CN113166747A - 蛋白酶变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及真菌丝氨酸蛋白酶的变体，其具有畸枝霉属蛋白酶的丝氨酸蛋白酶活性。还公开了分离的核酸分子，其包含编码真菌丝氨酸蛋白酶变体多核苷酸序列、编码所述蛋白酶变体的核酸序列。还公开了宿主细胞和生产具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法。所述蛋白酶变体可用作适用于去污剂组合物和酶制剂，用于处理纤维、羊毛、毛发、皮革或丝绸、用于处理食品或饲料、或用于涉及蛋白质材料的修饰、降解或去除中的任何应用。

Description

蛋白酶变体及其用途
技术领域
本发明涉及丝氨酸蛋白酶的变体，尤其涉及可用于各种应用，特别是去污剂中的真菌丝氨酸蛋白酶的变体。本发明进一步涉及编码所述酶变体的核酸分子、重组载体、用于产生所述酶变体的宿主细胞、包含所述酶变体的酶组合物以及制备此类组合物的方法。本发明还涉及所述酶变体和包含所述酶变体的组合物的各种用途。
背景技术
微生物蛋白酶是最重要的水解酶之一，可应用于各种工业领域，例如去污剂、食品、皮革、药物、诊断、废物管理和银回收。微生物胞外蛋白酶占全球工业酶总销售额的主要部分(Cherry和Fidantsef，2003)。大约90％的商业蛋白酶是去污剂酶(Gupta等，2002)。当前使用的商业去污剂制剂包含源自芽孢杆菌属(Bacillus)物种的枯草杆菌蛋白酶家族或枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)的天然存在的碱性丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)，或者是其重组蛋白酶制剂(Maurer,2004)。
商业蛋白酶的实例例如枯草杆菌蛋白酶Carlsberg
Figure BDA0003112775170000011
枯草杆菌蛋白酶309
Figure BDA0003112775170000012
枯草杆菌蛋白酶147
Figure BDA0003112775170000013
Figure BDA0003112775170000014
和冷洗蛋白酶
Figure BDA0003112775170000015
(Novozymes A/S,DK)、
Figure BDA0003112775170000016
Ox、
Figure BDA0003112775170000017
Prime和
Figure BDA0003112775170000018
(Genencor Int.,Inc.，美国)，以及BLAP S和X系列(德国，汉高)。
在液体去污剂中使用蛋白酶的主要问题是它们对去污剂中其他酶的不稳定性和蛋白水解活性。在液体去污剂中，酶与水和离液剂(如阴离子表面活性剂和络合剂)直接接触，这会导致不可逆的变性。蛋白酶降解蛋白质包括其自身和去污剂制剂中的其他酶。表面活性剂和热量增强了自动蛋白水解。因此，酶在含有蛋白酶的液体去污剂中的稳定性代表了产品开发的主要挑战(Maurer，2010)。已使用多种方法来提高工业丝氨酸蛋白酶的稳定性。基于源自同源蛋白质之间的晶体结构和序列相似性比较的信息，可以设计具有改进稳定性和/或改进性能的变体。已经通过定点和/或随机诱变开发了具有改进的催化效率和/或对温度、氧化剂和不同洗涤条件的更好稳定性以及改进的在液体去污剂中的储存稳定性的天然丝氨酸蛋白酶的变体。蛋白酶通过现有技术已知的方法有意地或随机地修饰并且被优化以用于例如去污剂和清洁剂中。这些包括点诱变、缺失或***诱变，或与其他蛋白质或蛋白质部分的融合。一些蛋白酶的优化变体是现有技术已知的。优化变体尤其是枯草杆菌蛋白酶的已知变体。例如，申请WO199523221描述了在其他突变体中，迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)DSM 5483的枯草杆菌蛋白酶中的突变，申请WO2011032988、WO2011141358、WO2012080201和WO2012080202描述了基于芽孢杆菌DSM 5483的枯草杆菌酶，当使用这种突变时，提高蛋白酶性能以及减少蛋白酶和其他分子的损伤。
嗜热霉菌素(Thermomycolin)EC 3.4.21.65，作为细胞外碱性内肽酶分离，由嗜热真菌畸枝霉属Malbranchea pulcella变体sulfurea产生。嗜热霉菌素被描述为325个残基的单链蛋白质。它具有活性位点序列–Leu-Ser-(Gly)-Thr-Ser*-Met-，这是枯草杆菌蛋白酶家族成员的典型特征。嗜热霉菌素具有一个二硫键，这是非常特殊的。嗜热霉菌素的热稳定性不如嗜热细菌的胞外丝氨酸蛋白酶，但它比大多数真菌蛋白酶更稳定(Gaucher和Stevenson，2004)。根据Ong和Gaucher(1975)的说法，在73℃和10mM Ca2+存在下，嗜热霉菌素发生热灭活。嗜热霉菌素在宽的pH范围内水解酪蛋白。酪蛋白水解的最佳pH值为约8.5。EP2691520B1(AB Enzymes Oy)公开了樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)(Lib.)Oorschot de Hoog ALKO4122的嗜热霉菌素蛋白酶，其与商业蛋白酶产品Savinase 16L和Savinase Ultra 16L相比，具有改进的稳定性、改进的洗涤性能和去污性能。
尽管已经发表了大量专利出版物、综述和文章，公开了来自各种微生物的丝氨酸蛋白酶，但仍然非常需要新的蛋白酶，适用于并有效地修饰、降解和去除不同污渍的蛋白质材料和它们在具有高度不同性质的去污剂存在下是稳定的。由于丝氨酸蛋白酶的自催化特性，储存过程中的稳定性也非常重要。然而，重要的是去污剂中的其他酶在蛋白酶存在下也是稳定的。蛋白酶抑制剂可潜在地用于稳定包含丝氨酸蛋白酶的组合物中的蛋白酶。然而，抑制剂并不总是最佳地发挥作用，因此，特别需要新的蛋白酶，它们能有效去除污渍，但对自身和其他酶的侵蚀性较小。
还希望丝氨酸蛋白酶可以大量生产，并且通过与细胞或菌丝体的简单分离，可以经济高效地进行下游处理。
发明内容
本发明的目的是提供在宽pH范围内具有活性并在宽温度范围内良好发挥作用的新的畸枝霉属(Malbranchea)蛋白酶变体。用于去污剂应用的丝氨酸蛋白酶在去污剂存在下也必须是稳定的并且与去污剂相容。本发明的进一步目的是提供编码所述酶变体的核酸分子、重组载体、用于产生所述酶变体的宿主细胞、包含所述酶变体的组合物、制备此类组合物的方法以及所述酶变体和包含所述酶变体的组合物的用途。
本发明的目的是提供新的畸枝霉属蛋白酶变体，当与这些变体组合储存或使用时，它们对其他酶的侵蚀性较低，并且与野生型畸枝霉属蛋白酶相比，还具有更好的去污性能，同时该酶变体的稳定性与野生型畸枝霉属蛋白酶的稳定性一样好。
根据本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可以在高产真菌宿主及其下游加工中产生，例如发酵液和菌丝体的分离易于进行。
本发明涉及真菌丝氨酸蛋白酶变体，其具有丝氨酸蛋白酶活性并包含与SEQ IDNO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且其包含在根据SEQ IDNO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E。优选的丝氨酸蛋白酶是突变的丝氨酸蛋白酶，它是樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)(Lib.)Oorschot de Hoog野生型蛋白酶的衍生物。
本发明人发现，在这里表示与来自畸枝霉属的重组丝氨酸蛋白酶相同的真菌丝氨酸蛋白酶变体在不同的试验条件下，对不同的污渍，以ΔL*测量的去污性能优于野生型畸枝霉属蛋白酶的性能。
本发明的一个目的是提供一种重组丝氨酸蛋白酶，其包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且其包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E。
本发明的另一个目的是提供一种分离的核酸分子，其包含编码选自以下组的丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列：
(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列的核酸分子；和
(b)包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中描述的核苷酸序列的编码序列的核酸分子。
本发明的再一个目的是提供一种重组表达载体，其包含根据权利要求4所述的分离核酸，所述核酸与能够指引所述丝氨酸蛋白酶在合适宿主中表达和分泌的调控序列可操作地连接。
还公开了包含重组表达载体的宿主细胞和包含本发明的重组丝氨酸蛋白酶的酶制剂。
本发明的一个目的是提供生产蛋白酶的方法，该方法包括步骤：将氨基酸取代Q103D和/或S105E引入序列中，所述序列包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的重组丝氨酸蛋白酶或酶制剂在用于去污剂、用于处理纤维、用于处理蛋白质材料、用于处理食品或饲料或用于涉及蛋白质材料的改性、降解或去除的应用中的用途也是本发明的一个方面。
根据本发明，重组丝氨酸蛋白酶或酶制剂可用作去污剂添加剂。根据本发明，重组丝氨酸蛋白酶或酶制剂可用于液体去污剂或固体去污剂中，优选为条，均质片剂，具有两层或更多层的片剂，具有一个或更多个隔室的袋，常规或致密粉剂，粒剂(granule)，颗粒剂(granulate)，糊剂，凝胶，或常规、致密或浓缩液体的形式。本发明一方面还提供了一种去污剂组合物，其包括表面活性剂、根据本发明的重组丝氨酸蛋白酶或酶制剂以及选自稳定剂、缓冲剂、助洗剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、光增白剂、染料、香料、颜料和防腐剂的添加剂。
附图简述
图1显示了畸枝霉属ALK04122蛋白酶基因的核苷酸序列、其部分启动子(ATG上游的50个核苷酸)和终止子序列(终止密码子下游的60个核苷酸)以及所编码蛋白酶的推导氨基酸序列。SignalP V3.0程序分析的推定信号肽以小写字母表示并加下划线。pro序列和pro序列的推导氨基酸以小写字母表示。成熟的核苷酸和肽序列以大写字母表示。三个推定的内含子序列以小写的斜体字母表示，并由核苷酸序列下方的虚线标记。终止密码子由序列下方的星号显示。突变的氨基酸Q103和S105被加粗。
图2示意性地显示了用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)中生产M59畸枝霉属蛋白酶变体的表达盒pALK452l。使用NotI限制酶将7234bp表达盒从质粒载体骨架上切割。pcbhl，cbhl启动子；tcbhl，cbhl终止子；s_amdS，编码构巢曲霉氨酰胺酶(Aspergillusnidulans asetamidase)(选择标记)的合成基因；M59，变体畸枝霉属蛋白酶基因。与野生型成熟序列相比，变体蛋白酶的成熟氨基酸序列中的突变显示在变体基因名称下方。合成的amdS基因由天然构巢曲霉amdS(A.nidulans amdS)启动子表达。分别用于生产M60和M61变体的表达盒pALK4522和pALK4523，在其结构上与用于生产M59的pALK452l相似，如图所示。
图3示意性地显示了M0变体与亲本分子M0相比，以8个污渍的ΔL*总和的方式的去污性能。在Launder-Ometer中的洗涤条件：40℃，l6°dh，60min，商业液体去污剂5g/l，pH值约为8.2。
图4显示了M0变体与亲本分子M0在每毫升洗涤液6.5BPU的剂量下，以血-牛奶-墨水污渍的ΔL*的方式的去污效果。在Launder-Ometer中的洗涤条件：40℃，l6°dh，60min，商业液体去污剂5g/l，pH值约为8.2。
图5显示了M0变体和亲本分子M0在每毫升洗涤液6.5BPU的剂量下，以蛋渍的ΔL*的方式的去污效果。在Launder-Ometer中的洗涤条件：40℃，l6°dh，60min，商业液体去污剂5g/l，pH值约为8.2。
图6显示了变体M60的生产样样品与亲本分子M0相比，以8个污渍的AL*总和的方式的去污性能。在Launder-Ometer中的洗涤条件：40℃，l6°dh，60min，商业液体去污剂5g/l，pH值约为8.2。
图7A显示了M0变体的生产样样品与亲本分子M0，以血-牛奶-墨水的ΔL*、CO(E-116)的方式的去污效果。在Launder-Ometer中的洗涤条件：40℃，l6°dh，60min，商业液体去污剂5g/l，pH值约为8.2。
图7B显示了M0变体的生产样样品与亲本分子M0，以血-牛奶-墨水的ΔL*、CO+PES(E-117)的方式的去污效果。在Launder-Ometer中的洗涤条件：40℃，l6°dh，60分钟，商业液体去污剂5g/l，pH值约为8.2。
图7C显示了M0变体的生产样样品与亲本分子M0，以带有颜料的全蛋蛋渍的ΔL*、CO(C-S-37)的方式的去污效果。在Launder-Ometer中的洗涤条件：40℃，l6°dh，60分钟，商业液体去污剂5g/l，pH值约为8.2。
图7D显示了M0变体的生产样样品与亲本分子M0，以带有颜料的蛋黄蛋渍的ΔL*、CO(C-S-38)的方式的去污效果。在Launder-Ometer中的洗涤条件：40℃，l6°dh，60分钟，商业液体去污剂5g/l，pH值约为8.2。
图8描述了M0变体(培养样品)对商业纤维素酶(1％)在液体去污剂中于37℃和7天下的降解效果，使用的蛋白酶量对应于520BPU/g的活性。与含有亲本分子M0作为蛋白酶的溶液相比，储存后的纤维素酶的稳定性显示为相对残留活性。
图9描述了变体M60的生产样样品与M0纤维素酶(1％)，在液体去污剂中于37℃和7天下的降解效果，使用高蛋白酶量对应于2080BPU/g的活性。与含有亲本分子M0作为蛋白酶的溶液相比，纤维素酶的稳定性显示为储存后的相对残留活性。
序列表
SEQ ID NO：1编码成熟畸枝霉属ALK04122蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列。如EP2691520B1中所述，全长基因包含在质粒pALK3094中。
SEQ ID NO：2成熟畸枝霉属ALK04122蛋白酶的氨基酸序列，包括蛋白酶的氨基酸Alal2l至Arg40l。
SEQ ID NO：3编码成熟畸枝霉属ALK04122蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列，在位置307-309具有突变CAG->GAC或CAG->GAT，导致成熟蛋白酶序列中的突变Q103D。
SEQ ID NO：4成熟畸枝霉属ALK04122蛋白酶的M59衍生物的氨基酸序列，包括成熟蛋白酶的氨基酸Alal2l至Arg40l和成熟蛋白酶的在位置103的突变Q103D。
SEQ ID NO：5编码成熟畸枝霉属ALK04122蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列，在位置313-315具有突变TCA->GAG或TCA->GAA，导致成熟蛋白酶序列中的突变S 105E。
SEQ ID NO：6成熟畸枝霉属ALK04122蛋白酶的M60衍生物的氨基酸序列，包括蛋白酶的氨基酸Alal2l至Arg40l和成熟蛋白酶的在位置105的突变S105E。
SEQ ID NO：7编码成熟畸枝霉属ALK04122蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列，分别在位置307-309和313-315具有突变CAG->GAC和TCA->GAT。
SEQ ID NO：8成熟畸枝霉属ALK04122蛋白酶的M61衍生物的氨基酸序列，包括蛋白酶的氨基酸Alal2l至Arg40l以及成熟蛋白酶的分别在位置103和105的突变Q103D和S105E。
SEQ ID NO：9编码全长畸枝霉属ALK04122蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10全长畸枝霉属ALK04122蛋白酶的氨基酸序列(包括信号序列、原序列和成熟形式序列)。
详细说明
本发明提供了真菌来源的新型丝氨酸蛋白酶变体。
在本文中，“衍生自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株产生或可产生的丝氨酸蛋白酶，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码以及在用所述DNA序列转化的宿主生物体中产生的丝氨酸蛋白酶。最后，该术语旨在表示丝氨酸蛋白酶，它由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码，并且具有所讨论的丝氨酸蛋白酶的识别特征。
本发明的真菌丝氨酸蛋白酶变体基于畸枝霉属蛋白酶，优选基于樟绒枝霉(Lib.)Oorschot de Hoog(Malbranchea pulchella变体sulfurea(Miehe)Cooney&R.Emers的同义词)的蛋白酶。全长真菌丝氨酸蛋白酶，本发明的变体基于其中，由pALK3094中包含的多核苷酸序列编码，pALK3094保藏在大肠杆菌(Escherichia coli)RF8791中，保藏号DSM24410，如专利EP2691520 B1(AB酶Oy)中所披露。
优选地，本发明涉及真菌丝氨酸蛋白酶变体，其具有丝氨酸蛋白酶活性并包含如SEQ ID NO:4(M59)中限定的成熟蛋白酶的氨基酸序列或如SEQ ID NO:6(M60)中限定的成熟蛋白酶的氨基酸序列或如SEQ ID NO:8(M61)中限定的成熟蛋白酶的氨基酸序列。
本发明的真菌丝氨酸蛋白酶变体由包含编码本发明的真菌丝氨酸蛋白酶变体的核酸分子的重组表达载体产生，所述核酸分子与能够指引丝氨酸蛋白酶在合适宿主中表达的调控序列可操作地连接。宿主细胞的非限制性实例为真菌细胞，来自子囊菌门(Ascomycota)、盘菌亚门(Pezizomycotina)的丝状真菌细胞；优选地选自粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和囊菌目(Microascales)，曲霉菌属(Aspergillus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属(Humicola)；更优选地选自粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和囊菌目(Microascales)，曲霉菌属(Aspergillus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属(Humicola)；更优选地选自肉座菌科(Hypocreacea)、赤壳菌科(Nectriaceae)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、微囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma)(无性型肉座菌，anamorph of Hypocrea)、镰孢菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属(Metarhizium)、稻曲菌属(Villosiclava)、线虫草属(Ophiocordyceps)、头孢菌属(Cephalosporium)和足放线病菌属(Scedosporium)；更优选地选自里氏木霉(Trichoderma reesei)(红褐肉座菌，Hypocrea jecorina)、桔绿木霉(T.citrinoviridae)、长枝木霉(T.longibrachiatum)、绿木霉(T.virens)、哈茨木霉(T.harzianum)、棘孢木霉(T.asperellum)、深绿木霉(T.atroviridae)、近里氏木霉(T.parareesei)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰孢菌(F.gramineanum)、假禾谷镰孢菌(F.pseudograminearum)、镶片镰孢菌(F.venenatum)、藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)、串珠赤霉菌(G.moniliformis)、玉蜀黍赤霉菌(G.zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(Nectria haematococca)(血赤壳属，Haematonectria)、纸葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、葡萄穗霉属(S.chlorohalonata)、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhiziumacridum)、金龟子绿僵菌(M.anisopliae)、稻绿核菌(Villosiclava virens)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(Acremonium(Cephalosporium)chrysogenum)和尖端足放线病菌(Scedosporium apiospermum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、鲁克文金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliohpthora thermophila)、特异腐质霉(Humicolainsolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)；最优选是里氏木霉。宿主细胞的非限制性实例为酵母(例如，啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母菌(Pichia pastoris)、耶氏解脂酵母菌(Yarrowia lipolytica))和细菌细胞，优选革兰氏阳性杆菌(例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢(B.pumilus))、革兰阴性菌(如大肠杆菌(Escherichia coli))和放线菌(如链霉菌(Streptomyces sp.))。
在一个实施方案中，宿主细胞是真菌细胞，优选丝状真菌细胞，例如曲霉属、木霉属或里氏木霉属。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌细胞，优选革兰氏阳性芽孢杆菌细胞，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌。
优选地，所述酶变体在木霉属或曲霉属中产生，最优选在里氏木霉中产生。
本发明还涉及一种分离的核酸分子，其包含编码选自以下组的丝氨酸蛋白酶变体的多核苷酸序列：
(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含如SEQ ID NO:4中描述的氨基酸序列的核酸分子；
(b)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含如SEQ ID NO:6中描述的氨基酸序列的核酸分子；
(c)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含如SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列的核酸分子；
(d)包含如SEQ ID NO:3中描述的核苷酸序列的编码序列的核酸分子；
(d)包含如SEQ ID NO:5中描述的核苷酸序列的编码序列的核酸分子；和
(d)包含如SEQ ID NO:7中描述的核苷酸序列的编码序列的核酸分子。
本发明涉及生产具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞和回收多肽的步骤。此外，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽也在本发明范围内，该多肽通过本发明的核酸序列编码并且可通过上述方法获得。
本发明涉及一种获得酶制剂的方法，包括培养本发明的宿主细胞以及从细胞中回收多肽或从培养基中分离细胞并获得上清液的步骤。可通过上述方法获得的酶制剂也在本发明范围内。
本发明涉及一种酶制剂，其包含本发明的一种丝氨酸蛋白酶变体或多种丝氨酸蛋白酶变体。
术语“突变体”或“变体”在本文中也用于指含有相对于相应野生型丝氨酸蛋白酶的突变的丝氨酸蛋白酶。
本发明进一步涉及包含本发明的一种丝氨酸蛋白酶变体或多种丝氨酸蛋白酶变体的组合物。
含有本发明的一种蛋白酶变体或多种蛋白酶变体的酶制剂或组合物(例如去污剂制剂)可以进一步包含选自蛋白酶(不同于本发明的蛋白酶的其他蛋白酶)、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、***糖酶、半乳聚糖酶、黄原酶、木葡聚糖酶、DNA酶、漆酶和/或过氧化物酶和氧化酶的有或没有介质的其他酶，以及选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、助洗剂、抗再沉积剂、光增白剂、染料、颜料、香料、腐蚀剂、研磨剂和防腐剂等的合适的添加剂。
生产宿主的用过的培养基可以用于此(used as such)，或者可以去除宿主细胞，和/或可以将其浓缩、过滤或分级。也可以晒干。包含本发明的丝氨酸蛋白酶的酶制剂和组合物可以是液体组合物或固体组合物的形式，例如溶液、分散体、糊剂、粉剂、粒剂、颗粒剂、包衣颗粒剂、片剂、糕剂、晶体、晶体浆液、凝胶或丸剂。酶在制剂或组合物中可以是固定形式。
本发明还包括本发明的一种丝氨酸蛋白酶变体或多种丝氨酸蛋白酶变体或酶制剂用于去污剂、用于处理纤维、用于处理蛋白质材料(例如羊毛、头发、皮革、丝绸)、用于处理食物或饲料，或用于任何涉及蛋白质材料的修饰、降解或去除的应用。所述酶组合物用于纺织和去污剂工业、生物质加工和生物质水解，优选用于生物燃料、淀粉、纸浆和造纸、食品、烘焙、饲料或饮料工业。特别地，酶或酶制剂可用作液体去污剂或固体去污剂中的去污剂添加剂，优选为条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或更多个隔室的袋、常规或致密粉剂、粒剂、颗粒剂、糊剂、凝胶，或常规、致密或浓缩液体。
这些酶变体在洗涤中于宽pH值和温度范围内都具有活性，并且在低温范围以及中高温下性能特别好。酶变体是去污剂应用的理想选择，能够耐受典型的去污剂组合物，并且在去污剂溶液中的低酶水平下有效。特别地，蛋白酶变体在0℃至90℃的应用温度下具有活性，优选的范围是从5℃至60℃。本发明的每种真菌丝氨酸蛋白酶变体能够在去污剂的存在下、在0℃至90℃的温度下，优选在5℃至60℃的温度下降解或去除蛋白质污渍。本发明的真菌丝氨酸蛋白酶变体取决于洗涤条件和去污剂中的辅助成分和添加剂，在等于或低于60℃的温度下特别适有效。
本发明的蛋白酶在液体去污剂组合物中也是高度稳定的。因此，本发明提供了用于去污剂和其他应用，特别是液体制剂的新型丝氨酸蛋白酶变体。真菌丝氨酸蛋白酶变体可以在高产真菌宿主及其下游加工中产生，例如发酵液和菌丝体的分离易于进行。
与本发明相关的“丝氨酸蛋白酶”或“丝氨酸内肽酶”或“丝氨酸内切蛋白酶”是指被国际生物化学和分子生物学联盟命名法分类为EC 3.4.21的酶。蛋白酶可以使用组特异性抑制剂进行分类。不同组的丝氨酸蛋白酶抑制剂包括合成化学抑制剂和天然蛋白质抑制剂。因此，丝氨酸蛋白酶活性可以在基于特定底物裂解的分析中或在在合适条件下使用含有底物的任何含蛋白质的底物的分析中测定，该底物具有或不具有丝氨酸蛋白酶的特异性抑制剂。
本发明中使用的术语“丝氨酸蛋白酶活性”是指对含有蛋白质的底物(例如酪蛋白、血红蛋白和BSA)的水解活性。蛋白质水解活性的分析方法在文献中是众所周知的，例如在Gupta等人(2002)中提到。
丝氨酸蛋白酶被合成为非活性的酶原前体或酶原形式的前辅酶，其通过去除信号序列(分泌信号肽或前肽)和前序列(前肽)而被激活，以产生酶的活性成熟形式(Chen和Inouye，2008)。
合适的信号序列的实例为真菌或酵母生物的那些信号序列。这样的信号序列在文献中是众所周知的。合适的前序列是真菌或酵母或细菌蛋白酶的那些前序列。
重组载体还可以包含促进载体整合到宿主染色体DNA中以获得稳定表达和/或促进靶向宿主基因组中特定位置的序列。
术语“成熟”是指去除信号序列(前肽)的丝氨酸蛋白酶形式和前肽包含酶促或催化活性必需氨基酸。在丝状真菌中，它是分泌到培养基中的天然形式。成熟序列的第一个氨基酸可以通过分泌蛋白酶的N-端测序确定。如果没有可用的生化数据，可以通过将氨基酸序列与同源蛋白质的成熟氨基酸序列进行比对来估计N-端的位置。比对可以使用例如ClustalW2比对进行(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。
为了改善畸枝霉属丝氨酸蛋白酶在各种工业应用中的性能，例如在去污剂中，需要改善天然酶的性质。这些性质包括例如储存稳定性、存在或不存在去污剂下的稳定性、pH稳定性、氧化稳定性或对漂白剂的耐受性和底物特异性。酶的自体蛋白水解活性对储存稳定性有影响，应尽可能低。不言而喻的是，例如在洗衣和餐具洗涤组合物中，与亲本或前体蛋白酶相比，修饰的蛋白酶的洗涤性能不应受到损害。换言之，与亲本丝氨酸蛋白酶相比，期望酶变体具有相似或甚至改进的洗涤性能和去污特性。
产生的丝氨酸蛋白酶变体可以通过使用酶化学的常规方法纯化，例如盐制备、超滤、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤和疏水作用层析。纯化可以通过蛋白质测定、酶活性分析和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来监测。可以测定纯化酶在各种温度和pH值下的酶活性和稳定性以及分子量和等电点。
蛋白酶活性通常基于可溶性底物的降解。在去污剂应用中，蛋白酶必须作用于至少部分不溶的物质。因此，去污剂蛋白酶的一个重要参数是吸附到和水解这些不溶性片段的能力。
在去污剂存在下，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶变体在如上定义的温度下起作用，特别是，所述真菌丝氨酸蛋白酶变体在去污剂存在下具有良好的性能。来自畸枝霉属的真菌丝氨酸蛋白酶变体在不同测试条件下，对不同污渍，以ΔL*测量的去污性能优于野生型畸枝霉属蛋白酶的性能。
根据本发明的一个优选实施方案，每个所述重组真菌丝氨酸蛋白酶变体是具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:2中限定的成熟畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的氨基酸序列至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在位置103或在位置105或在位置103和105处的氨基酸取代。根据更优选的实施方案，位置103处的取代为Q103D，位置105处的取代为S105E。根据更优选的实施方案，位置103处的取代是Q103D，位置105处的取代是S105E。
根据本发明的一个优选实施方案，重组丝氨酸蛋白酶包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E。优选地，所述重组丝氨酸蛋白酶具有改进的去污性能。
根据本发明的一个优选实施方案，重组丝氨酸蛋白酶包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D，且具有改进的去污性能。
根据本发明的一个优选实施方案，重组丝氨酸蛋白酶包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置105的氨基酸E，且具有改进的去污性能。
优选地，蛋白酶变体多肽包含与SEQ ID NO:2中限定的成熟畸枝霉属ALK04122蛋白酶的酸序列的氨基酸序列具有至少约70％，并且越来越优选地达到至少约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约90.5％、约91％、约91.5％、约92％、约92.5％、约93％、约93.5％、约94％、约94.5％、约95％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％和约99％的同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一个优选实施方案，重组丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少82％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E。优选地，所述重组丝氨酸蛋白酶具有改进的去污性能。
根据本发明的一个优选实施方案，重组丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少82％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D，且具有改进的去污性能。
根据本发明的一个优选实施方案，重组丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少82％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置105的氨基酸E，且具有改进的去污性能。
术语“同一性”在本文中是指在具有大约相同氨基酸量的相应序列区域内相互比较的两个氨基酸序列之间的同一性。例如，可以比较两个氨基酸序列的成熟序列的同一性。待比较的两个分子的氨基酸序列可能在一个或更多个位置上不同，但这不会改变分子的生物学功能或结构。这种变异可能在不同的生物体中自然发生，或者由于氨基酸序列的突变，或者它们可以通过特定的诱变实现。变异可能由氨基酸序列中一个或多个位置的缺失、取代或***引起。通过使用带有默认设置(蛋白质权重矩阵：Gonnet，缝隙(Gap open)：10，间隙扩展：0.20，间隙距离5)的ClustalW2比对(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)来测量序列的同一性。
丝氨酸蛋白酶，适当地本发明的真菌丝氨酸蛋白酶具有“在去污剂存在下的良好性能”，即能够在去污剂存在下在较宽的温度范围内，特别是在低于目前商业化的枯草杆菌蛋白酶产品的温度范围内，降解或去除蛋白质污渍或材料。在去污剂的存在下，本发明的酶在5℃至60℃之间很好地发挥作用。
本发明的一个优选实施方案是通过分离的核酸分子编码的真菌丝氨酸蛋白酶，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7。
本发明的一个实施方案是通过包含核酸分子的重组表达载体产生的丝氨酸蛋白酶，所述核酸分子编码如上表征的真菌丝氨酸蛋白酶变体，如上所述的，与能够指引所述丝氨酸蛋白酶在合适宿主中表达和分泌的调控序列可操作地连接。EP2691520B1中更详细地描述了所述重组表达载体的构建和所述载体的用途。
本发明还涉及一种分离的核酸分子，其包含编码选自以下组的丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列：
(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQID NO:8中描述的氨基酸序列的核酸分子；和
(b)编码如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中描述的具有突变CAG->GAC或GAT和/或TCA->GAG或GAA(在位置307-309和/或位置313-315)的成熟畸枝霉属ALK04122蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明的核酸分子可以是DNA或RNA，其中DNA可以构成基因组DNA或cDNA或合成DNA。RNA可构成天然RNA或合成RNA。
因此，分离的多核苷酸序列或分离的核酸分子在本发明的范围内，其编码真菌丝氨酸蛋白酶变体或多肽，真菌丝氨酸蛋白酶变体或多肽包含在位置103和/或位置105具有氨基酸取代的SEQ ID NO：2中描述的畸枝霉属ALK04122酶的成熟形式的氨基酸序列。
本发明还涉及重组表达载体或重组表达构建，其可用于在合适的原核或真核宿主中增殖或表达编码所选丝氨酸蛋白酶变体的核酸序列。重组表达载体包含促进或指引编码序列的丝氨酸蛋白酶在合适宿主中表达和分泌的DNA或核酸序列，例如启动子、增强子、终止子(包括转录和转移终止信号)以及可操作连接到编码所述丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的信号和原序列。表达载体可以进一步包含用于选择转化株的标记基因，或者选择标记可以通过共转化引入到另一个载体构建中的宿主。所述调控序列可以与生产生物体同源或异源，或者它们可以源自分离出编码丝氨酸蛋白酶的基因的生物体。
用于在丝状真菌宿主中表达本发明的丝氨酸蛋白酶的启动子的实例是里氏木霉天然蛋白质的启动子，例如纤维二糖水解酶1、米曲霉TAKA淀粉酶、碱性蛋白酶ALP和磷酸丙糖异构酶、米黑根霉(Rhizopus miehei)脂肪酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、尖镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶和鲁克文金孢子菌纤维二糖水解酶1启动子。
在酵母中，例如啤酒酵母菌烯醇酶(ENO-1)、半乳糖激酶(GAL1)、醇脱氢酶(ADH2)和3-磷酸甘油酸激酶的启动子可用于提供表达。
用于指引本发明丝氨酸蛋白酶在细菌宿主中转录的启动子序列的实例是大肠杆菌的lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶dag A启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(arnyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。
合适的终止子包括上述基因的终止子或任何其他表征的终止子序列。
合适的转化或选择标记包括赋予转化体可选择特性的那些标记，例如曲霉菌amdS(Aspergillus amdS)或补充宿主中的缺陷，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的曲霉菌niaD或dal基因。选择还可以基于赋予抗生素抗性的标记，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、腐草霉素或潮霉素抗性(hygromycin resistance)。
本发明还涉及包含上述重组表达载体的宿主细胞。用于生产真菌丝氨酸蛋白酶的合适宿主是同源或异源宿主，例如微生物宿主，包括真菌、酵母和细菌。植物或哺乳动物细胞中的生产***也是可行的。
合适的表达和生产宿主***是例如为丝状真菌宿主研发的生产***，该宿主选自粪壳菌纲，肉座菌亚纲，肉座菌目和囊菌目，曲霉菌属、金孢子菌属、毁丝霉属和腐质霉属；更优选地肉座菌科、赤壳菌科、麦角菌科、微囊菌科和木霉属(无性型肉座菌)、镰孢菌属、赤霉属、丛赤壳属、葡萄穗霉属、麦角菌属、绿僵菌属、稻曲菌属、线虫草属、头孢菌属和足放线病菌属；更优选地选自里氏木霉(红褐肉座菌)、桔绿木霉、长枝木霉、绿木霉、哈茨木霉、棘孢木霉、深绿木霉、近里氏木霉、尖镰孢菌、禾谷镰孢菌、假禾谷镰孢菌、镶片镰孢菌、藤仓赤霉菌、串珠赤霉菌、玉蜀黍赤霉菌、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳属)、纸葡萄穗霉、葡萄穗霉属、黑麦麦角菌、黄绿绿僵菌、金龟子绿僵菌、稻绿核菌、冬虫夏草、顶头孢霉、尖端足放线病菌、黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、鲁克文金孢子菌、嗜热毁丝霉、特异腐质霉和灰腐质霉；最优选是里氏木霉。生产***的非限制性实例为酵母(例如，啤酒酵母菌、毕赤酵母菌、耶氏解脂酵母菌)和细菌细胞，优选革兰氏阳性杆菌(例如，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢)、革兰阴性菌(如大肠杆菌)和放线菌(如链霉菌)。
本发明还涉及生产具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括在合适的条件下培养携带用于本发明丝氨酸蛋白酶变体的重组表达载体的天然或重组宿主细胞和任选分离所述酶。生产培养基是适合培养宿主生物体的培养基，并且可以含有用于有效表达的诱导剂。合适的介质在文献中是众所周知的。
本发明涉及具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽通过本发明的核酸分子编码并可通过上述方法获得。
本发明进一步涉及获得包含具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的酶制剂的方法，所述方法包括培养携带本发明的表达载体的宿主细胞和从细胞中回收多肽或从培养基中分离细胞并获得具有丝氨酸蛋白酶活性的上清液的步骤。
本发明还涉及一种酶制剂，其包含如上所述的一种丝氨酸蛋白酶变体或多种丝氨酸蛋白酶变体。酶制剂或组合物具有丝氨酸蛋白酶活性并且可通过根据本发明的方法获得。
包含本发明的一种丝氨酸蛋白酶变体或多种丝氨酸蛋白酶变体的酶制剂以及组合物也在本发明范围内。
含有本发明的一种蛋白酶变体或多种蛋白酶变体的酶制剂或组合物(例如去污剂制剂)可以进一步包含选自蛋白酶(不同于本发明的蛋白酶的其他蛋白酶)、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、角质酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、***糖酶、半乳聚糖酶、黄原酶、木葡聚糖酶、DNA酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和氧化酶，例如漆酶或过氧化物酶的有或没有介质的其他酶。预计这些酶将增强本发明的丝氨酸蛋白酶的性能，例如，通过去除待处理材料中存在的碳水化合物和油或脂肪。所述酶可以是由宿主菌株产生的天然或重组酶，或者可以在生产过程之后添加到培养物上清液或制剂或组合物中。
所述酶制剂或组合物还可以包含一种或多种选自表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelators)或螯合剂(chelating agents)、漂白体系或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、染料、香料、淡褐色的抑制剂(tannish inhibitor)、光增白剂(opticalbrighteners)、杀菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐剂(anticorrosion agents)、助水溶剂、织物调色剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂(fluorescent whitening agents)、去污聚合物(soil release polymers)、抗再沉积剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、香料、颜料、缓冲剂、防腐剂(preservatives)、草皮抑制剂、溶剂和液体去污剂的结构剂、结构弹性剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧剂和增溶剂的合适的添加剂。
表面活性剂可用于乳化油脂和润湿表面。表面活性剂可以是包括半极性的非离子和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子。可以将缓冲剂添加到酶制剂或组合物中以改变pH值或影响其他成分的性能或稳定性。合适的稳定剂包括多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、山梨糖醇或己二醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物、甲酸、芳族硼酸酯、苯基硼酸衍生物、肽、其他可逆枯草杆菌蛋白酶抑制剂或其组合。
漂白剂用于氧化和降解有机化合物。合适的化学漂白体系的实例是H2O2源，例如过硼酸盐或过碳酸盐，有或没有形成过氧酸的漂白活化剂，例如四乙酰乙二胺或替换的过氧酸，例如酰胺、酰亚胺或砜类。化学氧化剂可以通过使用氧化酶如漆酶或过氧化物酶而被部分或完全替代。许多漆酶在没有介质的情况下不能有效发挥作用。
助洗剂或络合剂包括沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等物质。酶制剂还可包含一种或多种聚合物，例如羧甲基纤维素、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)等。此外，还可以添加软化剂、腐蚀剂、防止其他成分变质的防腐剂、研磨剂和改变发泡和粘度特性的物质。
根据本发明的一个优选实施方案，包含所述酶变体的所述酶制剂或组合物是液体组合物或固体组合物的形式，例如溶液、分散体、糊剂、粉剂、粒剂、颗粒剂、包衣颗粒剂、片剂、糕剂、晶体、晶体浆液、凝胶或丸剂。根据本发明的一个优选实施方案，所述组合物是液体去污剂或固体去污剂，优选为条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或更多个隔室的袋、常规致密粉剂、粒剂、颗粒剂、糊剂、凝胶，或常规、致密或浓缩液体。此外，制剂或组合物中的酶变体可以是固定化酶的形式。
本发明的丝氨酸蛋白酶可以像其他蛋白酶，特别是碱性蛋白酶，用于去污剂、蛋白质、酿造、肉类、照相、皮革、乳制品和制药工业(Kalisz，1988；Rao等人，1998)。例如，它可用作将纤维状蛋白质废物(例如角、羽毛、指甲和头发)转化为有用的生物质、蛋白质浓缩物或氨基酸的化学品的替代品(Anwar和Saleemuddin，1998年)。使用本发明的丝氨酸蛋白酶可以像其他蛋白酶一样证明在改善皮革质量和减少环境污染和节约能源方面是成功的，并且它可以用于肽的合成和D，L-氨基酸混合物的拆分。枯草杆菌蛋白酶与广谱抗生素联合治疗烧伤和伤口是丝氨酸蛋白酶在制药工业中使用的一个例子，因此本发明的真菌丝氨酸蛋白酶也可以认为具有这样的用途，也可以适用于去除手术设备上的血液和清洁隐形眼镜或假牙。与来自蝇疫霉病病原菌为冠状虫霉(Conidiobolus coronatus)的碱性蛋白酶一样，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶变体可用于替代动物细胞培养物中的胰蛋白酶。本发明的蛋白酶还可用于清洁膜和破坏生物膜。在烘焙中，可以使用蛋白酶，例如在破坏面筋网络和水解食品蛋白质中的其他食品应用，例如牛奶中的蛋白质。它们也可以用于例如在处理酵母、提炼(从动物骨头中提取更多蛋白质)、创造新风味、减少苦味、改变乳化特性、产生生物活性肽和减少蛋白质的过敏性。底物包括动物、植物和微生物蛋白质。
去污剂行业，尤其是洗衣粉行业，已成为在高pH范围内具有活性的蛋白酶的单一主要消费者(Anwar和Saleemuddin，1998年)。理想的去污剂蛋白酶应具有广泛的底物特异性，以促进去除食物、草、血液和其他身体分泌物造成的各种污渍。它必须在去污剂溶液的pH值和离子强度、洗涤温度和pH值下具有活性，并且能够耐受机械处理以及添加到去污剂中的螯合剂和氧化剂。由于节能意识，目前希望在较低温度下使用蛋白酶。
本发明还涉及丝氨酸蛋白酶变体或酶变体制剂用于去污剂、处理纺织纤维、用于处理蛋白质材料如羊毛、头发、丝绸、皮革，用于处理饲料或食物，或用于任何涉及蛋白质材料的修饰、降解或去除的应用。
因此，本发明的一个优选实施方案是如上所述的丝氨酸蛋白酶变体作为可用于衣物去污剂和餐具洗涤组合物，包括自动餐具洗涤组合物的去污剂添加剂的用途。
表述“去污剂”用于表示旨在帮助清洁或具有清洁性能的物质或材料。术语“去污力”表示清洁性能的存在或程度。清洁性能的程度可以在不同的蛋白质或含蛋白质的基材材料或污渍或污渍混合物上测试，这些物质与固体、水不溶性载体如纺织纤维或玻璃结合。典型的蛋白质材料包括血液、牛奶、墨水、蛋、草和酱汁。出于测试目的，多种蛋白质染色剂可商购获得。去污剂酶的作用是降解和去除含蛋白质的污渍。测试结果取决于污渍的类型、去污剂的组成以及洗涤测试中使用的纺织品的性质和状态(Maurer，2004)。
在本发明中，术语“去污剂稳定性”是指酶或酶变体在储存和/或洗涤过程中在去污剂溶液中充分保持其活性。因此，在去污剂存在的情况下，可以有效地降解或去除污渍或材料。稳定性可以通过测定残留活性来分析，例如在去污剂中培养数天(37℃)后。稳定性可以通过各种酶的比活性测量或通过应用测试作为洗涤性能来测量。
术语丝氨酸蛋白酶的“有效量”是指在特定去污剂组合物中实现酶活性所必需的蛋白酶的量。优选地，以去污剂组合物的重量计，本发明的去污剂组合物包含约0.0001％至约10％的本发明蛋白酶变体(作为酶蛋白)，更优选地0.001％至约1％，还更优选地0.001％至约0.5％。
通常，蛋白酶的洗涤性能被测量为“去污效率”或“去污效果”或“清洁性能的程度”，意思是可见和可测量的增加的亮度或染色材料的颜色变化，例如，在人工弄脏的样本或测试布中。可以测量亮度或颜色值的变化，例如通过使用分光光度计由L*a*b*颜色空间坐标测量颜色作为反射值。表示蛋白酶性能(去污效果或效率)的蛋白质污渍的褪色或去除例如计算为ΔL*，其表示经酶处理的织物的亮度值L*减去用不含酶的洗涤液处理的织物的亮度值L*(酶空白或对照)。去污剂的存在可以提高酶去除污渍的性能。本发明的丝氨酸蛋白酶降解各种蛋白质污渍(可可(E-112)、血/牛奶/墨水、Co+PES(E-117)、血/牛奶/墨水、Co(E-116)、草(E-164，含颜料的全蛋(CS-37)，含颜料的蛋黄(CS-38)，巧克力牛奶烟灰(C-03)和花生油，牛奶(C-10))在碱性条件下存在去污剂(实施例2)。
本发明的目的是提供与市售酶和野生型畸枝霉属蛋白酶相比具有更好去污性能(例如血-牛奶-墨水、含颜料的全蛋和含颜料的蛋黄)的新的畸枝霉属蛋白酶变体，而酶变体的稳定性与野生型畸枝霉属蛋白酶一样好或更好。此外，本发明的这些变体对其他酶如纤维素酶更温和或更不具有侵蚀性，如实施例3的图8和图9所示。
除了洗涤之外，本发明的酶变体在储存过程中，即使储存在液体去污剂中，如畸枝霉属ALK04122蛋白酶(数据未显示)，也充分保留了它们的活性。
根据本发明的优选实施方案，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶变体可用于去污剂液体和去污剂粉剂。本发明的酶制剂的酶变体可以配制用于手洗或机洗，或者可以配制用于硬表面清洁或手洗或机洗餐具操作。
本发明的一个方面是一种重组丝氨酸蛋白酶，其包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E。本发明的一个优选方面是重组丝氨酸蛋白酶，其中，在根据SEQ ID NO：2的编号中，所述多肽具有至少一个选自Q103D和S105E的氨基酸取代。根据本发明更优选的方面，重组丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列之一。
一种分离的核酸分子，其包含编码选自以下组的丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列：(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列的核酸分子；和(b)包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中描述的核苷酸序列的编码序列的核酸分子，也是本发明的一个方面。
本发明的另一方面是重组表达载体，其包含编码丝氨酸蛋白酶的分离核酸，所述丝氨酸蛋白酶选自：(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含如SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列的核酸分子；和(b)包含如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:7中描述的核苷酸序列的编码序列的核酸分子，所述核酸与能够指引所述丝氨酸蛋白酶在合适宿主中表达的序列可操作地连接。此外，本发明的一个方面提供了一种酶制剂，其包含重组丝氨酸蛋白酶。本发明的一个优选方面是酶制剂，其包含选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、***糖酶、半乳聚糖酶、黄原酶、木葡聚糖酶、DNA酶和氧化酶的、有或没有介质的其他酶。本发明的另一个优选方面是包含一种或更多种选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、助洗剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂(anti-corrosion agents)、抗再沉积剂、腐蚀剂(caustics)、研磨剂、光增白剂、染料、香料、颜料和防腐剂(preservatives)的添加剂。根据一个优选的实施方案，酶制剂为液体组合物或固体组合物的形式，例如为溶液、分散体、糊剂、粉剂、粒剂、颗粒剂、包衣颗粒剂、片剂、糕剂、晶体、晶体浆液、凝胶或丸剂。
本发明的一个方面是包含本发明的重组表达载体的宿主细胞。优选地，宿主是微生物宿主。更优选地，所述宿主为丝状真菌。甚至更优选地，所述宿主属于木霉属、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、金孢子菌属、脉孢菌属(Neurospora)、根霉属(Rhizopus)、青霉属(Penicillium)、毁丝霉属和被孢霉属(Mortierella)。最优选地，所述宿主是里氏木霉。
本发明的一个方面是一种生产蛋白酶的方法，该方法包括步骤：将氨基酸取代Q103D和/或S105E引入序列中，所述序列包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。本发明的一个优选方面是生产蛋白酶的方法，其中所述方法还包括步骤：培养所述宿主细胞并回收酶。
根据一个优选的实施方案，本发明的重组丝氨酸蛋白酶或酶制剂可用于去污剂、用于处理纤维、用于处理蛋白质材料、用于处理食品或饲料、或用于涉及蛋白质材料的改性、降解或去除的应用。优选的实施方案是将本发明的重组丝氨酸蛋白酶或酶制剂作为去污剂添加剂的用途。另一个优选的实施方案是重组丝氨酸蛋白酶或酶制剂在液体去污剂或固体去污剂中的用途，优选为条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或更多个隔室的袋、常规或致密粉剂、粒剂、颗粒剂、糊剂、凝胶，或常规、致密或浓缩液体的形式。
一种去污剂组合物，其特征在于，所述组合物包含表面活性剂、本发明的重组丝氨酸蛋白酶或酶制剂，以及选自稳定剂、缓冲剂、助洗剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、光增白剂、染料、香料、颜料和防腐剂的添加剂，也是本发明的优选方面。所述去污剂组合物包含选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、***聚糖酶、半乳聚糖酶、黄原酶、木葡聚糖酶、DNA酶和氧化酶的有或没有介质的其他酶，也是本发明的又一个方面。
本发明的一个方面是一种重组丝氨酸蛋白酶，其包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E。本发明的一个优选方面是重组丝氨酸蛋白酶，其包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E，其中，在根据SEQ ID NO：2的编号中，所述多肽具有至少一个选自Q103D和S105E的氨基酸取代。本发明又更优选的方面是重组丝氨酸蛋白酶，其包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E，其中，其氨基酸序列对应于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8中描述的氨基酸序列之一。
一种分离的核酸分子也是本发明的一个方面，其包含编码选自以下组的丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列：
(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列的核酸分子；和
(b)包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中描述的核苷酸序列的编码序列的核酸分子。
此外，一种包含分离核酸的重组表达载体是本发明的一个方面，所述分离核酸包含编码选自以下组的丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列：(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列的核酸分子；和(b)包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中描述的核苷酸序列的编码序列的核酸分子，所述核酸与能够指引所述丝氨酸蛋白酶在合适宿主中表达的调控序列可操作地连接。
一种包含重组表达载体的宿主细胞是本发明的一个方面，所述重组表达载体包含分离核酸，所述分离核酸包含编码选自以下组的丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列：(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列的核酸分子；和(b)包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中描述的核苷酸序列的编码序列的核酸分子，所述核酸与能够指引所述丝氨酸蛋白酶在合适宿主中表达的调控序列可操作地连接。根据本发明更优选的方面，宿主细胞是微生物宿主细胞。根据本发明甚至更优选的方面，宿主细胞为丝状真菌。宿主为木霉属、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、金孢子菌属、脉孢菌属、根霉属、青霉属、毁丝霉属和被孢霉属是本发明的甚至更优选的方面。根据本发明最优选的方面，宿主细胞是里氏木霉。
本发明的一个方面是生产蛋白酶的方法，该方法包括将氨基酸取代Q103D和/或S105E引入序列中的步骤，所述序列包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。
根据更优选的方面，生产蛋白酶的方法进一步包括培养包含重组表达载体的宿主细胞并回收酶的步骤，所述重组表达载体包含分离核酸，所述分离核酸包含编码选自以下组的丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列：(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列的核酸分子；和(b)包含如SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中描述的核苷酸序列的编码序列的核酸分子，所述核酸与能够指引所述丝氨酸蛋白酶在合适宿主中表达的调控序列可操作地连接。
一种酶制剂，其包含重组丝氨酸蛋白酶，所述重组丝氨酸蛋白酶包含与SEQ IDNO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E。根据本发明更优选的方面，酶制剂包含选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、***糖酶、半乳聚糖酶、黄原酶、木葡聚糖酶、DNA酶和氧化酶的有或没有介质的其他酶。
根据本发明甚至更优选的方面，酶制剂包含一种或多种选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、助洗剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、光增白剂、染料、香料、颜料和防腐剂的添加剂。根据本发明最优选的方面，酶制剂为液体组合物或固体组合物的形式，例如为溶液、分散体、糊剂、粉剂、粒剂、颗粒剂、包衣颗粒剂、片剂、糕剂、晶体、晶体浆液、凝胶或丸剂。
本发明的一个方面是重组丝氨酸蛋白酶或酶制剂在用于去污剂、用于处理纤维、用于处理蛋白质材料、用于处理食品或饲料、或用于涉及蛋白质材料的改性、降解或去除的应用中的用途，所述重组丝氨酸蛋白酶包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E；所述酶制剂包含重组丝氨酸蛋白酶，所述重组丝氨酸蛋白酶包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E。
根据本发明的一个优选方面，蛋白质材料选自羊毛、毛发、皮革和丝绸。根据本发明甚至更优选的方面，酶制剂用作去污剂添加剂。根据本发明最优选的方面，重组丝氨酸蛋白酶或酶制剂在液体去污剂或固体去污剂中的用途，优选为条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或更多个隔室的袋、常规或致密粉剂、粒剂、颗粒剂、糊剂、凝胶，或常规、致密或浓缩液体。
此外，一种去污剂组合物是本发明的一个方面，包含表面活性剂、重组丝氨酸蛋白酶或酶制剂，以及添加剂。所述重组丝氨酸蛋白酶包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E。所述酶制剂制包含重组丝氨酸蛋白酶，所述重组丝氨酸蛋白酶包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E。所述添加剂选自稳定剂、缓冲剂、助洗剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、光增白剂、染料、香料、颜料和防腐剂。
本发明的另一方面是去污剂组合物，其包含选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、***聚糖酶、半乳聚糖酶、黄原酶、木葡聚糖酶、DNA酶和氧化酶的有或没有介质的其他酶。
作为结论，提供了新的真菌丝氨酸蛋白酶变体，其源自嗜热微生物，并且在液体去污剂组合物中相容且稳定，并且对其他酶的侵蚀性较小，因此需要较少的稳定剂和其他添加剂。
本发明通过与本发明的一些实施方案相关的以下实施例来说明；然而，本发明并不意味着仅限于这些实施例。
实施例
实施例1.里氏木霉中畸枝霉属蛋白酶变体的设计和生产
基于成熟野生型畸枝霉属ALK04122蛋白酶的氨基酸序列，设计了三个畸枝霉属蛋白酶变体，命名为M59(Q103D)、M60(S105E)和M61(Q103D；S105E)(表1)，这里称为M0(编码成熟畸枝霉属ALK04122蛋白酶SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核酸序列，推导的氨基酸序列SEQID NO：2)。合成变体基因，每个变体基因包括天然信号和原序列编码畸枝霉属ALK04122蛋白酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：9；图1)，和变体成熟编码序列(参见表1的SEQ ID编号)订购自GenScript。合成基因在其5'-和3'-末端还包括能够与cbhl启动子(SacII位点包含在cbh1启动子和从SacII到启动子末端的cbh1启动子序列中)和cbhl终止子(序列在终止子中的cbh1终止密码子到AgeI位点和AgeI位点之后)正确融合的里氏木霉序列。有关里氏木霉基因组序列和基因组织，请参阅https://genome.jgi.doe.gov/Trire2/ Trire2.home.html。利用标准分子生物学方法将合成基因连接到SacII-AgeI消化表达载体上，从商业GenScript载体上切割合成基因，并构建表达盒以产生重组蛋白酶变体(图2，表1)。在最终的表达盒中，编码全长蛋白酶变体的合成基因与里氏木霉cbhl(cel7A)启动子和终止子融合(精确融合)，与Paloheimo等人(2003)描述的构建类似。编码构巢曲霉氨酰胺酶(AmdS)的合成amdS基因被用作表达盒中的转化标记物(图2)。
表格1.用于在里氏木霉中生产畸枝霉属蛋白酶变体的表达盒的构建的设计和使用的合成基因的信息。在无信号和pro-序列下，编码核苷酸序列、成熟氨基酸序列和突变氨基酸位置的成熟蛋白酶的SEQ ID编号与成熟畸枝霉属蛋白酶氨基酸序列对应(SEQ ID NO:2)。选择D和E的三联密码子，D和E更常被里氏木霉使用的两种可能选项(GAC和GAT用于D，GAA和GAG用于E)。
Figure BDA0003112775170000251
表达盒pALK4521、pALK4522和pALK4523(图2)通过NotI消化从表达质粒的载体骨架中被分离出来，并用于转化里氏木霉宿主菌株。使用Karhunen等人(1993)描述的改性，根据Penttila等人(1987)进行对里氏木霉原生质体的转化。在含有乙酰胺作为唯一氮源的平板上选择转化体。来自每个转化的一组转化体在选择平板上通过单个分生孢子纯化，然后在马铃薯葡萄糖(PD)琼脂上使其形成孢子。
为了生产蛋白酶，在250ml的锥形瓶中，将转化体从PD斜面接种到250ml执行烧瓶中的50ml复合乳糖基纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等人，1993)中，该培养基pH为6.0，由5％KH2PO4缓冲。未转化的宿主菌株和先前构建的产生重组野生型畸枝霉属蛋白酶(M0)的转化株用作培养中的参照。在30℃、250rpm下培养5天后，分析培养物上清液中转化体的蛋白酶产量。
所有三种突变蛋白酶都由里氏木霉很好地产生。在SDS-PAGE凝胶中，从用过的培养物上清液中检测到一条大约30kDa的主要蛋白质带，其与重组蛋白酶的预期分子量相对应。如专利EP2691520B1中所述，使用酪蛋白作为底物分析蛋白酶活性，使用该分子的优化的吸光度范围0,1-0,5(目标0,3-0,35)。一个蛋白酶单位(BPU)相当于酶活性的量，在标准条件下，它在1分钟内从酪蛋白中释放出相当于1μg酪氨酸的肽片段的量。相应的蛋白酶活性是从pALK4521、pALK4522和pALK4523转化体获得的，如同从产生重组野生型畸枝霉属蛋白酶的参照转化体一样。
在实验室规模的生物反应器中培养在摇瓶培养中产生最佳蛋白酶活性的里氏木霉转化体。在培养中使用纤维素酶诱导复合培养基。从摇瓶或生物反应器培养物中获得的用过的培养基用于应用测试(实施例2-3)。
实施例2.畸枝霉属ALKO 4122蛋白酶变体在液体去污剂中的去污性能
测试在木霉属中产生的畸枝霉属蛋白酶变体的摇瓶培养样品(如实施例1中所述)在40℃和16°dH的水硬度下用商业液体去污剂去除蛋白酶敏感标准污渍的能力，并与亲本分子M0进行比较。使用来自试验材料BV中心(荷兰)的以下人工弄脏的试验布：可可(E-112)、血/牛奶/墨水、Co+PES(El17)、血/牛奶/墨水、Co(El16)、草(El64、含颜料的全蛋(CS-37)、含颜料的蛋黄(CS-38)、巧克力牛奶烟灰(C-03)和花生油、牛奶(C-10)。将织物切成6厘米×6厘米的样片。使用不含酶的商业液体去污剂的基料，其浓度为每升洗涤液5g，洗涤液的pH约为8.2。如实施例1中所述，蛋白酶以与μg酪氨酸/分钟/ml洗涤液相关的酶活性单位(BPU)给药。对照样品含有去污剂溶液但不含蛋白酶。
对于硬度为16°dH的合成自来水，使用去离子水(Milli-Q或等效物)制备以下储备溶液：
1000°d钙硬度的储备溶液：CaCl2 x 2H2O(1.02382.1000,Merck KGaA,德国)26.22g/l
200°d镁硬度的储备溶液：MgSO4 x 7H2O(1.05886.1000,Merck KGaA,德国)8.79g/l H2O
NaHCO3储备溶液：NaHCO3(1.06329.1000Merck KGaA,德国)29,6g/l
13,3ml CaCl2溶液、13.3ml MgSO4溶液和10.0ml新鲜制备的NaHCO3溶液按给定顺序加入至容量瓶中，用去离子水定容至1升并混合。通过络合滴定法测定水的硬度并查明正确。
在Atlas LP-2Launder-Ometer中进行如下去污处理。Launder-Ometer首先预热到40℃。然后将去污剂、250ml硬度为16°dH的合成自来水和稀释的酶(<1,0毫升)加入至1.2升容器中。添加污渍，并将Launder-Ometer在40℃下以42rpm的转速运行60min。污渍E-112、E-116、E-117和E-164一起放在同一个容器中，其余污渍放在另一个容器中。之后，将样本在流动水下小心地冲洗并在避光保护的网格上，在室内空气中干燥过夜。
通过使用Konica Minolta CM-3610A分光光度计由L*a*b*颜色空间坐标(光源D65/100，420nm切割)测量颜色作为反射值来评估去污效果。污渍褪色计算为ΔL*(deltaL*)，污渍褪色指示蛋白酶性能(污渍去除效率)，ΔL*为酶处理织物的亮度值L*减去用不含蛋白酶的洗涤液处理的织物(对照)的亮度值L*。最终结果(总去污效果)显示为每个污渍的ΔL*总和。
使用变体M60和M61的摇瓶上清液获得最佳去污效果(8个污渍的AL*总和)，如图3所示。与亲本分子M0相比，性能得到了惊人的改善，尤其是在血-牛奶-墨水和蛋渍上(图4和图5)。
还使用上述类似的测试***但具有更宽的剂量范围(0-12BPU/ml洗涤液)对来自中试培养的M60生产样样品(production like sample of M60)进行了测试，这样的剂量范围代表了商业蛋白酶的典型剂量范围(0,1-1％去污剂重量的酶产品)。M0生产样样品的结果证实，M60的去污性能明显优于亲本分子M0(图6)，尤其是血-牛奶-墨水(图7a和7B)和全蛋(图7C)以及蛋黄(图7D)污渍。
实施例3.蛋白酶变体在37℃下，对液体去污剂中商业纤维素酶的降解作用
基于它们在37℃下在液体去污剂中对商业纤维素酶的降解作用，对如实施例1所述的在木霉属中产生的M0变体的摇瓶培养上清液进行了测试。亲本分子M0用作参照。将对应于520BPU/g活性的量的蛋白酶添加到含有1％(w/w)市售可获得的纤维素酶
Figure BDA0003112775170000271
DCL(通过AB Enzymes)的液体筛去污剂中。如实施例1中所述的，测量蛋白酶活性。去污剂的组成如表2所示。带盖塑料管中的样品在37℃下培养7天。基本上如Bailey和Nevalainen，1981；Haakana人，2004年(NCU活性)所述纤维素酶活性是在50℃下，在50mMHEPES缓冲液中，pH 7.0，作为从羧甲基纤维素(3％CMC)中释放出的还原糖来测量的。结果计算为相对残留纤维素酶活性，其是通过将含有M61的样品在37℃培养后的残留活性除以含有母体分子M0的样品的残留活性而获得的。残留活性(％)通过将样品在37℃下培养后的活性除以样品的初始活性来计算。除了纤维素酶活性(NCU)外，还在7天后使用实施例1中描述的方法测量样品的残留蛋白酶活性(BPU)。
表2.液体去污剂配方的组成。
成分 ％
阴离子表面活性剂 10-20
非离子表面活性剂，肥皂 5–10
硼酸 ≤1
丙二醇 4-8％
乙醇 2-5％
pH 8.0-8.4
基于图8中显示的结果，与亲本分子M0相比(数据未显示)，在37℃下，液体去污剂中存在变体蛋白酶时，纤维素酶的稳定性得到改善，而蛋白酶活性没有显着变化。使用蛋白酶变体M60和M61的摇瓶培养样品获得了最佳的纤维素酶稳定性，当蛋白酶在去污剂中加入520BPU/g时，纤维素酶活性的稳定性提高了约1.4倍。
还使用如上所述的类似测试***但使用对应于每克去污剂2080BPU的大量的蛋白酶对来自中试培养的M60生产样样品进行稳定性测试。亲本分子M0用作参照。
用M60生产样样品获得的结果证实，与亲本分子M0(图9)相比，在7或14天内，在高的蛋白酶量的情况下，还有相当更多的纤维素酶活性(约1.8倍)，残留蛋白酶活性没有显着变化(数据未显示)。这些测试的结果表明，本发明的变体具有改进的洗涤性能(去污效果)，对纤维素酶的侵袭性更小。
参考文献
Anwar,A和M Saleemuddin.1998.碱性蛋白酶:综述.Bioresource Technology64:175-183.
Bailey M和Nevalainen H.1981.具有改善的增溶纤维素酶产量的稳定里氏木霉突变体的诱导、分离和测试.Enzyme Microb.Technol.3:153-1577.
Chen,Y-J和M Inouye，2008年.分子内分子伴侣介导的蛋白质折叠.Curr.Opin.Struct.Biol.18:765-770.
Cherry,J.R.和Fidantsef,A.L.2003.工业酶的定向进化:更新.Curr.Opin.Biotechnol.14:438-443.
Gaucher G M,Stevenson K J 2004.热霉素.蛋白水解酶手册第2版.1834-1835.
Gupta,R,QK Beg,S Khan和B Chauhan.2002.微生物碱性蛋白酶的发酵、下游加工和特性概述.Appl.Microbiol.Biotechnol.60:381-395.
Haakana H,Miettinen-Oinonen A,Joutsjoki V,
Figure BDA0003112775170000291
A,Suominen P和
Figure BDA0003112775170000292
J.2004.白果黑果(Melanocarpus albomyce)纤维素酶基因的克隆及其在里氏木霉中的有效表达.Enzyme Microb.Technol.34:159-167.
Joutsjoki,V.V.,T.K.Torkkeli,和K.M.H.Nevalainen.1993.用树脂木霉葡糖淀粉酶P(gamP)基因转化里氏木霉:里氏木霉生产异源葡糖淀粉酶.Curr.Genet.24:223-228.
Karhunen,T.,A.
Figure BDA0003112775170000293
K.M.H.Nevalainen,和P.L.Suominen.1993.里氏木霉I.内切葡聚糖酶I过度生产中的高频一步基因取代.Mol.Gen.Genet.241:515-522.
Kalisz,HM.1988.微生物蛋白酶.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.36:1-65.
Malardier L,MJ Daboussi,J Julien,F Roussel,C Scazzocchio和YBrygoo.1989.构巢曲霉硝酸还原酶基因(niaD)的克隆及其在尖镰孢菌转化中的应用.Gene78:147-156.
Maurer,K-H.2004.去污剂蛋白酶.Curr.Opin.Biotechnol.15:330-334.
Maurer,K-H,2010.酶，去污剂.pp.1-17.(MC Flickinger ed.)工业生物技术百科全书:生物过程、生物分离和细胞技术，John Wiley&Sons,Inc.
Ong PH和Gaucher GM,1975.真核胞外酶和嗜热真菌Malbranchea pulchella变体sulfurea的胞外丝氨酸蛋白酶嗜热菌酶的生产、纯化和表征.Can.J.Microbiol.22:165-175.
Paloheimo,M.,A.
Figure BDA0003112775170000294
J.Kallio,和P.Suominen.2003.在丝状真菌里氏木霉中高产地生产细菌木聚糖酶需要具有完整结构域结构的载体多肽.Appl.Env.Microbiol.69:7073-7082.
Figure BDA0003112775170000301
M,H Nevalainen,M
Figure BDA0003112775170000302
E Salminen,和J Knowles.1987.一种用于纤维素分解丝状真菌里氏木霉的多功能转化***.Gene 61:155-164.
Rao,MB,AM Tanksale,MS Ghatge和VV Deshpande.1998.微生物蛋白酶的分子和生物技术方面.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:597-635.
SEQUENCE LISTING
<110> AB Enzymes GmbH
<120> PROTEASE ENZYME VARIANTS AND USES THEREOF
<130> P2573PC00
<160> 10
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 1004
<212> DNA
<213> Malbranchea cinnamomea
<220>
<223> mature protease nucleotide sequence
<400> 1
gcattggtga cgcagagtaa tgcaccatcc tggggccttg gccgtatttc caaccgacag 60
gctggtattc gtgattacca ctacgatgac tccgccggtg aaggcgtcat cgtctatgat 120
gttgacaccg gcattgacat cagccatccg gatttcgagg gccgtgctat atggggttcc 180
aaccatgtcg accgcgttaa ccaggatcag aatggccatg ggacacacgt tgctggtact 240
attggtggaa gggcgtacgg agtcgccaag aaggccacaa tagtggctgt caaggttctc 300
gacgcccagg ggtcaggtac tatcagcggt attattgctg gtcttgactg gagtgtcaat 360
catgctcgac agaatggagt cactagaaga gcggctttga acatgagcct tggcggtggg 420
cgcagtatct ctttcaatca ggctgctgca agtgctgtcc aagccggatt gttcgtcgcg 480
gttgctgccg gaaatgaagg ggtaagtgac ttctttctgg cccctcctat ccgtacctgc 540
agaagctaac cagattgctc ttattttttt tcttttttca aaatatagca aaatgcaggt 600
aacacttccc cagcctcaga gccttctgtt tgcacagtag gggcaacctc atcgaatgat 660
gccgccacat cctggtccaa ctatggctca gttggtacgt agggctcggt tttatttatt 720
acttcttccc cacatgcgat cagaccggcc gctgactata tttagttgac gtttacgctc 780
ccggagacgc aattgtctct acctggcccg gtggcggttc caggtctctc tcaggcacat 840
cgatggcttc tccacacgtc gccggcctgg gtgcatacct catcgctctg gagggcatta 900
gcggaggcag tgtatgtgac cgtatcaaag agctggctca acctgtcgtc cagcctggtc 960
caggcaccac caaccgtctt atctacaacg gcagtggccg ctaa 1004
<210> 2
<211> 281
<212> PRT
<213> Malbranchea cinnamomea
<220>
<223> mature protease amino acid sequence
<400> 2
Ala Leu Val Thr Gln Ser Asn Ala Pro Ser Trp Gly Leu Gly Arg Ile
1 5 10 15
Ser Asn Arg Gln Ala Gly Ile Arg Asp Tyr His Tyr Asp Asp Ser Ala
20 25 30
Gly Glu Gly Val Ile Val Tyr Asp Val Asp Thr Gly Ile Asp Ile Ser
35 40 45
His Pro Asp Phe Glu Gly Arg Ala Ile Trp Gly Ser Asn His Val Asp
50 55 60
Arg Val Asn Gln Asp Gln Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr
65 70 75 80
Ile Gly Gly Arg Ala Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Thr Ile Val Ala
85 90 95
Val Lys Val Leu Asp Ala Gln Gly Ser Gly Thr Ile Ser Gly Ile Ile
100 105 110
Ala Gly Leu Asp Trp Ser Val Asn His Ala Arg Gln Asn Gly Val Thr
115 120 125
Arg Arg Ala Ala Leu Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Arg Ser Ile Ser
130 135 140
Phe Asn Gln Ala Ala Ala Ser Ala Val Gln Ala Gly Leu Phe Val Ala
145 150 155 160
Val Ala Ala Gly Asn Glu Gly Gln Asn Ala Gly Asn Thr Ser Pro Ala
165 170 175
Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Ser Ser Asn Asp Ala
180 185 190
Ala Thr Ser Trp Ser Asn Tyr Gly Ser Val Val Asp Val Tyr Ala Pro
195 200 205
Gly Asp Ala Ile Val Ser Thr Trp Pro Gly Gly Gly Ser Arg Ser Leu
210 215 220
Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Gly Ala Tyr
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Glu Gly Ile Ser Gly Gly Ser Val Cys Asp Arg Ile
245 250 255
Lys Glu Leu Ala Gln Pro Val Val Gln Pro Gly Pro Gly Thr Thr Asn
260 265 270
Arg Leu Ile Tyr Asn Gly Ser Gly Arg
275 280
<210> 3
<211> 1004
<212> DNA
<213> Malbranchea cinnamomea
<220>
<223> M59 mature nucleotide sequence
<220>
<221> misc_feature
<224> (309)..(309)
<225> r is t or c
<400> 3
gcattggtga cgcagagtaa tgcaccatcc tggggccttg gccgtatttc caaccgacag 60
gctggtattc gtgattacca ctacgatgac tccgccggtg aaggcgtcat cgtctatgat 120
gttgacaccg gcattgacat cagccatccg gatttcgagg gccgtgctat atggggttcc 180
aaccatgtcg accgcgttaa ccaggatcag aatggccatg ggacacacgt tgctggtact 240
attggtggaa gggcgtacgg agtcgccaag aaggccacaa tagtggctgt caaggttctc 300
gacgccgarg ggtcaggtac tatcagcggt attattgctg gtcttgactg gagtgtcaat 360
catgctcgac agaatggagt cactagaaga gcggctttga acatgagcct tggcggtggg 420
cgcagtatct ctttcaatca ggctgctgca agtgctgtcc aagccggatt gttcgtcgcg 480
gttgctgccg gaaatgaagg ggtaagtgac ttctttctgg cccctcctat ccgtacctgc 540
agaagctaac cagattgctc ttattttttt tcttttttca aaatatagca aaatgcaggt 600
aacacttccc cagcctcaga gccttctgtt tgcacagtag gggcaacctc atcgaatgat 660
gccgccacat cctggtccaa ctatggctca gttggtacgt agggctcggt tttatttatt 720
acttcttccc cacatgcgat cagaccggcc gctgactata tttagttgac gtttacgctc 780
ccggagacgc aattgtctct acctggcccg gtggcggttc caggtctctc tcaggcacat 840
cgatggcttc tccacacgtc gccggcctgg gtgcatacct catcgctctg gagggcatta 900
gcggaggcag tgtatgtgac cgtatcaaag agctggctca acctgtcgtc cagcctggtc 960
caggcaccac caaccgtctt atctacaacg gcagtggccg ctaa 1004
<210> 4
<211> 281
<212> PRT
<213> Malbranchea cinnamomea
<220>
<223> M59 mature amino acid sequence
<400> 4
Ala Leu Val Thr Gln Ser Asn Ala Pro Ser Trp Gly Leu Gly Arg Ile
1 5 10 15
Ser Asn Arg Gln Ala Gly Ile Arg Asp Tyr His Tyr Asp Asp Ser Ala
20 25 30
Gly Glu Gly Val Ile Val Tyr Asp Val Asp Thr Gly Ile Asp Ile Ser
35 40 45
His Pro Asp Phe Glu Gly Arg Ala Ile Trp Gly Ser Asn His Val Asp
50 55 60
Arg Val Asn Gln Asp Gln Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr
65 70 75 80
Ile Gly Gly Arg Ala Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Thr Ile Val Ala
85 90 95
Val Lys Val Leu Asp Ala Asp Gly Ser Gly Thr Ile Ser Gly Ile Ile
100 105 110
Ala Gly Leu Asp Trp Ser Val Asn His Ala Arg Gln Asn Gly Val Thr
115 120 125
Arg Arg Ala Ala Leu Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Arg Ser Ile Ser
130 135 140
Phe Asn Gln Ala Ala Ala Ser Ala Val Gln Ala Gly Leu Phe Val Ala
145 150 155 160
Val Ala Ala Gly Asn Glu Gly Gln Asn Ala Gly Asn Thr Ser Pro Ala
165 170 175
Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Ser Ser Asn Asp Ala
180 185 190
Ala Thr Ser Trp Ser Asn Tyr Gly Ser Val Val Asp Val Tyr Ala Pro
195 200 205
Gly Asp Ala Ile Val Ser Thr Trp Pro Gly Gly Gly Ser Arg Ser Leu
210 215 220
Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Gly Ala Tyr
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Glu Gly Ile Ser Gly Gly Ser Val Cys Asp Arg Ile
245 250 255
Lys Glu Leu Ala Gln Pro Val Val Gln Pro Gly Pro Gly Thr Thr Asn
260 265 270
Arg Leu Ile Tyr Asn Gly Ser Gly Arg
275 280
<210> 5
<211> 1004
<212> DNA
<213> Malbranchea cinnamomea
<220>
<223> M60 mature nucleotide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (315)..(315)
<223> y is g or a
<400> 5
gcattggtga cgcagagtaa tgcaccatcc tggggccttg gccgtatttc caaccgacag 60
gctggtattc gtgattacca ctacgatgac tccgccggtg aaggcgtcat cgtctatgat 120
gttgacaccg gcattgacat cagccatccg gatttcgagg gccgtgctat atggggttcc 180
aaccatgtcg accgcgttaa ccaggatcag aatggccatg ggacacacgt tgctggtact 240
attggtggaa gggcgtacgg agtcgccaag aaggccacaa tagtggctgt caaggttctc 300
gacgcccagg gggayggtac tatcagcggt attattgctg gtcttgactg gagtgtcaat 360
catgctcgac agaatggagt cactagaaga gcggctttga acatgagcct tggcggtggg 420
cgcagtatct ctttcaatca ggctgctgca agtgctgtcc aagccggatt gttcgtcgcg 480
gttgctgccg gaaatgaagg ggtaagtgac ttctttctgg cccctcctat ccgtacctgc 540
agaagctaac cagattgctc ttattttttt tcttttttca aaatatagca aaatgcaggt 600
aacacttccc cagcctcaga gccttctgtt tgcacagtag gggcaacctc atcgaatgat 660
gccgccacat cctggtccaa ctatggctca gttggtacgt agggctcggt tttatttatt 720
acttcttccc cacatgcgat cagaccggcc gctgactata tttagttgac gtttacgctc 780
ccggagacgc aattgtctct acctggcccg gtggcggttc caggtctctc tcaggcacat 840
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<210> 6
<211> 281
<212> PRT
<213> Malbranchea cinnamomea
<220>
<223> M60 mature amino acid sequence
<400> 6
Ala Leu Val Thr Gln Ser Asn Ala Pro Ser Trp Gly Leu Gly Arg Ile
1 5 10 15
Ser Asn Arg Gln Ala Gly Ile Arg Asp Tyr His Tyr Asp Asp Ser Ala
20 25 30
Gly Glu Gly Val Ile Val Tyr Asp Val Asp Thr Gly Ile Asp Ile Ser
35 40 45
His Pro Asp Phe Glu Gly Arg Ala Ile Trp Gly Ser Asn His Val Asp
50 55 60
Arg Val Asn Gln Asp Gln Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr
65 70 75 80
Ile Gly Gly Arg Ala Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Thr Ile Val Ala
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Val Lys Val Leu Asp Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ile Ser Gly Ile Ile
100 105 110
Ala Gly Leu Asp Trp Ser Val Asn His Ala Arg Gln Asn Gly Val Thr
115 120 125
Arg Arg Ala Ala Leu Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Arg Ser Ile Ser
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Phe Asn Gln Ala Ala Ala Ser Ala Val Gln Ala Gly Leu Phe Val Ala
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Val Ala Ala Gly Asn Glu Gly Gln Asn Ala Gly Asn Thr Ser Pro Ala
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Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Ser Ser Asn Asp Ala
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275 280
<210> 7
<211> 1004
<212> DNA
<213> Malbranchea cinnamomea
<220>
<223> M61 mature nucleotide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (309)..(309)
<223> r is t or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (315)..(315)
<223> y is g or a
<400> 7
gcattggtga cgcagagtaa tgcaccatcc tggggccttg gccgtatttc caaccgacag 60
gctggtattc gtgattacca ctacgatgac tccgccggtg aaggcgtcat cgtctatgat 120
gttgacaccg gcattgacat cagccatccg gatttcgagg gccgtgctat atggggttcc 180
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gacgccgarg gggayggtac tatcagcggt attattgctg gtcttgactg gagtgtcaat 360
catgctcgac agaatggagt cactagaaga gcggctttga acatgagcct tggcggtggg 420
cgcagtatct ctttcaatca ggctgctgca agtgctgtcc aagccggatt gttcgtcgcg 480
gttgctgccg gaaatgaagg ggtaagtgac ttctttctgg cccctcctat ccgtacctgc 540
agaagctaac cagattgctc ttattttttt tcttttttca aaatatagca aaatgcaggt 600
aacacttccc cagcctcaga gccttctgtt tgcacagtag gggcaacctc atcgaatgat 660
gccgccacat cctggtccaa ctatggctca gttggtacgt agggctcggt tttatttatt 720
acttcttccc cacatgcgat cagaccggcc gctgactata tttagttgac gtttacgctc 780
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<211> 281
<212> PRT
<213> Malbranchea cinnamomea
<220>
<223> M61 mature amino acid sequence
<400> 8
Ala Leu Val Thr Gln Ser Asn Ala Pro Ser Trp Gly Leu Gly Arg Ile
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Ala Gly Leu Asp Trp Ser Val Asn His Ala Arg Gln Asn Gly Val Thr
115 120 125
Arg Arg Ala Ala Leu Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Arg Ser Ile Ser
130 135 140
Phe Asn Gln Ala Ala Ala Ser Ala Val Gln Ala Gly Leu Phe Val Ala
145 150 155 160
Val Ala Ala Gly Asn Glu Gly Gln Asn Ala Gly Asn Thr Ser Pro Ala
165 170 175
Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Ser Ser Asn Asp Ala
180 185 190
Ala Thr Ser Trp Ser Asn Tyr Gly Ser Val Val Asp Val Tyr Ala Pro
195 200 205
Gly Asp Ala Ile Val Ser Thr Trp Pro Gly Gly Gly Ser Arg Ser Leu
210 215 220
Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Gly Ala Tyr
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Glu Gly Ile Ser Gly Gly Ser Val Cys Asp Arg Ile
245 250 255
Lys Glu Leu Ala Gln Pro Val Val Gln Pro Gly Pro Gly Thr Thr Asn
260 265 270
Arg Leu Ile Tyr Asn Gly Ser Gly Arg
275 280
<210> 9
<211> 1436
<212> DNA
<213> Malbranchea cinnamomea
<220>
<223> The nucleotide sequence encoding the full-length amino acid
sequence of Malbranchea ALKO4122 protease. The full-length gene
in included in plasmid pALK3094. The protease sequence cloned
from Malbranchea ALKO4178 by PCR was identical to this sequence.
<400> 9
atgggcgtct tcagcaaact cttgtatctg tcttttgcag tcacggcctc tgtcaatgcc 60
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gtcaaggttc tcgacgccca ggggtcaggt actatcagcg gtattattgc tggtcttgac 780
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cttggcggtg ggcgcagtat ctctttcaat caggctgctg caagtgctgt ccaagccgga 900
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gttttattta ttacttcttc cccacatgcg atcagaccgg ccgctgacta tatttagttg 1200
acgtttacgc tcccggagac gcaattgtct ctacctggcc cggtggcggt tccaggtctc 1260
tctcaggcac atcgatggct tctccacacg tcgccggcct gggtgcatac ctcatcgctc 1320
tggagggcat tagcggaggc agtgtatgtg accgtatcaa agagctggct caacctgtcg 1380
tccagcctgg tccaggcacc accaaccgtc ttatctacaa cggcagtggc cgctaa 1436
<210> 10
<211> 401
<212> PRT
<213> Malbranchea cinnamomea
<220>
<223> The full-length amino acid sequence of Malbranchea ALKO4122
protease including amino acids Met1 to Arg 401 of the full length
protease.
<400> 10
Met Gly Val Phe Ser Lys Leu Leu Tyr Leu Ser Phe Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ser Val Asn Ala Gly Glu Ile Leu Ser Val Ala Asn Lys Asp Ser Val
20 25 30
Ile Pro Asp Thr Tyr Ile Val Val Leu Lys Glu Gly Val Ser Thr Gln
35 40 45
Glu Phe Asn Ala His Lys Asn Trp Val Asn Glu Ile His Arg Thr Asn
50 55 60
Leu Thr Arg Arg Asp Leu Gly Phe Thr Gly Glu Leu Lys His Ser Tyr
65 70 75 80
Asp Phe Gly Gly His Gly Leu Lys Gly Tyr Ser Gly Lys Phe Asp Ala
85 90 95
Thr Ala Ile Gln Glu Ile Ala Asn Asp Pro Asn Val Ala Tyr Val Glu
100 105 110
Pro Asp Gln Glu Val Lys Leu Asp Ala Leu Val Thr Gln Ser Asn Ala
115 120 125
Pro Ser Trp Gly Leu Gly Arg Ile Ser Asn Arg Gln Ala Gly Ile Arg
130 135 140
Asp Tyr His Tyr Asp Asp Ser Ala Gly Glu Gly Val Ile Val Tyr Asp
145 150 155 160
Val Asp Thr Gly Ile Asp Ile Ser His Pro Asp Phe Glu Gly Arg Ala
165 170 175
Ile Trp Gly Ser Asn His Val Asp Arg Val Asn Gln Asp Gln Asn Gly
180 185 190
His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Gly Gly Arg Ala Tyr Gly Val
195 200 205
Ala Lys Lys Ala Thr Ile Val Ala Val Lys Val Leu Asp Ala Gln Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Ile Ser Gly Ile Ile Ala Gly Leu Asp Trp Ser Val Asn
225 230 235 240
His Ala Arg Gln Asn Gly Val Thr Arg Arg Ala Ala Leu Asn Met Ser
245 250 255
Leu Gly Gly Gly Arg Ser Ile Ser Phe Asn Gln Ala Ala Ala Ser Ala
260 265 270
Val Gln Ala Gly Leu Phe Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Glu Gly Gln
275 280 285
Asn Ala Gly Asn Thr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val
290 295 300
Gly Ala Thr Ser Ser Asn Asp Ala Ala Thr Ser Trp Ser Asn Tyr Gly
305 310 315 320
Ser Val Val Asp Val Tyr Ala Pro Gly Asp Ala Ile Val Ser Thr Trp
325 330 335
Pro Gly Gly Gly Ser Arg Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro
340 345 350
His Val Ala Gly Leu Gly Ala Tyr Leu Ile Ala Leu Glu Gly Ile Ser
355 360 365
Gly Gly Ser Val Cys Asp Arg Ile Lys Glu Leu Ala Gln Pro Val Val
370 375 380
Gln Pro Gly Pro Gly Thr Thr Asn Arg Leu Ile Tyr Asn Gly Ser Gly
385 390 395 400
Arg

Claims (22)

1.一种重组丝氨酸蛋白酶，其包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且包含在根据SEQ ID NO:2的编号中的在位置103的氨基酸D和/或在位置105的氨基酸E。
2.根据权利要求1所述的重组丝氨酸蛋白酶，其中，在根据SEQ ID NO:2的编号中，所述多肽具有至少一个选自Q103D和S105E的氨基酸取代。
3.根据权利要求1或2所述的重组丝氨酸蛋白酶，其中，其氨基酸序列对应于SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列之一。
4.一种分离的核酸分子，其包含编码选自以下组的丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列：
(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽并包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:8中描述的氨基酸序列的核酸分子；和
(b)包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中描述的核苷酸序列的编码序列的核酸分子。
5.一种重组表达载体，其包含根据权利要求4所述的分离核酸，所述核酸与能够指引所述丝氨酸蛋白酶在合适宿主中表达的调控序列可操作地连接。
6.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主为微生物宿主。
8.根据权利要求6或7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主为丝状真菌。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主属于木霉属、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、金孢子菌属、脉孢菌属、根霉属、青霉属、毁丝霉属和被孢霉属。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主是里氏木霉。
11.一种生产蛋白酶的方法，该方法包括步骤：将氨基酸取代Q103D和/或S105E引入序列中，所述序列包含与SEQ ID NO:2中限定的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的生产蛋白酶的方法，所述方法还包括步骤：培养权利要求6-10中任一项所述的宿主细胞并回收酶。
13.一种酶制剂，其包含权利要求1-3中任一项所述的重组丝氨酸蛋白酶。
14.根据权利要求13所述的酶制剂，其特征在于，所述制剂包括选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、***糖酶、半乳聚糖酶、黄原酶、木葡聚糖酶、DNA酶和氧化酶的有或没有介质的其他酶。
15.根据权利要求13或14所述的酶制剂，其特征在于，所述制剂包含一种或更多种选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、助洗剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、光增白剂、染料、香料、颜料和防腐剂的添加剂。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂为液体组合物或固体组合物的形式，例如为溶液、分散体、糊剂、粉剂、粒剂、颗粒剂、包衣颗粒剂、片剂、糕剂、晶体、晶体浆液、凝胶或丸剂。
17.权利要求1-5中任一项所述的重组丝氨酸蛋白酶或权利要求13-16中任一项所述的酶制剂在用于去污剂、用于处理纤维、用于处理蛋白质材料、用于处理食品或饲料或用于涉及蛋白质材料的改性、降解或去除的应用中的用途。
18.权利要求1-5中任一项所述的重组丝氨酸蛋白酶或权利要求13-16中任一项所述的酶制剂的用途，其中，蛋白质材料选自羊毛、毛发、皮革和丝绸。
19.权利要求1-5中任一项的重组丝氨酸蛋白酶或权利要求13-16中任一项所述的酶制剂作为去污剂添加剂的用途。
20.权利要求1-5中任一项所述的重组丝氨酸蛋白酶或权利要求13-16中任一项所述的酶制剂在液体去污剂或固体去污剂中的用途，优选为条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或更多个隔室的袋、常规或致密粉剂、粒剂、颗粒剂、糊剂、凝胶或常规、致密或浓缩液体的形式。
21.一种去污剂组合物，其特征在于，所述组合物包含表面活性剂、根据权利要求1-5中任一项所述的重组丝氨酸蛋白酶或根据权利要求13-16中任一项所述的酶制剂，以及选自稳定剂、缓冲剂、助洗剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、光增白剂、染料、香料、颜料和防腐剂的添加剂。
22.根据权利要求21所述的去污剂组合物，其特征在于，所述组合物包含选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、***糖酶、半乳聚糖酶、黄原酶、木葡聚糖酶、DNA酶和氧化酶的有或没有介质的其他酶。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114948812A (zh) * 2022-05-30 2022-08-30 中山市多美化工有限公司 一种含除口臭抑菌组合物的口腔护理液

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102597240A (zh) * 2009-04-30 2012-07-18 生化酶股份有限公司 真菌丝氨酸蛋白酶及其用途
CN102625810A (zh) * 2009-07-08 2012-08-01 生化酶股份有限公司 真菌蛋白酶及其用途
EP2712915A1 (en) * 2012-10-01 2014-04-02 The Procter and Gamble Company Methods of treating a surface and compositions for use therein
CN103890172A (zh) * 2011-03-31 2014-06-25 芬兰Ab酶制剂公司 蛋白酶及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE512226T1 (de) 1994-02-24 2011-06-15 Henkel Ag & Co Kgaa Verbesserte enzyme und detergentien damit
US6682924B1 (en) * 1995-05-05 2004-01-27 Novozymes A/S Protease variants and compositions
ES2367505T3 (es) * 1997-10-23 2011-11-04 Danisco Us Inc. Variantes de proteasa con sustituciones múltiples con carga neta alterada para usar en detergentes.
DE102009029513A1 (de) 2009-09-16 2011-03-24 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Proteasen
DE102010028951A1 (de) 2010-05-12 2011-11-17 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Lipase
DE102010063458A1 (de) 2010-12-17 2012-06-21 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Amylase
DE102010063457A1 (de) 2010-12-17 2012-06-21 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Cellulase
DE102012209289A1 (de) * 2012-06-01 2013-12-05 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease
WO2014138983A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Concordia University Novel cell wall deconstruction enzymes of malbranchea cinnamomea, thielavia australiensis, and paecilomyces byssochlamydoides, and uses thereof
EP3234121A1 (en) * 2014-12-15 2017-10-25 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising subtilase variants

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102597240A (zh) * 2009-04-30 2012-07-18 生化酶股份有限公司 真菌丝氨酸蛋白酶及其用途
CN102625810A (zh) * 2009-07-08 2012-08-01 生化酶股份有限公司 真菌蛋白酶及其用途
CN103890172A (zh) * 2011-03-31 2014-06-25 芬兰Ab酶制剂公司 蛋白酶及其应用
EP2712915A1 (en) * 2012-10-01 2014-04-02 The Procter and Gamble Company Methods of treating a surface and compositions for use therein

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114948812A (zh) * 2022-05-30 2022-08-30 中山市多美化工有限公司 一种含除口臭抑菌组合物的口腔护理液

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