制抗体，免疫原序列为： VQEQRPSLDLAKMAQKMTDGETWTGNALFRLTNRAPASGNACLKRTAHYGTGRQ，抗体为南京金斯瑞生物有限公司制作。提取乳腺癌组织的蛋白过后，Western Blot实验证明circFam53b所编码的多肽在乳腺癌组织中表达(如图1C所示)。

本实施例的目的是证明circFam53b的编码能力，并且证明circFam53b所编码的多肽在肿瘤组织中表达。

实施例2 circFam53b所编码的多肽具有免疫原性。

通过IEDB和NetMHC网站预测circFam53b所编码的多肽中其特异性的多肽序列与HLA I类分子的亲和性。根据IEDB和NetMHC的预测结果，按亲和力的高低选择circRNA所编码多肽的抗原表位进行研究。IEDB预测多肽RANK<3，为优选抗原表位。本实施例的目的是为了验证circFam53b所编码的多肽具有免疫原性。

试验方法：

通过淋巴细胞分离液分离出乳腺癌患者外周血(来源于广东省)中的PBMC(外周血单个核细胞)及T 细胞。磁珠分选得到的PBMC细胞重悬于含1％双抗(青霉素和链霉素)、10％(v/v)AB血型人血清的 DMEM完全培养基中，加入适当浓度的GM-CSF(在培养基中的浓度50ng/mL)与IL-4(在培养基中的浓度20ng/mL)，每3天更换细胞因子，37℃、CO₂培养箱中培养6天，得到DC细胞。磁珠分选得到的 CD8 T细胞重悬于含10％v/v AB血型的人血清的DMEM完全培养基中，加入相应浓度的IL-2(在培养基中的浓度20ng/mL)，37℃、CO₂培养箱中培养6天，得到培养后的T细胞。将DC细胞和培养后的T细胞按照1:1的数量比例共培养，抗原表位多肽在细胞混合液中的浓度为20μg/mL，在1mL的培养基混合培养，每3天更换细胞因子(终浓度为50ng/mL的GM-CSF和20ng/mL的IL-4，更换细胞因子时是在含 10％(v/v)AB血型人血清的DMEM完全培养基基础上添加终浓度为20μg/mL的抗原表位多肽)。9天后在Mabtech公司生产的包被人IFN-γ抗体的IFN-γELISpot 96孔板中共培养并加入circFam53b所编码的抗原表位多肽(即ALFRLTNRA，抗原表位经过IEDB和NetMCH等数据库预测为与HLA-A 2：01有高亲和性，抗原表位多肽在细胞混合液中的浓度为20μg/mL)，24小时后弃去上清，PBS清洗5次后加入生物素化的检测一抗孵育2小时，PBS清洗5次后加入HRP标记二抗孵育1小时，最后加入TMB显色液，待斑点出现后去离子水冲洗。通过酶联免疫斑点检测仪观察培养板内INF-r斑点形成情况。

通过淋巴细胞分离液分离出乳腺癌患者外周血(来源于广东省)中的PBMC(外周血单个核细胞)及T 细胞。磁珠分选得到的PBMC细胞重悬于含1％双抗、10％(v/v)AB血型人血清的DMEM完全培养基中，加入适当浓度的GM-CSF(在培养基中的浓度50ng/mL)与IL-4(在培养基中的浓度20ng/mL)，每 3天更换细胞因子，37℃、CO₂培养箱中培养6天，得到DC细胞。磁珠分选得到的CD8 T细胞重悬于含 10％v/v AB血型的人血清的DMEM完全培养基中，加入相应浓度的IL-2(在培养基中的浓度20ng/mL)， 37℃、CO₂培养箱中培养6天，得到培养后的T细胞。将DC细胞和培养后的T细胞(1×10⁶个)按照1:1 的数量比例在24孔板中共培养并加入circFam53b所编码的抗原表位多肽。抗原表位多肽在细胞混合液中的浓度为20μg/mL，在1mL的培养基混合培养9天，每3天更换细胞因子(终浓度为50ng/mL的GM-CSF 和20ng/mL的IL-4，更换细胞因子时是在含10％(v/v)AB血型人血清的DMEM完全培养基基础上添加终浓度为20μg/mL的抗原表位多肽)，接着加入Brefeldin A(在细胞混合液中的浓度5μg/mL)，每孔加入1ml含10％(v/v)AB血型人血清的DMEM完全培养基继续培养6小时，抑制细胞因子的分泌。培养结束后收集细胞，进行细胞死活，CD3和CD8抗体表面标记，然后用赛默飞IC固定液室温固定30分钟，赛默飞破膜剂对细胞膜打孔后加抗IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、抗体标记细胞内相应蛋白，最后通过流式检测检测CD8阳性细胞中相应蛋白如IFN-γ、TNF-α和Granzyme B的表达水平。

该部分实验结果如图3所示，提示circFam53b所编码的抗原表位多肽(即ALFRLTNRA)可以激活人 CD8+T细胞的免疫反应。

实施例3 circFam53b所编码的多肽可刺激产生抗原特异性T细胞

本实施例的目的是为了检测circFam53b所编码的多肽可刺激产生抗原特异性T细胞。通过淋巴细胞分离液分离出乳腺癌患者外周血中的PBMC(外周血单个核细胞)及T细胞。磁珠分选得到的CD8 T细胞重悬于含10％v/v AB血型的人血清的DMEM完全培养基中，加入相应浓度的IL-2(20ng/mL)，37℃、CO₂培养箱中培养6天，得到培养后的T细胞。剩下的单核细胞重悬于含10％v/v AB血型的人血清的DMEM 完全培养基中并加入适当浓度的GM-CSF(50ng/mL)与IL-4(20ng/mL)，每3天更换细胞因子，37℃、 CO₂培养箱中培养6天，得到DC细胞。将DC细胞和培养后的T细胞按照1:1的比例在24孔板中共培养并加入circFam53b所编码的抗原表位多肽(浓度为20μg/mL，每孔添加100μL)，并且共同培养3周。培养结束后收集细胞，进行细胞死活，CD3和CD8抗体表面标记，然后用在Proimmune公司定制的MHC I 类分子五聚体进行流式染色，最后通过流式检测检测CD8阳性细胞中五聚体阳性的抗原特异性CD8+T细胞的比例。

图3D所示的结果提示该部分实验结果提示circFam53b所编码的抗原表位多肽(即ALFRLTNRA)可以刺激产生抗原特异性CD8+T细胞。

实施例4过继circFam53b所编码的抗原表位激活的T细胞在乳腺癌PDX小鼠模型中的功效

本实施例的目的为进一步验证circFam53b所编码的抗原表位激活的T细胞具有抑制肿瘤生长的作用。取健康NOD/SCID小鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，取乳腺癌患者组织，植入小鼠***脂肪垫，建立PDX小鼠模型。在肿瘤组织可触及时开始进行实验处理。空白对照组不进行任何处理；阳性对照组予以过继患者2.5×10⁶个T细胞及5×10⁵个树突状细胞；实验组予以过继患者自体来源的等量的T细胞及树突状细胞并添加circFam53b所编码的抗原表位多肽20μg/mL，细胞培养方法都实例2，观察记录小鼠的肿瘤生长情况。结果如图4所示，表明circFam53b所编码的抗原表位多肽作用过继T细胞得到的T细胞能有效抑制肿瘤的生长。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种应用以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院

<120> 一种可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<223> 可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原

<400> 1

Ala Leu Phe Arg Leu Thr Asn Arg Ala

1 5

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<223> 编码可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原的核苷酸序列

<400> 2

gccctcttca gattgaccaa ccgagca 27

<210> 3

<211> 219

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<223> circFam53b编码的多肽序列

<400> 3

Met Ser Ser Cys Arg Thr Ser Trp Arg Pro Leu Gly Ser Lys Val Trp

1 5 10 15

Thr Pro Val Glu Lys Arg Arg Cys Tyr Ser Gly Gly Ser Val Gln Arg

20 25 30

Tyr Ser Asn Gly Phe Ser Thr Met Gln Arg Ser Ser Ser Phe Ser Leu

35 40 45

Pro Ser Arg Ala Asn Val Leu Ser Ser Pro Cys Asp Gln Ala Gly Leu

50 55 60

His His Arg Phe Gly Gly Gln Pro Cys Gln Gly Val Pro Gly Ser Ala

65 70 75 80

Pro Cys Gly Gln Ala Gly Asp Thr Trp Ser Pro Asp Leu His Pro Val

85 90 95

Gly Gly Gly Arg Leu Asp Leu Gln Arg Ser Leu Ser Cys Ser His Glu

100 105 110

Gln Phe Ser Phe Val Glu Tyr Cys Pro Pro Ser Ala Asn Ser Thr Pro

115 120 125

Ala Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Arg Ser Ser Gly Leu Ser Arg Ser

130 135 140

Arg Ser Gln Pro Cys Val Leu Asn Asp Lys Lys Val Gly Val Lys Arg

145 150 155 160

Arg Arg Pro Glu Glu Val Gln Glu Gln Arg Pro Ser Leu Asp Leu Ala

165 170 175

Lys Met Ala Gln Lys Met Thr Asp Gly Glu Thr Trp Thr Gly Asn Ala

180 185 190

Leu Phe Arg Leu Thr Asn Arg Ala Pro Ala Ser Gly Asn Ala Cys Leu

195 200 205

Lys Arg Thr Ala His Tyr Gly Thr Gly Arg Gln

210 215

<210> 4

<211> 773

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<223> circFam53b的碱基序列

<400> 4

aaaatgacag atggcgagac ctggacagga aatgccctct tcagattgac caaccgagca 60

ccagcatctg ggaatgcctg cctgaaaagg acagctcact atggcaccgg gaggcagtga 120

ccgcctgcgc tgtgaccagt ctgatcaaag acctcagcat cagcgaccac aacgggaacc 180

cctcagcacc ccctagcaag cgccagtgcc gctcactgtc cttctccgat gagatgtcca 240

gttgccggac atcatggagg cccttgggct ccaaagtctg gactcccgtg gaaaagagac 300

gctgctacag cgggggcagc gtccagcgct attccaacgg cttcagcacc atgcagagga 360

gttccagctt cagcctccct tcccgggcca acgtgctctc ctcaccctgc gaccaggcag 420

gactccacca ccgatttgga gggcagccct gccaaggggt gccaggctca gccccgtgtg 480

gacaggcagg tgacacctgg agccctgacc tgcaccccgt gggaggaggc cggctggacc 540

tgcagcggtc cctctcttgc tcacatgagc agttttcctt tgtggaatac tgtcctccct 600

cagccaacag cacacctgcc tcaacaccag agctggcgag acgctccagc ggcctttccc 660

gcagccgctc ccagccgtgt gtccttaacg acaagaaggt cggtgttaaa aggcggcgcc 720

ctgaagaagt gcaagagcag aggccttctc tagaccttgc caagatggca cag 773

<210> 5

<211> 660

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<223> circFam53b编码多肽的开放阅读框序列

<400> 5

atgtccagtt gccggacatc atggaggccc ttgggctcca aagtctggac tcccgtggaa 60

aagagacgct gctacagcgg gggcagcgtc cagcgctatt ccaacggctt cagcaccatg 120

cagaggagtt ccagcttcag cctcccttcc cgggccaacg tgctctcctc accctgcgac 180

caggcaggac tccaccaccg atttggaggg cagccctgcc aaggggtgcc aggctcagcc 240

ccgtgtggac aggcaggtga cacctggagc cctgacctgc accccgtggg aggaggccgg 300

ctggacctgc agcggtccct ctcttgctca catgagcagt tttcctttgt ggaatactgt 360

cctccctcag ccaacagcac acctgcctca acaccagagc tggcgagacg ctccagcggc 420

ctttcccgca gccgctccca gccgtgtgtc cttaacgaca agaaggtcgg tgttaaaagg 480

cggcgccctg aagaagtgca agagcagagg ccttctctag accttgccaa gatggcacag 540

aaaatgacag atggcgagac ctggacagga aatgccctct tcagattgac caaccgagca 600

ccagcatctg ggaatgcctg cctgaaaagg acagctcact atggcaccgg gaggcagtga 660

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 上游引物F1

<400> 6

acgacaagaa ggtcggtgtt 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 下游引物R1

<400> 7

ccatctgtca ttttctgtgc ca 22

<210> 8

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 野生型IRES

<400> 8

cctgaaaagg acagctcact atggcaccgg gaggcagtga ccgcctgcgc tgtgaccagt 60

ctgatcaaag acctcagcat cagcgaccac aacgggaacc cctcagcacc ccctagcaag 120

cgccagtgcc gctcactgtc cttctccga 149

<210> 9

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 突变型IRES

<400> 9

cctgttttgg acagcttact atcctgccgg gacccagtga ccttttgcgc tgtgaggtgt 60

ctgatcgggg acctcagcat ctttgcacac aacgggaatt tttcagcatt taactgccag 120

cgccagtgcc gctcattgtc cttctcacg 149

<210> 10

<211> 1117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 目的序列

<400> 10

ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc 60

tggctaacta gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg 120

gagacccaag ctggctagaa aagtgctgag attacaggcg tgagccacca cccccggccc 180

actttttgta aaggtacgta ctaatgactt tttttttata cttcagaaaa tgacagatgg 240

cgagacctgg acaggaaatg ccctcttcag attgaccaac cgagcaccag catctgggaa 300

tgcctgcctg aaaaggacag ctcactatgg caccgggagg caggactaca aggatgacga 360

tgacaaggat tacaaagacg acgatgataa ggactataag gatgatgacg acaaatgacc 420

gcctgcgctg tgaccagtct gatcaaagac ctcagcatca gcgaccacaa cgggaacccc 480

tcagcacccc ctagcaagcg ccagtgccgc tcactgtcct tctccgatga gatgtccagt 540

tgccggacat catggaggcc cttgggctcc aaagtctgga ctcccgtgga aaagagacgc 600

tgctacagcg ggggcagcgt ccagcgctat tccaacggct tcagcaccat gcagaggagt 660

tccagcttca gcctcccttc ccgggccaac gtgctctcct caccctgcga ccaggcagga 720

ctccaccacc gatttggagg gcagccctgc caaggggtgc caggctcagc cccgtgtgga 780

caggcaggtg acacctggag ccctgacctg caccccgtgg gaggaggccg gctggacctg 840

cagcggtccc tctcttgctc acatgagcag ttttcctttg tggaatactg tcctccctca 900

gccaacagca cacctgcctc aacaccagag ctggcgagac gctccagcgg cctttcccgc 960

agccgctccc agccgtgtgt ccttaacgac aagaaggtcg gtgttaaaag gcggcgccct 1020

gaagaagtgc aagagcagag gccttctcta gaccttgcca agatggcaca ggtaagaagc 1080

aaggaaaaga attaggctcg gcacggtagc tcacacctgt aatcccagca tagcttaagt 1140

ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 1200

ctcccccgtg cct 1213

<210> 11

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 免疫原

<400> 11

Val Gln Glu Gln Arg Pro Ser Leu Asp Leu Ala Lys Met Ala Gln Lys

1 5 10 15

Met Thr Asp Gly Glu Thr Trp Thr Gly Asn Ala Leu Phe Arg Leu Thr

20 25 30

Asn Arg Ala Pro Ala Ser Gly Asn Ala Cys Leu Lys Arg Thr Ala His

35 40 45

Tyr Gly Thr Gly Arg Gln

50

Claims

1.一种可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原，其特征在于：所述的可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原的氨基酸序列如下所示：ALFRLTNRA。

2.编码权利要求1所述的可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于如下所示：GCCCTCTTCAGATTGACCAACCGAGCA。

4.权利要求1所述的可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原和/或权利要求2-3任一项所述的核苷酸序列在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.一种抗肿瘤药物，其特征在于：包括权利要求1所述的可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原，和/或权利要求2-3任一项所述的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的抗肿瘤药物，其特征在于：还包括T细胞和树突状细胞中的一种或两种。

7.根据权利要求6所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述的T细胞和所述的树突状细胞来源于过继患者。

8.根据权利要求5～7任一项所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述的肿瘤包括circFam53b过表达或者有circFam53b编码多肽表达的实体瘤和非实体瘤，包括但不限于：鼻腔及鼻窦恶性肿瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、涎腺肿瘤、颅内肿瘤、甲状腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、贲门癌、乳腺癌、纵膈肿瘤、胃癌、大肠癌、乙状结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌与壶腹周围癌、胆道癌、小肠恶性肿瘤、肾癌、***癌、膀胱癌、睾丸恶性肿瘤、***癌、子***、子宫内膜癌、卵巢癌、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、皮肤恶性黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病。

9.权利要求1所述的可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原的体外筛选方法，其特征在于包括如下步骤：取癌组织和癌旁组织进行circRNA高通量测序；对高通量测序的结果进行生物信息学分析，通过分析circRNA的测序结果，选择在肿瘤组织中高表达并具有编码功能的circRNA；通过实验确定生物信息学分析的结果，以筛选得到的circRNA所编码的多肽作为肿瘤免疫治疗的作用对象，挑选出circRNA所编码的部分或全部多肽用于制作多肽疫苗，得到可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原。

10.根据权利要求9所述的可激活患者的抗肿瘤免疫反应的人肿瘤抗原的体外筛选方法，其特征在于：

所述的circRNA为circFam53；

所述的circFam53所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述的circFam53b的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的circFam53b编码多肽的开放阅读框的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。