CN113155924B - 一种诺如病毒的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种诺如病毒的检测方法,所述的方法包括利用的AuNPs@ZnFe2O4@COF、Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF、AuNPs@BP@Ti3C2MXene三种物质。所述的方法步骤为,1)合成ZnFe2O4@COF;合成AuNPs@ZnFe2O4@COF;合成Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF;2)剥离黑磷BP;合成BP@Ti3C2MXene;合成AuNPs@BP@Ti3C2MXene;多肽(NoroBP)的固定;3)构建诺如病毒电化学传感器。本发明构建了一种可快速有效检测样品中诺如病毒浓度的电化学传感器。
Description
技术领域
本发明属于适配体电化学传感技术领域,尤其是属于一种诺如病毒检测方法技术领域。
背景技术
诺如病毒(norovirus,NoV)是一种线性单链正向RNA病毒,属于杯状病毒科,是继轮状病毒后可引起人急性胃肠炎流行和暴发的主要病原体。NoV根据其VP蛋白编码序列的不同,可分为7个基因组(GI~GVII),其中GI、GII和GIV基因组主要引起人类感染,GI基因组包含9个不同的基因型,GII基因组包含22个不同的基因型,GIV基因组包含2个不同的基因型,其中以GII基因组引起的人急性胃肠炎最常见。在世界范围内,GII.4基因型曾在NoV感染暴发事件中占据主导地位。
传统的检测方法有ELISA,免疫层析技术和Real-time RT-PCR。ELISA即酶联免疫吸附测定法,检测诺如病毒主要是通过抗原抗体反应,该方法检测诺如病毒节约时间,节约成本,操作简便,但特异性和灵敏度欠缺,且成本高。免疫层析技术是利用试纸条,其上有利用诺如病毒抗原制备的单抗或多抗,来进行检测。其优点在于节约时间,操作方便,因此广泛用于临床检测,但由于灵敏度较低,也具有假阴性率较高的缺点。Real-time RT-PCR是通过提取病毒RNA,设计并合成引物和探针,用定量PCR仪进行荧光定量;Real-time RT-PCR法的特点是检测灵敏度高,结果准确,但对于多病毒亚型的检测比较繁琐,且检测成本高,需要高昂的仪器设备和专业人员操作。
发明内容
本发明正是为了解决上述问题缺陷,提供一种诺如病毒的检测方法。本发明采用如下技术方案实现。
一种材料,本发明所述的材料为AuNPs@ZnFe2O4@COF;
该材料的合成步骤包括:(1)合成AuNPs,将HAuCl4溶液加入到去离子水中,加热搅拌,加入柠檬酸钠溶液,回流,直至溶液变为酒红色,自然冷却至室温,4℃储存备用;
(2)ZnFe2O4@COF粉末分散在去离子水中,超声处理1-4h,然后,通过离心去除较大的颗粒,获得ZnFe2O4@COF的悬浮液,离心后冷冻干燥,4℃储存备用;
(3)将得到的ZnFe2O4@COF加水配制成ZnFe2O4@COF溶液,取ZnFe2O4@COF溶液滴加到金纳米粒子溶液中,4℃搅拌,离心洗涤,得到AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料。
另一种材料,利用上述材料制备的另一种材料,该材料为Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF;该材料的制备步骤包括:将5-30μL 10μmol/L的诺如病毒适配体(Apt)加入到500μL 0.1-5mg/mL的AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料溶液中,室温震荡12h,离心洗涤得到Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF复合探针材料。
另一种材料,本发明所述的材料为AuNPs@BP@Ti3C2 MXene;
该材料的合成步骤包括:将BP@Ti3C2 MXene加水配制成BP@Ti3C2 MXene溶液,取BP@Ti3C2 MXene溶液滴加到金纳米粒子溶液中,4℃搅拌,离心洗涤,得到AuNPs@BP@Ti3C2MXene纳米复合材料。
上述三种材料是本发明检测方法中最为重要的三物质,在目前的公开文件中没有这三种物质的记载,故所述的三种物质本身和合成方法是本发明技术的核心技术之一。更甚,利用所述三种物质的后续使用方法研究成为科学技术新的研究。
使用上述三种材料的方法,该方法为,利用多肽(NoroBP)和适配体夹心式特异性识别GⅡ.4诺如病毒。经研究,本发明此处涉及的方法为本发明核心物质的使用方法之一,并非唯一。
本发明所述利用多肽(NoroBP)和适配体夹心式特异性识别GⅡ.4诺如病毒的方法,检出范围为0.01-105copies/mL。
本发明所述检出范围的检出限最低为0.01copy/mL。本发明所能检测的最低限值低于目前其他方法所公开的最低限值,具有较高的创新高度。
本发明的方法包括以下步骤:
1)合成ZnFe2O4@COF;合成AuNPs@ZnFe2O4@COF;合成Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF;
2)剥离黑磷BP;合成BP@Ti3C2 MXene;合成AuNPs@BP@Ti3C2 MXene;多肽(NoroBP)的固定;
3)构建诺如病毒电化学免疫传感器。以上三个步骤为本发明方法步骤的核心步骤。
详细说明:本发明的方法包括以下步骤:
(1)将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,依次在50%硝酸溶液、50%无水乙醇、超纯水中超声清洗;将电极表面用氮气吹干,滴加10μL 1mg/mL的AuNPs@BP@Ti3C2 MXene纳米复合材料,自然晾干,使电极表面形成一层基底膜;
(2)配制1mg/mL的多肽(NoroBP)溶液,取10-30μL滴加在处理好的电极表面,4℃孵育1-4h;
(3)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,滴加10-30μL1mmol/L的1-己硫醇(HT),室温孵育30min;
(4)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,将10-30μL浓度为10-2-105copies/mL的一系列不同浓度的NoV溶液滴加到步骤(2)处理过的玻碳电极表面,4℃育孵育0.5-4h;
(5)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,将10μL浓度为1mg/mL的Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料滴加在电极表面,室温孵育0.5-4h;
(6)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,滴加10-30μL10mmol/L的甲苯胺蓝(TB)溶液在电极表面,保持湿润,室温孵育10-120min;
(7)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,在10mL pH 7.0PBS溶液中用脉冲伏安法(DPV)对分析物进行检测,扫描电压范围-0.6-0V,脉冲振幅0.05V,脉冲宽度0.05s,绘制工作曲线。
本发明方法所述的NoV溶液为采集疑似含有诺如病毒的粪便加水稀释而来。实际上,采用脱离人体本身的***物、唾液等均可以用来作为NoV溶液的构成可能。
除上述技术方案之外,本发明可以用来识别NoV的分子除了适配体之外还可以是其他生物分子,比如NoV的抗体(单抗或多抗)以及与多肽(NoroBP)主要序列相同经过修饰的其他多肽。本发明中的COF还可用其他共价有机骨架材料替代。
本发明的一些原理/方法论简述:在本发明中,磁性复合共价有机框架纳米材料(AuNPs@ZnFe2O4@COF)作为新一代磁性复合纳米材料,具有良好的吸附性,能溶于水,且具有结合抗体、适配体、多肽等具有识别作用的生物分子等特点。
而且AuNPs@ZnFe2O4@COF复合材料具有良好的导电性和磁分离特点,并对信号分子甲苯胺蓝(TB)具有优良的富集作用。
同时,在本发明中,通过利用范德华力堆叠2D黑磷BP和Ti3C2来制备BP/MXene(Ti3C2)异质结构,用作电极基底材料,从而增加传感器的导电性和灵敏度,然而目前还未见将此异质结构用于电化学传感器的报道。
NoroBP是一种特异性识别诺如病毒多肽,近年来已用于诺如病毒检测方法的建立。在此,我们利用其可以与基底材料上的金纳米粒子结合并可以特异的识别GⅡ.4亚型诺如病毒的特点与磁性复合共价有机框架纳米材料共同作用构建了一个具有高灵敏性、宽检测范围、快速检测、低检出限以及操作方便等优点的诺如病毒电化学传感器。
本发明的目的在于通过把多肽(NoroBP)组装到BP@Ti3C2 MXene@Au包覆的电极上,构成一种可以捕获NoV GⅡ.4的电极表面,将病毒颗粒捕获并固定在电极表面。然后用已合成的负载了NoV GⅡ.4适配体且具有优良电化学性能磁性复合共价有机框架纳米材料来识别电极表面的病毒颗粒,同时利用复合材料对甲苯胺蓝优良的吸附能力将甲苯胺蓝溶液滴加在电极表面进行孵育,最后在10mL浓度为0.2mol/L的pH为7.0的PBS缓冲溶液中进行测试,构成一种可快速有效检测样品中诺如病毒浓度的电化学传感器。
本发明的有益效果为,1)AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料成功制备,并通过红外光谱,扫描电镜图像,透射电镜图像,EDS元素分析,Zeta电位,XRD粉末X射线衍射图谱和XPS光电子能谱证明。
2)COF虽然具有作为探针分子的潜力,但导电性较差;ZnFe2O4@COF相比于单独的COF具有更多的催化活性位点,导电性更加优异,但缺乏与Apt结合的位点;AuNPs@ZnFe2O4@COF不仅具有与Apt结合作用的Au位点,且具有更加优良的导电性,AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料的合成,将三种材料的优良性能有效地结合在一起,充分发挥了作为电化学传感器探针的优良性能。
3)随着电极表面组装层数增加,在0.1mol/L KCl,1mmol/L K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6]溶液中进行电化学阻抗谱分析(EIS),同时进行对应的循环伏安法(CV)验证,验证结果为金成功富集,多肽成功修饰,HT封闭效果良好,可以成功捕获溶液中的NoV,探针结合稳定。
4)随着病毒浓度增加,脉冲伏安法(DPV)检测到的电信号增强,且在10-2-105copies/mL的诺如病毒浓度范围内具有良好的线性关系。
5)将NoV溶液替换为其他物质,例如盐溶液,生物蛋白分子,以及同样可以引发肠道疾病的病毒(轮状病毒和肠道腺病毒),均不能检测到相应的电化学信号。证明用上述方法构建的电化学传感器具有较高的特异性。
6)本发明成功制备了AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料。通过电化学阻抗谱分析(EIS),同时进行对应的循环伏安法(CV)验证,结果表明多肽(NoroBP)可以组装在经过AuNPs@BP@Ti3C2 MXene纳米复合材料修饰的电极上,并且可以有效的捕获NoV,AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料可以通过Apt的连接作用特异性识别诺如病毒并组装到电极上,并且其具备的TB吸附能力和催化性能使AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料可以作为优良的探针对NoV进行检测。同时,多肽(NoroBP)与诺如病毒适配体(Apt)对于NoV的筛选作用使构建的电化学传感器对NoV具有特异性识别的能力,制备得到的传感器的线性检测范围是0.01-105copies/mL,最低检出限(LOD)为0.01copy/mL,该LOD为目前为止报道的最低值,有望在低病毒浓度(载量)样品检测中应用。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1为ZnFe2O4纳米粒子的TEM图。
图2为ZnFe2O4纳米粒子的SEM图。
图3为ZnFe2O4@COF的TEM图。
图4为ZnFe2O4@COF的SEM图。
图5为AuNPs@ZnFe2O4@COF的TEM图。
图6为AuNPs@ZnFe2O4@COF的EDS图。
图7为ZnFe2O4、COF、ZnFe2O4@COF和ZnFe2O4@COF@Au的Zeta电位图。
图8为黑磷BP的TEM图。
图9为黑磷BP的SEM图。
图10为AuNPs@BP@Ti3C2 MXene的EDS图。
图11为材料优化的电流图示,ZnFe2O4@COF中ZnFe2O4与COF反应原料投入比例关系图。
图12为材料优化的电流图示,BP:Ti3C2 MXene中BP与Ti3C2 MXene反应原料投入比例关系图。
图13为本发明传感器的线性检测范围图。
图14为本发明传感器检测原理图。
图15为本发明技术流程框图。
图16为现有技术合成ZnFe2O4@COF的方法步骤图。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明,以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例中所使用的化学试剂,溶剂均为分析纯;所使用的多肽,适配体均为商业化方法获得;电化学检测所使用的仪器为电化学工作站CHI 660D。
1.根据之前的文献报道合成ZnFe2O4@COF,并表征。
(1)合成ZnFe2O4,用乙二醇(40mL)溶解六水合氯化铁(1.0-5.0g)和无水氯化锌(0.1-0.5g),形成透明溶液,随后加醋酸钠(3.6g)和聚乙二醇20000(0.1-2.0g)。混合液剧烈搅拌0.5h后,转移到不锈钢高压釜(容量50mL)中,在200℃条件下反应8-24h,反应终止后自然冷却至室温。将产物用乙醇和水清洗数次,黑色产物在60℃真空环境下干燥6h。
(2)进一步合成ZnFe2O4@COF,取1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB,0.1-0.8g),对苯二甲醛(TPA,0.01-0.2g)和ZnFe2O4(0.1-1.0g),用50mL二甲基亚砜溶解。超声分散5min,超声下加入1.0-5.0mL无水乙酸,室温反应15min。磁铁收集ZnFe2O4@COF,分别用四氢呋喃和甲醇清洗三次,60℃真空干燥。
表征方法有:红外光谱,扫描电镜图像,透射电镜图像,EDS元素分析,Zeta电位,XRD粉末X射线衍射图谱,XPS光电子能谱。
2.AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料的合成及表征。
(1)合成AuNPs,将1.0mL浓度为5.0-30.0mmol/L的HAuCl4溶液加入到100mL去离子水中,在110℃下加热搅拌10min,加入10mL浓度为2.0-20.0mmol/L的柠檬酸钠溶液,回流30min,直至溶液变为酒红色,自然冷却至室温,4℃储存备用。
(2)ZnFe2O4@COF粉末分散在去离子水中,超声处理1-4h。然后,通过离心获得ZnFe2O4@COF的悬浮液,用来去除较大的颗粒,离心后冷冻干燥12h,于4℃储存备用。
(3)将得到的ZnFe2O4@COF加水配制成浓度为0.1-5mg/mL的ZnFe2O4@COF溶液,取1mL ZnFe2O4@COF溶液滴加在10mL浓度为0.2-1.0mmol/L金纳米粒子溶液中,4℃搅拌12h,离心洗涤,得到AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料。
表征方法有:透射电镜图像,EDS元素分析,Zeta电位,XRD粉末X射线衍射图谱,XPS光电子能谱。
3.Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料的合成。
将5-30μL 10μmol/L的诺如病毒适配体(Apt)加入到500μL 0.1-5mg/mL的AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料溶液中,室温震荡12h,离心洗涤备用。
4.根据之前的文献报道合成BP/MXene(Ti3C2),并表征。
(1)制备BP纳米片,取5-50mg块状黑磷在氩气作用下分散在100mL水中,悬液超声4-24h。将稳定的悬浮液在3000rpm下离心3min,最终得到BP纳米片分散体。
(2)取适量Ti3C2加入BP纳米片分散液中,混合液搅拌0.5-4h,随后将悬液转移到不锈钢高压釜中,在120-200℃条件下反应1-3h,过滤,60℃真空干燥12h。
表征方法有:扫描电镜图像,透射电镜图像,Zeta电位。
5.AuNPs@BP@Ti3C2 MXene纳米复合材料的合成及表征。
将得到的BP@Ti3C2 MXene加水配制成浓度为0.5-5mg/mL的BP@Ti3C2 MXene溶液,取1mL BP@Ti3C2 MXene溶液滴加在10mL浓度为0.1-1.0mmol/L金纳米粒子溶液中,4℃搅拌12h,离心洗涤,得到AuNPs@BP@Ti3C2 MXene纳米复合材料。
表征方法有:扫描电镜图像,透射电镜图像,Zeta电位,Mapping。
6.工作电极的制备方法。
将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,依次在50%硝酸溶液、50%无水乙醇、超纯水中超声清洗;将电极表面用氮气吹干,滴加10-20μL在0.5-5.0mg/mL的AuNPs@BP@Ti3C2 MXene纳米复合材料,自然晾干。
7.筛选工作电极的最适反应条件。
(1)配制0.1-1mg/mL的多肽(NoroBP)溶液,取10μL滴加在处理好的电极表面,4℃孵育0-3h,用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,在0.1mol/L KCl,1mmol/LK4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6]溶液中进行电化学阻抗谱分析(EIS),同时进行对应的循环伏安法(CV)验证。
(2)配制0.1-4mg/mL的多肽(NoroBP)溶液,取10μL滴加在处理好的电极表面,4℃孵育1-8h后,滴加10-50μL 1mmol/L的1-己硫醇(HT),室温孵育30min,用0.2mol/L pH7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,吸取10μL浓度为10-2-105copies/mL的NoV溶液滴加到处理好的电极上,4℃孵育0-4h,用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,在0.1mol/L KCl,1mmol/L K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6]溶液中进行电化学阻抗谱分析(EIS),同时进行对应的循环伏安法(CV)验证。
(3)将10μL浓度为1mg/mL的Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料滴加在经过多肽/HT/NoV处理后的电极表面,室温育温0-3h,用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,在0.1mol/L KCl,1mmol/L K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6]溶液中进行电化学阻抗谱分析(EIS),同时进行对应的循环伏安法(CV)验证。
8.诺如病毒的检测步骤。
(1)将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,依次在50%硝酸溶液、50%无水乙醇、超纯水中超声清洗;将电极表面用氮气吹干,滴加10μL在1mg/mL的AuNPs@BP@Ti3C2 MXene纳米复合材料,自然晾干,使电极表面形成一层基底膜;
(2)配制1mg/mL的多肽(NoroBP)溶液,取10-30μL滴加在处理好的电极表面,4℃孵育1-4h;
(3)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,滴加10-30μL 1mmol/L的1-己硫醇(HT),室温孵育30min;
(4)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,将10-30μL浓度为10-2-105copies/mL的一系列不同浓度的NoV溶液滴加到步骤(2)处理过的玻碳电极表面,4℃育温0.5-4h;
(5)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,将10μL浓度为1mg/mL的Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料滴加在电极表面,室温育温0.5-4h;
(6)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,滴加10-30μL 10mmol/L的甲苯胺蓝(TB)溶液在电极表面,保持湿润,室温孵育10-120min;
(7)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,在10mL pH 7.0PBS溶液中用脉冲伏安法(DPV)对分析物进行检测,扫描电压范围-0.6-0V,脉冲振幅0.05V,脉冲宽度0.05s,绘制工作曲线。
详细实验例:
实施例1:ZnFe2O4@COF的制备方法如下:
(1)ZnFe2O4纳米粒的制备:称取六水合氯化铁(1.0g)和无水氯化锌(0.5g),溶解于乙二醇(60mL)中形成透明溶液,随后加入醋酸钠(5.0g)和聚乙二醇20000(0.1g)。混合液剧烈搅拌2h后,转移到不锈钢高压釜(容量100mL)中,在200℃条件下反应12h,反应终止后自然冷却至室温得到含有黑色沉淀的悬浊液。将沉淀用乙醇和水清洗数次,黑色产物在60℃真空环境下干燥6h。获得粉末状ZnFe2O4纳米粒。
(2)进一步合成ZnFe2O4@COF:取1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB,0.1g),对苯二甲醛(TPA,0.06g)和ZnFe2O4(2.0g),用50mL二甲基亚砜溶解。超声分散60min,超声下加入10mL无水乙酸,室温反应60min。磁铁收集ZnFe2O4@COF,分别用四氢呋喃和甲醇清洗三次,得到棕色固体,60℃真空干燥得到ZnFe2O4@COF棕色粉末。
实施例2:制备和表征ZnFe2O4@COF的如下:
(1)ZnFe2O4纳米粒的制备:称取六水合氯化铁(3.0g)和无水氯化锌(1.0g),溶解于乙二醇(80mL)中形成透明溶液,随后加入醋酸钠(2.0g)和聚乙二醇20000(0.1g)。混合液剧烈搅拌0.5h后,转移到不锈钢高压釜(容量100mL)中,在200℃条件下反应24h,反应终止后自然冷却至室温得到含有黑色沉淀的悬浊液。将沉淀用乙醇和水清洗数次,黑色产物在60℃真空环境下干燥6h。获得粉末状ZnFe2O4纳米粒。ZnFe2O4纳米粒的图1TEM和图2SEM图示。
(2)进一步合成ZnFe2O4@COF:取1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB,0.3g),对苯二甲醛(TPA,0.03g)和ZnFe2O4(1.0g),用50mL二甲基亚砜溶解。超声分散30min,超声下加入1.5mL无水乙酸,室温反应15min。磁铁收集ZnFe2O4@COF,分别用四氢呋喃和甲醇清洗三次,得到棕色固体,60℃真空干燥得到ZnFe2O4@COF棕色粉末。ZnFe2O4@COF的图3TEM和图4SEM图示。
实施例3:AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料的制备:
(1)AuNPs的制备:在搅拌条件下,将50mL浓度为20mmol/L的HAuCl4溶液加入200mL沸腾的去离子水中,在110℃下加热搅拌30min,缓慢滴加50mL浓度为20mmol/L的柠檬酸钠溶液,冷凝回流60min,直至溶液变为酒红色,溶液在室温条件下搅拌60min,于4℃下储存。
(2)将上一步得到ZnFe2O4@COF的加水配制成浓度为5mg/mL的ZnFe2O4@COF溶液,取2mL ZnFe2O4@COF溶液滴加在浓度为0.2mmol/L 50mL金纳米粒子溶液中,4℃搅拌24h,磁铁收集,弃上清液,继续用去离子水离心洗涤3次,得到AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料。
实施例4:AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料的制备和表征:
(1)AuNPs的制备:在搅拌条件下,将20mL浓度为20mmol/L的HAuCl4溶液加入150mL沸腾的去离子水中,在110℃下加热搅拌60min,缓慢滴加30mL浓度为50mmol/L的柠檬酸钠溶液,冷凝回流60min,直至溶液变为酒红色,溶液在室温条件下搅拌60min,于4℃下储存。
(2)将上一步得到ZnFe2O4@COF的加水配制成浓度为2mg/mL的ZnFe2O4@COF溶液,取5mL ZnFe2O4@COF溶液滴加在浓度为0.1mmol/L 10mL金纳米粒子溶液中,4℃搅拌8h,磁铁收集,弃上清液,继续用去离子水离心洗涤3次,得到AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料。
采用透射电镜图像,EDS元素分析,对AuNPs@Fe3O4@COF纳米复合材料进行了表征:从透射电镜图中可以看出,ZnFe2O4纳米颗粒外包裹着一层絮状的COF结构,小颗粒状AuNPs均匀的分布在COF结构中,同时,EDS元素分析表明在加入AuNPs之后,纳米复合物的元素中多了Au元素,可表明纳米复合物的成功合成。实施例5:在AuNPs@ZnFe2O4@COF上修饰Apt:
将公司合成的Apt按照说明书的稀释方法用去离子水稀释为10μmol/L,然后将30μL 10μmol/L的诺如病毒适配体(Apt)加入到500μL 1mg/mL的AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料溶液中,室温震荡12h,磁铁富集后去除上清液用去离子水洗涤备用。
实施例6:不同合成比例探针材料的电化学性能研究,具体方法如下:
探究合成ZnFe2O4@COF时ZnFe2O4与COF反应原料投入比例是否对探针材料的性能有明显影响。首先,分别称取ZnFe2O4 10mg\TAPB20mg\TPA50mg,合成ZnFe2O4@COF的原料,分别加入5mL二甲基亚砜溶解,超声5min,随后分别加入150μL无水乙酸,获得溶液颜色呈现为由深到浅的灰棕色,环境条件下反应30min,磁铁收集产物,甲醇清洗三次,60℃真空干燥,得到ZnFe2O4@COF棕色粉末。
将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,依次在50%硝酸溶液、50%无水乙醇、超纯水中超声清洗,待电极表面干燥后,将10μL四种ZnFe2O4与COF比例不同的2mg/mL的ZnFe2O4@COF滴加在电极表面,待干燥后,滴加20μL 10mmol/L的甲苯胺蓝(TB)溶液在电极表面,保持湿润,室温育温30min后,用脉冲伏安法(DPV)对分析物进行检测,检测结果为,在电极表面,按照ZnFe2O4:TAPB+TPA=10:1的比例合成的ZnFe2O4@COF对TB的吸附能力最优良。
实施例7:诺如病毒电化学免疫传感器工作电极的制备方法,具体步骤如下:
(1)将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,依次在50%硝酸溶液、50%无水乙醇、超纯水中超声清洗;将电极表面用氮气吹干,滴加20μL在2mg/mL的AuNPs@BP@Ti3C2 MXene纳米复合材料,晾干,电极表面形成一层基底膜;
(2)配制0.1mg/mL的多肽(NoroBP)溶液,取15μL滴加在处理好的电极表面,4℃孵育30min;
(3)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,滴加10μL0.1mmol/L的1-己硫醇(HT),室温孵育30min;
(4)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,将20μL浓度为10-2-105copies/mL的一系列不同浓度的NoV溶液滴加到步骤(2)处理过的玻碳电极表面,4℃孵育30min;
(5)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,将10μL浓度为0.5mg/mL的Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料滴加在电极表面,室温孵育4h;
(6)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,滴加20μL10mmol/L的甲苯胺蓝(TB)溶液在电极表面,保持湿润,室温孵育30min;
(7)用0.2mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次,待电极干燥后,在20mL pH 7.0PBS溶液中用脉冲伏安法(DPV)对分析物进行检测,扫描电压范围-0.6-0V,脉冲振幅0.05V,脉冲宽度0.05s,绘制工作曲线。传感器检测原理如图所示。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明的配方属于数值范围,故实施例不能穷举,本发明所记载的保护范围以本发明的数值范围和其他技术要点范围为准),方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出,上述实施例不以任何方式限制本发明,对于本领域的技术人员来说,凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准,说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (7)
1.一种纳米复合材料,其特征在于,所述的材料为AuNPs@ZnFe2O4@COF;
该材料的合成步骤包括:(1)合成AuNPs,将HAuCl4溶液加入到去离子水中,加热搅拌,加入柠檬酸钠溶液,回流,直至溶液变为酒红色,自然冷却至室温,4℃储存备用;
(2)ZnFe2O4@COF粉末分散在去离子水中,超声处理1-4h,然后,通过离心去除较大的颗粒,获得ZnFe2O4@COF的悬浮液,离心后冷冻干燥,4℃储存备用;
(3)将得到的ZnFe2O4@COF加水配制成ZnFe2O4@COF溶液,取ZnFe2O4@COF溶液滴加到金纳米粒子溶液中,搅拌,离心洗涤,得到AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料。
2.使用权利要求1所述材料制备的一种材料,其特征在于,该材料为Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF;该材料的制备步骤包括:将5-30μL 10μmol/L的诺如病毒适配体Apt加入到500μL 0.1-5mg/mL的AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料溶液中,室温震荡12h,离心洗涤得到Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF复合探针材料。
3.使用权利要求2所述材料的方法,其特征在于,该方法为,利用多肽NoroBP和所述的Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF复合探针材料特异性识别GⅡ.4诺如病毒。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述利用多肽NoroBP和适配体夹心式特异性识别GⅡ.4诺如病毒的方法,检出范围为0.01-105 copies/mL。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述检出范围的检出限最低为0.01copy/mL。
6.一种诺如病毒检测方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
1)合成ZnFe2O4@COF;合成AuNPs@ZnFe2O4@COF;合成Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF;
2)剥离黑磷BP;合成BP@ Ti3C2 MXene;合成AuNPs@BP@Ti3C2 MXene;多肽NoroBP的固定;
3)构建诺如病毒电化学传感器;
所述AuNPs@ZnFe2O4@COF的合成步骤包括:(1)合成AuNPs,将HAuCl4溶液加入到去离子水中,加热搅拌,加入柠檬酸钠溶液,回流,直至溶液变为酒红色,自然冷却至室温,4℃储存备用;(2)ZnFe2O4@COF粉末分散在去离子水中,超声处理1-4h,然后,通过离心去除较大的颗粒,获得ZnFe2O4@COF的悬浮液,离心后冷冻干燥,4℃储存备用;(3)将得到的ZnFe2O4@COF加水配制成ZnFe2O4@COF溶液,取ZnFe2O4@COF溶液滴加到金纳米粒子溶液中,搅拌,离心洗涤,得到AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料:
所述Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF的合成步骤包括:将5-30μL 10μmol/L的诺如病毒适配体Apt加入到500μL 0.1-5mg/mL的AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料溶液中,室温震荡12h,离心洗涤得到Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF复合探针材料;
所述AuNPs@BP@Ti3C2 MXene的合成步骤包括:将BP@Ti3C2 MXene加水配制成BP@Ti3C2MXene溶液,取BP@Ti3C2 MXene溶液滴加在金纳米粒子溶液中,4℃搅拌,离心洗涤,得到AuNPs@BP@Ti3C2 MXene纳米复合材料;
所述诺如病毒电化学传感器的制备方法步骤包括:
(1)将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,依次在50%硝酸溶液、50%无水乙醇、超纯水中超声清洗;将电极表面用氮气吹干,滴加10μL 1mg/mL的AuNPs@BP@Ti3C2MXene纳米复合材料,自然晾干,使电极表面形成一层基底膜;
(2)配制1mg/mL的多肽NoroBP溶液,取10-30μL滴加在处理好的电极表面,4℃孵育1-4h;
(3)用0.2mol/L pH 7.0 PBS清洗电极3次,待电极干燥后,滴加10-30μL 1mmol/L的1-己硫醇HT,室温孵育30min;
(4)用0.2mol/L pH 7.0 PBS清洗电极3次,待电极干燥后,将10-30μL浓度为10-2-105copies/mL的一系列不同浓度的NoV溶液滴加到步骤(2)处理过的玻碳电极表面,4℃孵育0.5-4h;
(5)用0.2mol/L pH 7.0 PBS清洗电极3次,待电极干燥后,将10μL浓度为1mg/mL的Apt@AuNPs@ZnFe2O4@COF纳米复合材料滴加在电极表面,室温孵育0.5-4h;
(6)用0.2mol/L pH 7.0 PBS清洗电极3次,待电极干燥后,滴加10-30μL 10mmol/L的甲苯胺蓝TB溶液在电极表面,保持湿润,室温孵育10-120min;
(7)用0.2mol/L pH 7.0 PBS清洗电极3次,待电极干燥后,在10mL pH 7.0 PBS溶液中用脉冲伏安法DPV对分析物进行检测,扫描电压范围-0.6-0V,脉冲振幅0.05V,脉冲宽度0.05s,绘制工作曲线。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,该方法所述的NoV溶液为采集疑似含有诺如病毒的粪便加水稀释而来。
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