CN113151177A

CN113151177A - 乳腺或乳腺癌组织脱细胞基质及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN113151177A
Application number: CN202110562151.6A
Authority: CN
Inventors: 谭秋雯; 吕青; 徐莉; 张俊慧; 解慧琪
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113151177B

Abstract

本发明公开了一种乳腺或乳腺癌组织脱细胞基质及其制备方法和用途，属于生物医学工程领域。本发明的方法步骤如下：1)冰冻乳腺或乳腺癌组织，切成膜片状；2)用液氮反复冻融2～4次；3)在裂解液中静置或摇动12～24h后，洗去裂解液；4)用核酸酶去除残存细胞核成分，流水冲洗，缓冲液漂洗；5)冻干，包装消毒。本发明的方法去细胞效果好，多细胞外基质纤维伤害小。本发明的乳腺或乳腺癌组织脱细胞基质可诱导癌细胞的上皮间质转化，基于该原理可制备癌细胞上皮间质转化的细胞模型，应用前景良好。

Description

乳腺或乳腺癌组织脱细胞基质及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医学工程领域。

背景技术

脱细胞基质(ECM)，也叫去细胞基质，是将组织内细胞去除后，得到的固型物，可用于制作外科手术用补片或组织工程中种子细胞生长的载体。

目前已经有多种器官来源的脱细胞基质，包括肝脏、肺、心脏、膀胱、真皮等等器官来源。由于组织的构造，细胞排列、结构等不同，制备各种器官的脱细胞基质的方法不同。例如：张沛灵等报道了一种软骨的脱细胞基质制备方法，包括用0.5％胰酶酶解24h，期间更换胰酶，然后再用1U/mL核酸酶酶解4h，再使用1％的Triton X-100处理24h(张沛灵等，软骨脱细胞基质仿生支架的制备及其对骨髓基质干细胞成软骨分化的影响，组织工程与重建外科，2021年2月第17卷第1期)。专利申请CN 111494718 A报道了一种肺的脱细胞基质的制备方法，包括先从气管灌注保护剂，再从血管灌注去垢剂，去垢剂的选择是先灌注SLES，再灌注Triton X-100。

乳腺及乳腺癌组织具有其独特的构造，腺体致密程度和脂肪含量存在个体差异，且乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，不同病人、不同分子亚型的乳腺癌组织的组织构造、细胞排列也存在差异。因此，乳腺及乳腺癌组织的脱细胞基质制备难度较大。目前尚未见将乳腺及乳腺癌组织用于制备脱细胞基质的报道。

上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞改变形态、细胞结构而失去上皮细胞特征，获得侵袭性和迁移性间充质表型的一种生物学过程。EMT参与肿瘤的发生和发展，在促进肿瘤转移侵袭中发挥重要作用。有的抗肿瘤药物就是对EMT干预而发挥作用的。通过构建癌细胞EMT模型，可以用于辅助干预EMT的药物的筛选。

目前构建癌细胞EMT模型主要依赖在培养基中添加特定成分。例如：在培养基中加入TGF-1β可令胃癌细胞的上皮标志分子E-cadherin显著降低表达，间质标志分子N-cadherin和Vimentin升高表达，即能建立EMT模型(朱耀东.南蛇藤提取物调控HSP27抑制胃癌上皮间质转化的作用及机制研究.扬州大学博士学位论文，2015)；在三阴性乳腺癌细胞培养环境中加入LPS培养后，细胞的Vimentin和β-catenin表达上调，而E-cadherin表达下调，也能得到EMT模型(陈州华.黄芩苷抑制三阴性乳腺癌侵袭和上皮间质转化的作用及相关机理研究.湖南中医药大学博士学位论文，2018)。

目前尚未见将脱细胞基质用于构建癌细胞EMT模型的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是：(1)提供一种制备乳腺或乳腺癌组织的脱细胞基质的方法；(2)提供三阴性乳腺癌脱细胞基质在制备癌细胞上皮间质转化模型中的用途。

本发明的技术方案如下：

一种乳腺或乳腺癌组织脱细胞基质的制备方法，步骤如下：

1)冰冻乳腺或乳腺癌组织，切成膜片状；

2)用液氮反复冻融2～4次；

3)在裂解液中裂解12～24h后，洗去裂解液；

4)用核酸酶消化去除残存细胞核成分，流水冲洗，缓冲液漂洗；

5)冻干，包装消毒；

所述裂解液为体积比为0.25％～1％的Triton X-100及10～30mM NH₄OH溶液的混合液。

进一步地，所述裂解液为体积比为0.5％的Triton X-100及20mM NH₄OH溶液的混合液。

进一步地，步骤4)所述核酸酶是DNase I。

进一步地，步骤4)中DNase I的浓度为100mg/ml；

和/或，步骤4)中核酸酶消化时间为3h；

和/或，步骤4)中核酸酶消化的温度为37℃。

前述方法制备得到的脱细胞基质。

一种制备癌细胞上皮间质转化模型的方法，该方法包括如下步骤：

1)将癌细胞接种到湿润的三阴性乳腺癌脱细胞基质表面；

2)孵育，使细胞充分粘附于脱细胞基质；

3)加入培养基培养。

进一步地，所述三阴性乳腺癌脱细胞基质的DNA残留低于50ng/mg。

进一步地，所述三阴性乳腺癌脱细胞基质是以三阴性乳腺癌为原料，利用前述乳腺或乳腺癌组织脱细胞基质的制备方法制备得到的。

进一步地，所述癌细胞是乳腺癌细胞。

进一步地，所述癌细胞为MCF-7细胞。

有益效果：

1)本发明的脱细胞基质制备方法对乳腺细胞成分去除效率高。Masson染色观察不到细胞残留，脱细胞后DNA含量低于50ng/mg。

2)本发明的脱细胞基质制备方法对细胞外基质显微结构影响小。

3)三阴性乳腺癌组织的脱细胞基质可促进癌细胞发生上皮间质转化，表现为E-cadherin表达量降低，Vimentin表达量升高；可用于构建癌细胞上皮间质转化模型。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：脱细胞前后HE染色及DAPI染色。

图2：正常乳腺组织(B)、LuminalA(LA)乳腺癌组织以及三阴性(TN)乳腺癌组织脱细胞前后DNA定量。

图3：正常乳腺组织脱细胞后外观以及脱细胞前后Masson染色结果。(a).正常乳腺组织脱细胞后大体外观(b).正常乳腺组织脱细胞前Masson染色(c).正常乳腺组织脱细胞后Masson染色(bar＝100μm)。

图4：B-ECM、LA-ECM、TN-ECM培养的肿瘤细胞的上皮标志分子E-cadherin和间质标志分子Vimentin表达检测(*P＜0.05，**P＜0.001，&为与2D比较有统计学差异，#为与B-ECM比较有统计学差异，△为与LA-ECM比较有统计学差异，O为与TN-ECM比较有统计学差异)。

具体实施方式

实施例1乳腺和乳腺癌脱细胞基质的制备

一、组织来源

本实验所用正常乳腺组织及乳腺癌组织均取自四川大学华西医院乳腺外科。乳腺组织来源于行乳腺癌改良根治术的早期乳癌患者，术中取远离肿瘤组织的正常乳腺组织。乳腺癌组织取自未接受放化疗及内分泌治疗的初诊乳腺癌手术患者。上述标本获取前均经患者知情同意。取材后由液氮罐转移至实验室，置于-80℃冰箱储存备用。

二、制备方法

1.将正常乳腺和乳腺癌标本从-80℃冰箱取出后迅速移至冰冻切片机，予以OTC(optimum cutting temperature compound，最佳切片温度混合物，为市售品)包埋；

2.肿瘤组织块修剪成约1cm×1cm团块，连续切片制备厚度为150μm的膜片；正常乳腺组织块直接修块、切片成膜片状；

3.PBS洗涤三次，每次20min，去除组织表面多余油脂、血渍及杂质及膜片周围包埋剂成分；

4.上述膜片在液氮中反复冻融3次，每次时间约30分钟；

5.将冻融后组织转移至裂解液(体积比为0.5％的Triton X-100及20mM NH₄OH溶液的混合液)处理18h，37℃恒温摇床进行，125rpm；

6.大量PBS溶液漂洗三次，每次30min，离心换液；

7.100mg/ml DNase I处理3h去除残余细胞核成分，37℃恒温摇床，125rpm；

8.流水冲洗2h，再使用大量PBS溶液漂洗三次，每次30min，离心换液；

9.洗涤满意后冻干材料，包装后环氧乙烷消毒。

三、脱细胞评价

1、脱细胞前后HE染色和Masson染色

使用Hematoxylin-Eosin/HE Staining Kit(Solarbio，北京)和Masson StainKit(Solarbio，北京)分别进行HE染色和Masson染色。

2、DNA定量

使用Quant-iT^TM

dsDNA Reagent and Kits(Invitrogen,UK)检测组织中残余DNA含量，重复测量3次。检测方法参考产品说明书。

四、结果

1、组织学定性表明组织脱细胞完全

脱细胞处理前，正常乳腺组织HE染色及DAPI染色均可见大量细胞及细胞碎片分布于乳腺实质和间质中。经脱细胞处理后ECM的HE染色见大量嗜伊红的间质成分，未见蓝染的细胞核。DAPI染色结果提示ECM中无明显蓝紫色荧光的细胞核结构(图1)。

2、组织学定量表明组织脱细胞完全

脱细胞后残余DNA含量检测通过PicoGreen试剂盒检测而得到。经反复多次检测，结果如图2所示，正常乳腺组织、Luminal A型乳腺癌组织、三阴性乳腺癌组织平均DNA含量分别为(411.13±35.17)ng/mg、(504.96±42.52)ng/mg、(504.13±38.63)ng/mg,而脱细胞后平均DNA含量分别(17.46±11.23)ng/mg、(46.91±18.14)ng/mg、(44.79±16.29)ng/mg。三种ECM内残余DNA含量均满足脱细胞标准(＜50ng/mg)。

3、脱细胞处理过程对细胞外基质纤维结构影响小

经过物理+化学+酶处理法处理后获得的ECM膜片呈白色不均匀半透明状，表面有黏性，质地柔软(图3a)。图3b为正常乳腺组织脱细胞前Masson染色，可见乳腺组织由腺泡及间质构成。图3c为脱细胞处理后Masson染色，视野中无细胞残留，由蓝染的胶原纤维构成。对比可见脱细胞处理前后ECM纤维构象基本一致，脱细胞后纤维保存完整，无明显断裂。

实验结果表明，本发明联合物理-化学以及生物酶法对正常乳腺组织及乳腺癌组织膜片进行脱细胞处理，成功去除了组织中的细胞成分，对细胞外基质结构影响小。

实施例2脱细胞基质对肿瘤细胞的上皮表型和间质表型的影响测试

以正常乳腺组织(B)、LuminalA(LA)乳腺癌组织以及三阴性(TN)乳腺癌组织分别使用实施例1的方法制备得到脱细胞基质，依次命名为：B-ECM、LA-ECM和TN-ECM。

一、实验步骤

1、接种前脱细胞基质准备：取环氧乙烷灭菌后的B-ECM、LA-ECM、TN-ECM用无血清MEM基础培养基在24孔板中浸泡至少3h。接种细胞前再次以MEM完全培养基洗涤2次后移至48孔板。于无菌操作台中稍微晾干备用，以ECM保持湿润状态，孔板中无培养基为宜。

MEM完全培养基的配制方法具体如下：每100ml完全培养基中含MEM基础培养基90ml，10％的胎牛血清，0.11g/L无菌丙酮酸钠，0.01mg/ml牛胰岛素，1％的青霉素和链霉素，配置后4℃保存。

2、细胞的准备：将乳腺癌细胞MCF-7(购于ATCC生物细胞库)采用MEM完全培养基培养。取对数期生长的MCF-7细胞，用MEM完全培养基制成5×10⁶个/ml的细胞悬液。

3、接种：将总体积为10μl的MCF-7细胞悬液用微量枪分2-3次微量、均匀地接种至上述准备好的B-ECM、LA-ECM、TN-ECM表面，以普通平板作为2D对照组，每组设3个重复组。接种细胞后置于37℃、5％CO₂孵箱孵育2小时，使细胞充分粘附于ECM支架上。2小时后添加MEM完全培养基，此后每天更换培养液。

4、细胞总RNA的提取：接种培养5天后，使用Eastep Total RNA Purification Kit(Promega，US)提取不同ECM培养下的MCF-7细胞的总RNA，用于后续PCR定量检测实验。

5、细胞总蛋白的提取：接种培养5天后，使用RIPA裂解液(雅酶，中国)提取MCF-7蛋白。

6、RT-qPCR检测MCF-7细胞EMT标志分子mRNA表达水平：使用

1-Step RT-qPCR System试剂盒行PCR定量检测各ECM培养下上皮标志物E-cadherin和间质标志物Vimentin的mRNA表达水平。实验步骤参考说明书。各引物序列如下：

7、western blot检测MCF-7细胞EMT标志分子蛋白表达水平：使用雅酶公司相关试剂盒进行检测，实验步骤参考说明书，其中一抗均购自abcam(US)公司，二抗均购自Solarbio(北京)公司。

二、实验结果

1、乳腺癌MCF-7细胞EMT标志物的表达情况

肿瘤浸润、复发或转移的发生往往跟肿瘤细胞发生EMT息息相关，为进一步探索ECM对MCF-7细胞EMT的影响，实验分别采用RT-qPCR和Western blot检测三种ECM环境下培养5天后的MCF-7细胞上皮标志分子E-cadherin和间质标志分子Vimentin的mRNA和蛋白表达的变化。

图4A的PCR结果显示TN-ECM组E-cadherin的mRNA水平显著低于B-ECM和LA-ECM，而Vimentin的mRNA水平显著身高，差异均具有统计学意义(P<0.001)。Western blot(图4B)结果也显示E-cadherin在TN-ECM组最低，而Vimentin在TN-ECM组呈高表达。

上述结果表明TN-ECM可诱导MCF-7细胞发生EMT，而LA-ECM具有维持MCF-7细胞上皮表型的作用。因此，可以将三阴性乳腺癌的ECM作为细胞培养的支架，接种癌细胞，制备癌细胞的EMT模型。

综上，本发明的方法可以有效去除乳腺、乳腺癌组织中的细胞成分，对细胞外基质结构影响小。且制备得到的三阴性乳腺癌ECM具有促进肿瘤细胞发生EMT，可用于构建癌细胞EMT模型。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 乳腺或乳腺癌组织脱细胞基质及其制备方法和用途

<130> GYKH1124-2021P0112887CC

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

ccactttgtg aagctcattt cct 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

tcgtcctcct ctggtgctct 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

agtcactgac accaacgata at 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

atcgttgttc actggatttg tg 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

cgagagctac acgttcacgg 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

gggtgtcgag ggaaaaatag g 21

Claims

1.一种乳腺或乳腺癌组织脱细胞基质的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)冰冻乳腺或乳腺癌组织，切成膜片状；

2)用液氮反复冻融2～4次；

3)在裂解液中裂解12～24h后，洗去裂解液；

5)冻干，包装消毒；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述裂解液为体积比为0.5％的Triton X-100及20mM NH₄OH溶液的混合液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)所述核酸酶是DNase I。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤4)中DNase I的浓度为100mg/ml；

和/或，步骤4)中核酸酶消化时间为3h；

和/或，步骤4)中核酸酶消化的温度为37℃。

5.权利要求1～4任一所述方法制备得到的脱细胞基质。

6.一种制备癌细胞上皮间质转化模型的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

1)将癌细胞接种到湿润的三阴性乳腺癌脱细胞基质表面；

2)孵育，使细胞充分粘附于脱细胞基质；

3)加入培养基培养。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述三阴性乳腺癌脱细胞基质的DNA残留低于50ng/mg。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述三阴性乳腺癌脱细胞基质是以三阴性乳腺癌为原料，利用权利要求1～4任一所述方法制备得到的。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述癌细胞是乳腺癌细胞。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述癌细胞为MCF-7细胞。