CN113151523A - 一种生姜青枯病雷尔氏菌的pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生姜青枯病雷尔氏菌的PCR检测方法。由于生姜青枯病逐年加重，为防止带菌姜种和带菌土壤引起的生姜青枯病的发生和传播，亟需建立快速准确、快速检测病原菌的方法，PCR检测病原菌成本低，操作简便，适合检测诊断应用，本方法通过引物筛选和条件优化，建立了生姜青枯病雷尔氏菌的PCR检测技术，可用于发病植株和土壤中青枯病菌的检测，预防重大土传病害的发生，满足当前生产需要。该方法具有灵敏度高、速度快，能准确地检测田间病株及根际土壤中的青枯雷尔氏菌，为生姜青枯病的早期预防提供了有效的技术手段。

Description

一种生姜青枯病雷尔氏菌的PCR检测方法
技术领域
本发明涉及生姜青枯病雷尔氏菌检测技术领域，具体为一种生姜青枯病雷尔氏菌的PCR检测方法。
背景技术
为了明确引起湖北生姜青枯病的病原菌及建立快速准确的检测技术，本方法对自湖北恩施采集的生姜病样进行分离，基于形态学特征，分子生物学和致病性测定的方法对其进行鉴定，从已报道的青枯雷尔氏菌的特异性引物进行筛选验证，获得条带的特异性引物，创建并优化PCR反应条件，建立生姜青枯病PCR检测技术，为生姜青枯病害的早期预防、诊断及防控提供技术支持。
为有效防控生姜青枯病，本发明对湖北恩施的生姜青枯病病样进行分离，基于形态学特征、分子生物学和致病力测定对其进行鉴定，并采用PCR技术对已报道的21F-21R特异性引物进行特异性和灵敏度检验，创建并优化PCR检测方法。该发明对生姜青枯病雷尔氏菌的分离鉴定及PCR检测方法的建立，为指导生姜青枯病的早期预测和防治提供重要的参考依据和技术支持。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种生姜青枯病雷尔氏菌的分离鉴定与PCR检测方法，具备降低了检测过程中的成本，提高了检测效率，灵敏度也符合实际生产过程中的检测需求的优点，解决了目前，国际上利用PCR检测技术对蔬菜土传病原菌进行带菌检测的方法较多，但对生姜枯萎病进行病菌检测尚未见报道的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，该发明提供如下技术方案：一种生姜青枯病雷尔氏菌的分离鉴定与PCR检测方法，包括以下步骤：
1)生姜青枯病病害调查、样品采集与病原菌的分离：
生姜青枯病雷尔氏菌的分离在前人的基础上加以改进，将采集的病株用无菌刀截取根茎部，在超净工作台中，剥去外表皮，切下病变组织，置于装有50mL无菌水的三角瓶中，37℃、150rpm振荡，待无菌水有少许浑浊感后，用接种环沾取少量液体，采用平板划线分离法接种到TTC培养基平板上，放置于30℃恒温培养箱中培养48h，长出的菌落用于形态学和分子生物学鉴定。
从湖北恩施采集的样品中分离得到10株菌落形态和颜色与标准青枯雷尔氏菌相近的菌株，分别命名为ES202023～ES202033，选取ES202023菌株为代表作为形态学和分子生物学鉴定的候选菌株。
2)形态学鉴定：
参照《常见细菌***鉴定手册》，将平板上菌落颜色和形状与青枯雷尔氏菌相似的单菌落重新接到TTC平板上，观察菌落的形态特征和培养特征等，并进行革兰氏染色，电子显微和扫描电镜观察其具体形状。
ES202023在TTC培养基上表面湿润有光泽，流动性极强，生长到第三天菌落中间出现粉红色，革兰氏染色的结果显示菌株为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状，形态与标准菌株青枯雷尔氏菌一致。
3)分子生物学鉴定：
以采用CTAB/NaCl法提取菌株基因组DNA为模板，标准菌株为阳性对照，无菌去离子水为阴性对照，以16SrDNA通用引物16S-F和16S-R PCR扩增16SrDNA序列，PCR扩增程序为预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，补齐72℃10min，循环30次，得到约1400bp的特异片段，将测序得到的16SrDNA序列在NCBI数据库进行BLAST搜索后获取相关种属的16SrDNA序列，与ES202023序列一起，用MEGA7.0软件按邻接法构建***进化树。
ES202023与多条青枯雷尔氏菌聚在同一分支上，结合形态学特征与分子生物学鉴定，将菌株ES202023鉴定为青枯雷尔氏菌。
4)致病力测定：
将分离得到的青枯菌在TTC培养基平板上划线，30℃培养36个小时后挑取单菌落在TTC液体培养基30℃、200rpm培养24h。采用茎基部注射接种法。
将活化后的菌株ES202023接种健康的生姜苗上，以接种无菌水为阴性对照，接种番茄青枯为阳性对照，观察菌株对生姜的致病性，结果显示，接种菌株ES202023经分离鉴定可获得与接种病原菌相同的分离物。而接种无菌水和番茄青枯菌的生姜组织样本中均分离不到接种病原菌。
5)生姜青枯病雷尔氏菌PCR检测方法的建立：
特异性引物验证与PCR检测方法的优化：根据分离鉴定得到的青枯菌基因组DNA为模板，分别以番茄青枯菌、土豆青枯菌、藿香青枯菌等12株菌株基因组DNA为对照，检索国内外关于生姜青枯病雷尔氏菌的分子检测报道，选取特异性引物21R-21F，根据电泳条带的有无及大小，并且对阳性样品的扩增产物进行双向测序，并在GenBank中进行BLAST分析，对生姜青枯菌引物的特异性进行验证。
对影响PCR方法的重要因素进行优化，58-70℃之间设计梯度PCR反应程序，共58、58.2、59.8、61.1、62.8、64.8、66.6、67.9、69、69.6、70℃12个梯度。3个延伸时间分别设为30s、45s和1min。3个循环次数分别设为30、35、40次，结果按照病原菌扩增的特异性和敏感性，即条带的强弱、杂带的有无等进行综合评价。
用引物21F和21R对所有供试菌株基因组DNA进行扩增，电泳检测，仅青枯菌基因组DNA能扩增除一条125bp的特异性条带，其他对照菌株与阴性对照均无扩增现象，并且对扩增产物经克隆测序后，通过GenBank上BLAST比对，同源性均达到99％，因此确定扩增产物为目标菌株，结果表明，引物21F，21R具有特异性，能够区别青枯病菌与其他病原菌。
通过对退火温度、延伸时间和循环次数的优化，最终确定PCR反应方法(总体积为25μL)：2×Taq Master PCR Mix12.5μL，引物21F/21R0.5μL，模板1μL，补加ddH2O至25μL，反应程序：94℃预变性5min。94℃变性30s，61.1℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。72℃延伸10min。
6)PCR反应灵敏度检测：
利用超微量紫外分光光度计测定其青枯菌模版DNA纯度及浓度，将模板浓度稀释至10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6ng·μL-18个浓度梯度，使用优化后的PCR方法进行PCR扩增，取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像***照相。
利用优化后的PCR反应条件对8个不同浓度梯度的模板DNA进行扩增，随模板DNA浓度的降低条带亮度也在下降，引物21对供试菌株基因组的最低检测浓度为10-2ng.μL-1。
7)发病植株组织和土壤中青枯病菌的检测：
以7个不同地区采集的7份发病组织，并且通过人工接种收集的3份发病组织和健康植株为试验材料进行发病植株组织的PCR检测。
3份人工接种的病株组织都扩增出条带，7份不同地区采集的病株组织只有湖北恩施和四川绵阳的病株组织扩增出条带，其余地区病株与健康植物均未扩增条带，与病原菌的分离鉴定结果一致，3份接种土壤中都扩增出来条带，从7份不同地区采集的病株根围土壤中只有湖北恩施和四川绵阳的样本扩增出条带，其余地区土壤样本和灭菌土壤均未扩增出条带，以上检测结果与分离培养结果吻合，说明此方法可以检测植株病原菌和土壤病菌。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种生姜青枯病雷尔氏菌PCR检测方法，具备以下有益效果：
由于生姜青枯病逐年加重，为防止带菌姜种和土壤引起的生姜青枯病的发生和传播，亟需建立快速准确检测病原菌的方法，PCR检测病原菌成本低，操作简便，适合初步的检测和应用，该方法通过引物筛选和条件优化，建立了生姜青枯病雷尔氏菌的PCR检测方法，可用于发病植株和土壤中青枯病菌的检测，预防重大病害的发生，满足当前生产需要。
附图说明
图1为本发明中生姜青枯病雷尔氏菌的分离示意图；
图2为本发明中生姜青枯病雷尔氏菌形态特征示意图；
图3为本发明中ES202023 16S r RNA基因***发育分析示意图；
图4为本发明中生姜接种示意图；
图5为本发明中病原菌PCR特异性检测示意图；
图6为本发明中退火温度优化示意图；
图7为本发明中PCR灵敏度检测示意图；
图8为本发明中病株组织的PCR检测示意图；
图9为本发明中土壤的PCR检测示意图。
图1中，A:生姜青枯病的发病症状，B菌落在TTC培养基培养1d的形态。
图2中，A:菌体在电子显微镜下的形态特征，B:菌体在扫描电镜下的形态特征。
图4中，A:接种无菌水，B：接种青枯雷尔氏菌。
图5中，M：DL2000 DNA Marker；1：青枯雷尔氏菌；2：番茄青枯菌；3：土豆青枯菌；4：藿香青枯菌；5：烟草青枯菌；6：变黄假单胞菌；7：台湾假单胞菌；8：谷关假单胞菌；9：大黄鱼致病性香鱼假单胞菌；10：胡萝卜软腐果胶杆菌：11：路氏肠杆菌；12：蜡样芽孢杆菌；13：鲍曼不动杆菌；14：成团泛菌；15：解鸟氨酸拉乌尔菌；16：阴性对照(ddH2O)。
图8中，M：DL2000 DNA Marker；1-3：人工接种病株组织；4：恩施病株组织；5：荆州病株组织；6：上蔡病株组织；7：潍坊病株组织；8：永川病株组织；9：开江病株组织；10：绵阳病株组织；11：健康植株组织；N：阴性对照(ddH2O)。
图9中，M：DL2000 DNA Marker；1-3：人工接种土壤；4：恩施根围土壤；5：荆州根围土壤；6：上蔡根围土壤；7：潍坊根围土壤；8：永川根围土壤；9：开江根围土壤；10：绵阳根围土壤；11：灭菌土壤；N：阴性对照(ddH2O)。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试验材料准备：
供试病株及植株：疑似生姜青枯病病株采自湖北恩施，健康生姜植株品种为大黄姜，种于玻璃温室中。
供试菌株：生姜青枯劳尔氏菌标准菌株由中国农业科学院植物保护研究所提供，番茄青枯菌、土豆青枯菌、藿香青枯菌、烟草青枯菌、变黄假单胞菌、台湾假单胞菌、谷关假单胞菌、大黄鱼致病性香鱼假单胞菌、胡萝卜软腐果胶杆菌、路氏肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、成团泛菌、解鸟氨酸拉乌尔菌均有由研究院实验室保存。
培养基：2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazoliumchloride，TTC)选择性培养基：蛋白胨10g、水解酪蛋白1g、葡萄糖5g、2，3，5-氯化三苯基四氮唑0.5g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，LB(Luria-Bertani)液体培养基：酵母提取物10g、胰蛋白胨10g、NaCl5g，蒸馏水定容至1L；LB固体培养基：酵母提取物10g、胰蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L。
试剂及仪器：氯化三苯基四氮唑，DNA marker、2×SuperTap PCR Mix，DNA凝胶回收试剂盒，SPX-150B-Z型生化培养箱，NanoDrop one型全自动超微量核酸分析仪，T100型PCR仪，DYY-6C型电泳仪，ChemiDoc XRS+型化学发光成像***。
我国种植生姜历史悠久，是世界上生姜种植面积最大且生产总量最多的国家，由于生姜产区长期无性繁殖，连年重茬种植，青枯雷尔氏菌在土壤和姜种中历年积累，生姜青枯病普遍发生，严重威胁广大姜农的经济收入，生姜青枯菌是由青枯雷尔氏菌引起的，此病原菌寄主范围广，致病机制复杂，本方法试验从荆州、恩施等地的生姜种植区采集疑似青枯病病样，分离纯化出1株致病力强的青枯病菌株，为生姜青枯病检测提供了方法。
请参阅图1-9，一种生姜青枯病雷尔氏菌PCR检测方法，包括以下步骤：
1)生姜青枯病病害调查、样品采集与病原菌的分离：
生姜青枯病雷尔氏菌的分离在前人的基础上加以改进，将采集的病株用无菌刀截取根茎部，在超净工作台中，剥去外表皮，切下病变组织，置于装有50mL无菌水的三角瓶中，37℃、150rpm振荡，待无菌水有少许浑浊感后，用接种环沾取少量液体，采用平板划线分离法接种到TTC培养基平板上，放置于30℃恒温培养箱中培养48h，长出的菌落用于形态学和分子生物学鉴定。
从湖北恩施采集的样品中分离得到10株菌落形态和颜色与标准青枯雷尔氏菌相近的菌株，分别命名为ES202023～ES202033，选取ES202023菌株为代表作为形态学和分子生物学鉴定的候选菌株。
2)形态学鉴定：
参照《常见细菌***鉴定手册》，将平板上菌落颜色和形状与青枯雷尔氏菌相似的单菌落重新接到TTC平板上，观察菌落的形态特征和培养特征等，并进行革兰氏染色，电子显微和扫描电镜观察其具体形状。
ES202023在TTC培养基上表面湿润有光泽，流动性极强，生长到第三天菌落中间出现粉红色，革兰氏染色的结果显示菌株为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状，形态与标准菌株青枯雷尔氏菌一致。
3)分子生物学鉴定：
采用CTAB/NaCl法提取菌株基因组DNA，以提取的DNA为模板，标准菌株为阳性对照，无菌去离子水为阴性对照，使用细菌16SrDNA扩增通用引物16S-F/16S-R，进行PCR扩增16SrDNA序列，PCR扩增程序为预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，补齐72℃10min，循环30次，得到约1400bp的特异片段。
扩增后的16SrDNAPCR产物琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，送至生物公司进行双向测序，将测序得到的16SrDNA序列在NCBI数据库进行BLAST搜索后获取相关种属的16SrDNA序列，选取与该菌序列同源性较高的菌株和雷尔氏菌属的其他2个亚种，以A、B和C为外群，在NCBI上获取16SrDNA序列，使用MEGA7.0软件，通过对比分析基于邻接法(neighbor-joiningmethod)来构建分离菌株的***发育树，bootstrap检验值应≥70％，重复1000次，结果表明ES202023与多条青枯雷尔氏菌聚在同一分支上，结合形态学特征与分子生物学鉴定，将菌株ES202023鉴定为青枯雷尔氏菌。
对比过程：发现16SrDNA序列与已经报道的青枯雷尔氏菌Ralstoniasolanacearum strain hn16S(登录号：MN830162.1)和Ralstonia solanacearum strainS-116S(登录号：MN508403.1)序列相似性为99.9％，下载相似度较高的多条序列、同属序列和外群序列，与ES202023序列一起，用MEGA7.0软件按邻接法构建***进化树。
4)致病力测定：
将分离得到的青枯菌在TTC培养基平板上划线，30℃培养36个小时后挑取单菌落在TTC液体培养基30℃、200rpm培养24h，调整细菌浓度为107cfu/mL，试验在温室盆栽进行，土壤经高温灭菌消毒，持水量为40％。
将活化后的菌株ES202023接种健康的生姜苗上，以接种无菌水和接种番茄青枯为对照，观察菌株对生姜的致病性。
采用茎基部注射接种法：用4号注射器取1ml菌液，注射在生姜植株的茎基部，重复接种20盆。
以接种无菌水为阴性对照，接种番茄青枯为阳性对照，在接种第九天后调查发病情况，青枯病病情分成5个等级，0级：植株长势健康。1级：1个叶片枯萎。2级：2至3个叶片枯萎。3级：3片(含)以上叶片枯萎。4级：植株死亡。
结果显示，接种ES202023的生姜植株在第3天后生姜叶片逐步变成深褐色，然后蔓延到周边地区，最后慢慢枯萎，两周后植株全部死亡，这与采集的生姜青枯病的植株表现出来的症状完全一致，且平均病情指数高于30.0，接种无菌水和番茄青枯菌均不发病，分别取回接第15天的生姜病株组织，重新分离，接种菌株ES202023经分离鉴定可获得与接种病原菌相同的分离物。
5)生姜青枯病雷尔氏菌PCR检测方法的建立：
特异性引物验证与PCR检测方法的优化：根据分离鉴定得到的青枯菌基因组DNA为模板，分别以番茄青枯菌、土豆青枯菌、藿香青枯菌等12株菌株基因组DNA为对照，检索国内外关于生姜青枯病雷尔氏菌的分子检测报道，选取特异性引物21R-21F，根据电泳条带的有无及大小，并且对阳性样品的扩增产物进行双向测序，并在GenBank中进行BLAST分析，对生姜青枯菌引物的特异性进行验证。
对影响PCR方法的重要因素进行优化，58-70℃之间设计梯度PCR反应程序，共58、58.2、59.8、61.1、62.8、64.8、66.6、67.9、69、69.6、70℃12个梯度。3个延伸时间分别设为30s、45s和1min。3个循环次数分别设为30、35、40次，结果按照病原菌扩增的特异性和敏感性，即条带的强弱、杂带的有无等进行综合评价。
用引物21F和21R对所有供试菌株基因组DNA进行扩增，电泳检测，仅青枯菌基因组DNA能扩增除一条125bp的特异性条带，其他对照菌株与阴性对照均无扩增现象，并且对扩增产物经克隆测序后，通过GenBank上BLAST比对，同源性均达到99％，因此确定扩增产物为目标菌株，结果表明，引物21F，21R具有特异性，能够区别青枯病菌与其他病原菌。
通过对退火温度、延伸时间和循环次数的优化，最终确定PCR反应体系(总体积为25μL)：2×Taq Master PCR Mix12.5μL，引物21F/21R0.5μL，模板1μL，补加ddH2O至25μL，反应程序：94℃预变性5min。94℃变性30s，61.1℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。72℃延伸10min。
6)PCR反应灵敏度检测：
利用超微量紫外分光光度计测定其青枯菌模版DNA纯度及浓度，将模板浓度稀释至10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6ng·μL-18个浓度梯度，使用优化后的PCR方法进行PCR扩增，取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像***照相。
利用优化后的PCR反应条件对8个不同浓度梯度的模板DNA进行扩增，随模板DNA浓度的降低条带亮度也在下降，引物21对供试菌株基因组的最低检测浓度为10-2ng.μL-1。
7)发病植株组织和土壤中青枯病菌的检测：
以7个不同地区采集的7份发病组织，并且通过人工接种收集的3份发病组织和健康植株为试验材料进行发病植株组织的PCR检测。
将10发病组织和健康植株组织样本采用CTAB法提取基因组DNA后进行PCR扩增，田间采集7个不同地区病株的根围土壤样本7份，并将浓度为10-7的菌液与无菌土壤混匀，得到3份接种土壤，以灭菌土壤为对照，采用土壤基因组DNA提取试剂盒，对土壤进行基因组DNA提取后进行PCR扩增，发病植株组织和土壤的基因组DNA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像***照相，同时进行病原菌分离培养，以验证该PCR检测方法。
3份人工接种的病株组织都扩增出条带，7份不同地区采集的病株组织只有湖北恩施和四川绵阳的病株组织扩增出条带，其余地区病株与健康植物均未扩增条带，与病原菌的分离鉴定结果一致，3份接种土壤中都扩增出来条带，从7份不同地区采集的病株根围土壤中只有湖北恩施和四川绵阳的样本扩增出条带，其余地区土壤样本和灭菌土壤均未扩增出条带，以上检测结果与分离培养结果吻合。
有益效果：
由于生姜青枯病逐年加重，为防止带菌姜种和土壤引起的生姜青枯病的发生和传播，亟需建立快速准确检测病原菌的方法，PCR检测病原菌成本低，操作简便，适合初步的检测和应用，本方法通过引物筛选和条件优化，建立了生姜青枯病雷尔氏菌的PCR检测方法，可用于发病植株和土壤中青枯病菌的检测，预防重大病害的发生，满足当前生产需要。
该方法具有灵敏度高，能准确地检测田间病株及根围土壤中的青枯雷尔氏菌，为生姜青枯病的早期预防提供了有效的技术手段。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，该发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种生姜青枯病雷尔氏菌PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)生姜青枯病病害调查、样品采集与病原菌的分离：
生姜青枯病雷尔氏菌的分离在前人的基础上加以改进；从湖北恩施采集的样品中分离得到10株菌落形态和颜色与标准青枯雷尔氏菌相近的菌株，分别命名为ES202023～ES202033，选取ES202023菌株为代表作为形态学和分子生物学鉴定的候选菌株；
2)形态学鉴定：
ES202023在TTC培养基上表面湿润有光泽，流动性极强，生长到第三天菌落中间出现粉红色，革兰氏染色的结果显示菌株为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状，形态与标准菌株青枯雷尔氏菌一致；
3)分子生物学鉴定：
以提取的基因组为模板，以16SrDNA通用引物16S-F和16S-R PCR扩增16SrDNA序列，得到1400bp的特异片段，将测序得到的16SrDNA序列在NCBI数据库进行BLAST搜索后获取相关种属的16SrDNA序列，对比发现：与已经报道的青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum 16S(登录号：MN830162.1)序列相似性为99.9％，下载相似度较高的多条序列、同属序列和外群序列，与ES202023序列一起，用MEGA7.0软件按邻接法构建***进化树；
ES202023与多条青枯雷尔氏菌聚在同一分支上，结合形态学特征与分子生物学鉴定，将菌株ES202023鉴定为青枯雷尔氏菌；
4)致病力测定：
将活化后的菌株ES202023接种健康的生姜苗上，以接种无菌水为对照，观察菌株对生姜的致病性，结果显示，接种ES202023的生姜植株在第3天后生姜叶片逐步变成深褐色，然后蔓延到周边地区，最后慢慢枯萎，两周后植株全部死亡，这与采集的生姜青枯病的植株表现出来的症状完全一致。
5)生姜青枯病雷尔氏菌PCR检测方法的建立：
S1、检索国内外关于生姜青枯病雷尔氏菌的分子检测报道，选取特异性引物21R-21F，用引物21F和21R对所有供试菌株基因组DNA进行扩增，电泳检测，仅青枯菌基因组DNA能扩增除一条125bp的特异性条带，其他对照菌株与阴性对照均无扩增现象，并且对扩增产物经克隆测序后，通过GenBank上BLAST比对，同源性均达到99％，因此确定扩增产物为目标菌株，引物21F，21R具有特异性，能够有效区别青枯病菌与其他病原菌；
S2、通过对退火温度、延伸时间和循环次数的优化，最终确定PCR反应方法(总体积为25μL)：2×Taq Master PCR Mix12.5μL，引物21F/21R0.5μL，模板1μL，补加ddH2O至25μL，反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，61.1℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；
6)PCR反应灵敏度检测：
利用优化后的PCR反应条件对8个不同浓度梯度的模板DNA进行扩增，随模板DNA浓度的降低条带亮度也在下降，引物21对供试菌株基因组的最低检测浓度为10-2ng.μL-1；
7)发病植株组织和土壤中青枯病菌的检测：
3份人工接种的病株组织都扩增出条带，7份不同地区采集的病株组织只有湖北恩施和四川绵阳的病株组织扩增出条带，其余地区病株与健康植物均未扩增条带，检测结果与分离培养结果吻合，说明此方法可以检测有菌植株和带菌土壤青枯菌。
2.根据权利要求1所述的一种生姜青枯病雷尔氏菌的分离鉴定与PCR检测方法，其特征在于，所述生姜青枯病雷尔氏菌的分离在前人的基础上加以改进，改进过程包括：将采集的病株用无菌刀截取根茎部，在超净工作台中，剥去外表皮，切下病变组织，置于装有50mL无菌水的三角瓶中，37℃、150rpm振荡，待无菌水有少许浑浊感后，用接种环沾取少量液体，采用平板划线分离法接种到TTC培养基平板上，放置于30℃恒温培养箱中培养48h，长出的菌落用于形态学和分子生物学鉴定。
3.根据权利要求1所述的一种生姜青枯病雷尔氏菌的分离鉴定与PCR检测方法，其特征在于，步骤6中所述的8个浓度梯度分别为10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6ng·μL-1。
4.根据权利要求1所述的一种生姜青枯病雷尔氏菌的分离鉴定与PCR检测方法，其特征在于，所述样品采集的标准：生姜植株发病初期，叶尖或叶缘开始变黄，逐渐向内扩展，叶片萎垂、反卷，并出现明显凋萎症状，且茎基及地下根茎***，呈淡黄褐色水渍状，其横切面可见维管束变褐色，用手挤压，有白色菌浓从维管束溢出。
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