CN113174406A - 斑马鱼lgp2基因敲除纯合子制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，是先确定斑马鱼LGP2基因敲除gRNA靶位点，根据该靶位点设计引物LGP2‑1F/R；再利用设计的引物获得gRNA片段；然后将zCas9mRNA和gRNA混合导入野生型斑马鱼，培养获得稳定遗传的LGP2基因敲除纯合子斑马鱼。如此，能成功构建针对斑马鱼LGP2及其同源基因的敲除纯合子，可以获得LGP2功能完全丢失的斑马鱼活体，为鱼类LGP2功能的***深入研究提供可用模型。
Description
技术领域
本发明属于水产和生物基因领域，具体涉及一种斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法。
背景技术
模式识别受体成员LGP2具有识别和结合病毒核酸RNA的功能，并调控病毒感染免疫反应，最终影响鱼类对病毒的抗性。然而，目前鱼类中LGP2的功能研究主要集中于在细胞水平对其基因表达水平作一定程度的调低或调高，尚未有鱼类活体LGP2敲除的功能缺失纯合子，导致不能对LGP2功能进行***深入研究和全面评价。
发明内容
本发明的目的是，针对上述现有技术存在的不足，提供一种斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，通过成功构建针对斑马鱼LGP2及其同源基因的敲除纯合子，可以获得LGP2功能完全丢失的斑马鱼活体，为鱼类LGP2功能的***深入研究提供可用模型；利用该斑马鱼LGP2敲除纯合子模型开展功能研究可以准确评价LGP2发挥的免疫功能及影响的信号通路，并为鱼类RLR通路分子功能及互作机制研究提供实验模型。
为达上述目的，本发明采用的技术方案是：一对引物，是根据斑马鱼LGP2基因敲除gRNA靶位点序列所设计，该引物对为LGP2-1F：ataGAGGCTGCTTCCCACCGTTGCgt(SEQ IDNO.2)和LGP2-1R：taaaacGCAACGGTGGGAAGCAGCCT(SEQ ID NO.3)。
本发明同时提供一种斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，该方法步骤如下：
A.利用上述引物(LGP2-1F/R)获得gRNA片段；
具体地，上述gRNA片段是按以下步骤制备得到：(1)确定斑马鱼LGP2基因敲除gRNA靶位点，根据该靶位点设计引物LGP2-1F/R；(2)将引物与gRNA克隆骨架连接获得转录模板，根据该模板PCR获得gRNA体外转录模板，再根据体外转录模板进行体外转录。较佳的，所述gRNA克隆骨架为pT7-gRNA_BbsI。
B.将zCas9 mRNA和gRNA混合导入野生型斑马鱼，培养获得稳定遗传的LGP2基因敲除纯合子斑马鱼。
其中，上述zCas9 mRNA是利用XbaI单酶切线性化pSP6-2sNLS-ZCas9载体，获得zCas9 mRNA的体外转录模板，根据该模板进行体外转录获得。其中，酶切体系为：ZCas920ug，Buffer 10X 10uL，XbaI 5uL，加无RNA酶水至反应总体积为100uL。
其中，zCas9 mRNA和gRNA是按600pg:100pg的比例混合，上述提及的导入野生型斑马鱼是指对野生型斑马鱼单细胞期胚胎进行注射。
具体地，上述培养获得稳定遗传的LGP2基因敲除纯合子斑马鱼的过程如下：(1)对经过注射的斑马鱼进行基因测序，获得LGP2基因敲除的斑马鱼杂合子F0代；(2)将F0代与AB型野生斑马鱼外交得F1代，经基因测序，获得“-6+1bp”型F1代斑马鱼；(3)将成熟F1代“-6+1bp”型雌、雄杂合子进行内交得F2代，经基因测序后获得“-6+1bp”基因编辑F2代雌性纯合子斑马鱼和“-6+1bp”基因编辑F2代雄性杂合子斑马鱼；(4)将“-6+1bp”基因编辑F2代雌性纯合子斑马鱼与“-6+1bp”基因编辑F2代雄性杂合子斑马鱼交配产生F3代，经基因测序后获得F3“-6+1bp”型雌、雄纯合子斑马鱼；(5)将F3“-6+1bp”型雌纯合子斑马鱼与F3“-6+1bp”型雄纯合子斑马鱼进行内交，即得LGP2基因敲除纯合子斑马鱼。其中，基因测序时所采用的引物为LGP2-JF：5′-CTGGTGGTGATCAGTGAAAC-3′(SEQ ID NO.4)和LGP2-JR：5′-CACCTAGTACACAAAACACA-3′(SEQ ID NO.5)。
本发明的有益效果如下：
(1)筛选获得可同时对斑马鱼LGP2基因及其同源异构体进行敲除的gRNA靶点及对应引物序列(LGP2-1F/R)。
(2)基于AB型野生斑马鱼首次成功获得LGP2敲除的斑马鱼纯合子。
(3)通过比较纯合子与野生型斑马鱼RLR通路成员及其介导的干扰素通路成员表达变化发现LGP2负向调控干扰素抗病毒反应，为LGP2及其它RLR成员参与病毒感染过程功能的***深入研究提供优质模型。
附图说明
图1是斑马鱼LGP2“-6+1bp”型敲除测序检测。
图2是斑马鱼LGP2敲除对RLR成员及干扰素反应通路的影响。(纵坐标为基因相对表达量)
其中，A是针对ifnphi1、ifnphi2、ifnphi4、ifih1、mxa，B是针对ifnphi3、mavs、ddx58、mxb。
具体实施方式
实施例1
本实验基于CHOPCHOP软件设计斑马鱼LGP2基因敲除的特定引物，并对AB型野生斑马鱼胚胎开展LGP2的基因敲除实验。
1.斑马鱼LGP2敲除可用gRNA靶点筛选及制备
LGP2基因片段CCTAGGTCCTGTATAGCAGACATACATATATAAACAAGTCGTTTGAAAACTAATTTATGTTGTACCATTTCTCTCATTCTCAGATCTGTGCCAATCTGGATTCAAAAATTGTGTCCACCAAGAATTACACACCGATGCTGCAGAACTTTGTGCCAAAACCCAAAAAGGAATACGACATTGTCGAAAGAAGAGATAAAGTACTGTCTTTCTGCCATGCAAATCCCAGACCTGCTGCTTGATCATTCAAGACCAATGTTTATGTATGTTTATTTGTGTGCAACAGGATCCATTTGGTGACCACTTGAAGTCAATGATGTTAATGATTCATGAGTTTATGCCAGCAACGGTGGGAAGCAGCCTGAGAGAACTAGGCACCCAGGAATATGAGGCTGATGTGGTGGAACTGGAGAAAGCAGGTTGGAGGTCATTTTTACTAGTTTGAATTTTACATTCAGAAATCTATGCAAAGTTTACTGGGTTTAATGGTGTGTTTTGGGAAACTAGGGTGA(SEQID NO.1)中下划线区域位于LGP2基因的第5外显子，属于斑马鱼LGP2及其同源基因的共同保守序列，是选定的斑马鱼LGP2基因敲除gRNA靶位点。针对该靶位点进行基因敲除引物设计，设计的靶位点引物序列如下：
LGP2-1F：ataGAGGCTGCTTCCCACCGTTGCgt(SEQ ID NO.2)，
LGP2-1R：taaaacGCAACGGTGGGAAGCAGCCT(SEQ ID NO.3)。
将上述各组oligo序列用ddH2O溶解为10μM的溶液，退火(退火程序：95℃加热5min，然后每30s降低1℃，至4℃)，获得粘性末端小片段。将退火后的粘性末端小片段与gRNA克隆骨架pT7-gRNA_BbsI连接，连接体系为0.5μL的pT7-gRNA_BbsI，退火后的各组粘性末端小片段1μL，2×Solution I(Takara)5μL，加ddH2O 3.5μL；16℃下1h。将连接产物转入大肠杆菌BL21，挑取单克隆送测序，选取序列正确的克隆质粒为转录模板(命名为pT7gRNAplasmid)。利用常规引物T7gRNA-F/R，pT7gRNA plasmid 5ng，使用高保真酶Prime StarPCR，在45个循环的95℃15s，60℃20s，72℃15s的条件下扩增得到gRNA体外转录模板。按照Ambion的
试剂盒完成gRNA的体外转录。按照Ambion的mirVanaTM miRNA分离试剂盒完成gRNA的体外转录及纯化回收。
2.zCas9 mRNA制备：
制备zCas9 mRNA的体外转录模板：利用XbaI单酶切线性化pSP6-2sNLS-ZCas9载体，酶切体系为：ZCas9 20ug，Buffer 10X 10uL，XbaI 5uL，加无RNA酶水至反应总体积为100uL，37°反应2小时。琼脂糖凝胶电泳确认线性化完全并回收线性化产物，37℃条件下体外转录2h获得zCas9 mRNA。
3.测序引物的设计
为检测基因敲除效果，设计一对测序检测引物为：LGP2-JF：5′-CTGGTGGTGATCAGTGAAAC-3′(SEQ ID NO.4)和LGP2-JR：5′-CACCTAGTACACAAAACACA-3′(SEQID NO.5)，对应扩增的PCR产物为509bp。509bp的产物扩增区域包含了靶点区域，能用于检测是否在靶点区域实现了敲除。
4.显微注射及切割效率验证；
按照zCas9 mRNA 600pg/gRNA100pg混合比例对野生型斑马鱼单细胞期胚胎进行注射，每个靶点注射150颗胚胎。在注射后2天随机挑选20条幼鱼提取基因组PCR测序，结果显示引物LGP2-1F/R对应的靶点出现乱峰，表明成功获得敲除杂合子(F0代)。
5.F1及F2代可用编辑斑马鱼筛选
将F0代斑马鱼与AB型野生斑马鱼外交获得F1代斑马鱼；针对每条F0斑马鱼，对应随机挑取10颗其产生的正常发育的F1代鱼受精卵，裂解后提取DNA并PCR测序检测，挑选靶点处出现双峰的片段做TA克隆鉴定切割方式，结果显示F1代幼鱼出现乱峰的阳性率为3/9。
F1代斑马鱼利用LGP2-1F/R处理后筛选结果如下：成鱼剪尾阳性率13/22，为4条“-85bp”型，5条“-6+1bp”型，1条“-5bp”型，其余为野生型鱼。将成熟F1代中-6+1bp型雌、雄杂合子进行内交，获得F2代。对12尾F2斑马鱼进行剪尾、DNA提取和PCR测序检测发现存在“-6+1bp”型雄性杂合子鱼2条、雌性杂合子鱼3条、雌性纯合子鱼1条。
6.LGP2“-6+1bp”型敲除纯合子筛选和鉴定
将“-6+1bp”基因编辑F2雌性纯合子斑马鱼与“-6+1bp”基因编辑F2雄性杂合子斑马鱼交配，产生F3代鱼；逐条剪尾并提取“-6+1bp”型F3代成鱼尾巴DNA，PCR扩增靶点区域后测序，得到3条“-6+1bp”型雌性纯合子和雄性纯合子以及3条杂合子。将F3“-6+1bp”型雌、雄纯合子斑马鱼进行内交获得60条F4，F4均为“-6+1bp”型纯合子斑马鱼(图1)。
实施例2基因敲除纯合子LGP2通路基因表达检测
从F4“-6+1bp”型基因敲除纯合子斑马鱼中随机选择7天生长期的60条鱼进行LGP2信号通路成员基因表达检测，结合参见图2，结果显示，LGP2敲除纯合子较AB型野生斑马鱼ifih1、ddx58、ifnphi1、ifnphi2、ifnphi3、ifnphi4、mxa、mavs基因表达上调，而mxb基因表达下调；说明斑马鱼LGP2基因敲除对RLR成员及其介导的干扰素反应通路产生了实质性影响，LGP2负向调控其RLR通路成员ifih1、ddx58以及其介导的干扰素抗病毒反应。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法
<130> 0005
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 509
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 1
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tgtaccattt ctctcattct cagatctgtg ccaatctgga ttcaaaaatt gtgtccacca 120
agaattacac accgatgctg cagaactttg tgccaaaacc caaaaaggaa tacgacattg 180
tcgaaagaag agataaagta ctgtctttct gccatgcaaa tcccagacct gctgcttgat 240
cattcaagac caatgtttat gtatgtttat ttgtgtgcaa caggatccat ttggtgacca 300
cttgaagtca atgatgttaa tgattcatga gtttatgcca gcaacggtgg gaagcagcct 360
gagagaacta ggcacccagg aatatgaggc tgatgtggtg gaactggaga aagcaggttg 420
gaggtcattt ttactagttt gaattttaca ttcagaaatc tatgcaaagt ttactgggtt 480
taatggtgtg ttttgggaaa ctagggtga 509
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 2
atagaggctg cttcccaccg ttgcgt 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 3
taaaacgcaa cggtgggaag cagcct 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 4
ctggtggtga tcagtgaaac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 5
cacctagtac acaaaacaca 20
Claims (10)
1.一对引物，其特征在于，该引物对为
LGP2-1F，序列如SEQ ID NO.2所示，
LGP2-1R，序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，其特征在于，该方法步骤如下：
A.利用权利要求1所述的引物获得gRNA片段；
B.将zCas9 mRNA和gRNA混合导入野生型斑马鱼，培养获得稳定遗传的LGP2基因敲除纯合子斑马鱼。
3.如权利要求2所述的斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，其特征在于，所述步骤A中的gRNA片段是按以下步骤制备得到：
(1)确定斑马鱼LGP2基因敲除gRNA靶位点，根据该靶位点设计权利要求1所述的引物LGP2-1F/R；
(2)将引物与gRNA克隆骨架连接获得转录模板，根据该模板PCR获得gRNA体外转录模板，再进行体外转录。
4.如权利要求3所述的斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，其特征在于，所述gRNA克隆骨架为pT7-gRNA_BbsI。
5.如权利要求2所述的斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，其特征在于，所述步骤B中的zCas9 mRNA是利用XbaI单酶切线性化pSP6-2sNLS-ZCas9载体，获得zCas9 mRNA的体外转录模板，再根据该模板进行体外转录。
6.如权利要求5所述的斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，其特征在于，所述酶切体系为：ZCas9 20ug，Buffer 10X 10uL，XbaI 5uL，加无RNA酶水至反应总体积为100uL。
7.如权利要求2所述的斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，其特征在于，所述步骤B中zCas9 mRNA和gRNA是按600pg:100pg的比例混合。
8.如权利要求2所述的斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，其特征在于，所述导入野生型斑马鱼是指对野生型斑马鱼单细胞期胚胎进行注射。
9.如权利要求2所述的斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，其特征在于，所述步骤B中的培养获得稳定遗传的LGP2基因敲除纯合子斑马鱼的过程如下：
(1)对经过注射的斑马鱼进行基因测序，获得LGP2基因敲除的斑马鱼杂合子F0代；
(2)将F0代与AB型野生斑马鱼外交得F1代，经基因测序，获得“-6+1bp”型F1代斑马鱼；
(3)将成熟F1代“-6+1bp”型雌、雄杂合子进行内交得F2代，经基因测序后获得“-6+1bp”基因编辑F2代雌性纯合子斑马鱼和“-6+1bp”基因编辑F2代雄性杂合子斑马鱼；
(4)将“-6+1bp”基因编辑F2代雌性纯合子斑马鱼与“-6+1bp”基因编辑F2代雄性杂合子斑马鱼交配产生F3代，经基因测序后获得F3“-6+1bp”型雌、雄纯合子斑马鱼；
(5)将F3“-6+1bp”型雌纯合子斑马鱼与F3“-6+1bp”型雄纯合子斑马鱼进行内交，即得LGP2基因敲除纯合子斑马鱼。
10.如权利要求9所述的斑马鱼LGP2基因敲除纯合子制备方法，其特征在于，所述基因测序时所采用的引物为LGP2-JF/JR，序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
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