CN113150052B - 一种葶苈子中槲皮素糖苷的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种葶苈子中槲皮素糖苷的纯化方法。所述方法包括以下步骤：（1）葶苈子中槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖‑7‑O‑β‑D‑龙胆双糖苷的初步水提取；（2）葶苈子水提物醇沉除杂；（3）LX‑68G型大孔树脂洗脱分离；（4）CM‑琼脂糖凝胶FF柱洗脱纯化；（5）制备型液相纯化得到槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖‑7‑O‑β‑D‑龙胆双糖苷单体化合物。实验结果表明：CM‑琼脂糖凝胶FF对槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖‑7‑O‑β‑D‑龙胆双糖苷有良好的纯化效果，再经过制备型液相分离纯化的样品纯度可达到99.0%以上，符合国家中药对照品大于98.5%的技术要求，可做为中药对照品应用。

Description

一种葶苈子中槲皮素糖苷的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种葶苈子中槲皮素糖苷的纯化方法，涉及葶苈子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的纯化工艺。
背景技术
葶苈子为十字花科播娘蒿或独行菜的干燥成熟种子，前者习称“南葶苈子”，后者习称“北葶苈子”。葶苈子在中医学中一般不作为君药应用于方剂中，一般作为佐使药或单味药使用，且常常用于治疗多种原因引起的肺热咳喘。在现代临床应用中，多用于中药复方中和其他药物配合使用，用于心血管疾病、呼吸***疾病的治疗。
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷为南葶苈子中的特征成分，在2020版《中国药典》中用于鉴别和标定南葶苈子。文献查询，南葶苈子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的分离纯化工艺一般为大孔树脂、聚酰胺等方式分离后，再经硅胶柱层析或者SephadexLH-20，对槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的分离不完全，纯度较低，很难达到国家中药对照品纯度为98.5%的技术要求。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供一种葶苈子中槲皮素糖苷的纯化方法。本发明选用CM-琼脂糖凝胶FF柱用于分离纯化，提高了葶苈子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量，为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的对照品的制备，奠定了良好的基础。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种葶苈子中槲皮素糖苷的提取方法，采用CM-琼脂糖凝胶FF柱分离提取葶苈子中槲皮素糖苷，并且所述葶苈子中槲皮素糖苷为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷，然后结合制备型液相得到槲皮素糖苷单体化合物。
优选，一种葶苈子中槲皮素糖苷的提取方法，步骤如下：
S1、取葶苈子干燥种子与去离子水混合水浴加热提取，提取温度80℃，水浴时间1～2h，重复提取三次后合并滤液，滤液浓缩后喷雾干燥即得干燥后样品；
S2、取干燥后样品用60%乙醇超声溶解15～45min，静置20～30h后过滤，滤液浓缩后冻干，得冻干样品；
S3、取冻干样品用pH 4.5的酸水超声5min溶解，于活化的LX-68G型大孔树脂上样，上样后静置1～2h，去离子水洗脱1～2个柱体积后，依次用10%乙醇、20%乙醇梯度洗脱，洗脱流速为1～2mL/min，洗脱过程中HPLC实时检测，待HPLC图谱显示杂质峰值降低至其峰高最大值的1/10时换下一洗脱梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱液，浓缩后冻干，得提取物；
S4、取提取物，30%甲醇配制浓度为0.06～0.08mg/mL的溶液，超声3～5min溶解，用滴管吸取后缓慢均匀的铺展于再生后CM-琼脂糖凝胶FF柱表面，30%甲醇以15～25mL/min的流速洗脱，HPLC实时检测洗脱液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量变化，当HPLC图谱显示有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，收集洗脱液，浓缩后冻干，得粗提物；
S5、取粗提物，30%甲醇超声溶解，选用LC3000型制备型液相在254nm下用30%甲醇以4mL/min洗脱至无峰时开始上样洗脱，待制备型液相图谱显示有吸收峰时，收集洗脱液，经 HPLC检测图谱显示洗脱液中成分为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，对此部分洗脱液浓缩冻干，得精提物，经HPLC测定精提物为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷单体化合物。
进一步优选的，所述步骤S2中超声功率为140～160Hz。
进一步优选的，所述步骤S2中过滤选用的纱布为200目。
进一步优选的，所述步骤S3中液相条件为：C18反向色谱柱（250*4.6mm,5μm）；进样量为20μL；流动相为：乙腈：0.1%冰乙酸=10：90；检测时间：20min；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：254nm。
进一步优选的，所述步骤S3中pH4.5酸水的配制是以稀盐酸进行调节的。
进一步优选的，所述步骤S4中收集洗脱液时，以每50mL为一单位收集洗脱液并经HPLC测定其成分。
有益效果：与现有技术相比，本发明提供了一种新的葶苈子中槲皮素糖苷的纯化技术路线，在纯化过程中选用CM-琼脂糖凝胶FF柱分离纯化葶苈子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷，提高槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量，且经后续制备型液相纯化得到槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷纯度可达到99.0%以上，可作为中药对照品，明显高于国家中药对照品的98.5%的技术要求。
本发明对葶苈子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷采用一种新的分离纯化方法，具有提取分离方法简单易操作、获得产品纯度高等优点，有较好的推广应用价值。本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
具体实施方式
下面将对本发明进行更详细的描述，其中表示了本发明的优选实施例，应该理解本领域技术人员可以修改在此描述的本发明而仍然实现本发明的有益效果。因此，下列描述应当被理解为对于本领域技术人员的广泛知道，而并不作为对本发明的限制，并且以下所用试剂均指体积浓度。
实施例一
一种实用的葶苈子中槲皮素糖苷的分离纯化工艺，包括如下步骤：
S1、取葶苈子干燥种子200kg过四号筛，加入4000L去离子水，水浴加热提取，提取温度为80℃，水浴时间1.5h，重复提取三次，合并滤液浓缩喷雾干燥，得干燥后样品。
S2、取干燥后样品500g，以60%乙醇3.4L超声溶解15min，避光静置21h后过滤，滤液浓缩冻干，得冻干样品。
S3、取冻干样品200g，pH 4.5的酸水1L超声15min溶解，取pH4.5的酸水洗脱活化后的LX-68G型大孔树脂后上样，上样后静置1h，去离子水洗脱1.2个柱体积后，依次用10%乙醇、20%乙醇梯度洗脱，洗脱流速为1.5mL/min，洗脱液用HPLC实时检测，待HPLC图谱显示杂质峰值降低至其峰高最大值的1/10时，收集20%乙醇洗脱液，浓缩冻干，得提取物。HPLC测定提取物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为16.40%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表1所示：
表1
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 1.0670 7396.7 16.40%
S4、取提取物0.4125g，30%甲醇5mL超声3min溶解，用滴管缓慢均匀的铺展于再生后CM-琼脂糖凝胶 FF柱表面后，用30%甲醇以流速为15mL/min洗脱，HPLC实时检测洗脱液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量变化，当HPLC图谱显示有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，收集洗脱液，浓缩后冻干，得粗提物。HPLC测定粗提物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为52.73%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表2所示：
表2
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.2552 4706.8 52.73%
与S3比较显示：经过S4的CM-琼脂糖凝胶 FF柱的纯化后槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量得到大幅度提高，而杂质峰的数量得到明显减少，大大提高了分离效率，为后续制备型液相的分离纯化奠定了良好的基础。
S5、取粗提物41.34mg用30%甲醇2mL超声溶解，选择LC3000型制备型液相在254nm下用30%甲醇以4mL/min流速洗脱至图谱显示无峰时上样洗脱，待制备型液相图谱显示有吸收峰时，收集洗脱液，经HPLC检测，图谱显示洗脱液中成分为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，对此部分洗脱液浓缩冻干，得精提物。HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为99.92%。
HPLC测定精槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表3所示：
表3
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.220 9585.1 99.92%
实施例二
一种实用的葶苈子中槲皮素糖苷的分离纯化工艺，包括如下步骤：
S1、取葶苈子干燥种子200kg过四号筛，加入4000L去离子水，水浴加热提取，提取温度为80℃，水浴时间1.5h，重复提取三次，合并滤液浓缩喷雾干燥，得干燥后样品。
S2、取干燥后样品550g，以60%乙醇3.8L超声溶解20min，避光静置26h后过滤，滤液浓缩冻干，得冻干样品。
S3、取冻干样品145g， pH 4.5的酸水2.8L超声30min溶解，取pH4.5的酸水洗脱活化后的LX-68G型大孔树脂后上样，上样后静置1.5h，去离子水洗脱1.5个柱体积后，依次用10%乙醇、20%乙醇梯度洗脱，洗脱流速为1.8mL/min，洗脱液用HPLC实时检测，待HPLC图谱显示杂质峰值降低至其峰高最大值的1/10时，收集20%乙醇洗脱液，浓缩冻干，得提取物。HPLC测定提取物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为13.45%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表4所示：
表4
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 1.0480 5961 13.45%
S4、取提取物0.3216g，用30%甲醇5mL超声5min溶解，用滴管缓慢均匀的铺展于再生后CM-琼脂糖凝胶 FF柱表面后，用30%甲醇以20mL/min的流速洗脱，HPLC实时检测洗脱液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量变化，当HPLC图谱显示有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，收集洗脱液，浓缩冻干，得粗提物。HPLC测定粗提物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为49.69%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表5所示：
表5
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.2820 5249 49.69%
与S3比较显示：经过S4的CM-琼脂糖凝胶 FF柱的纯化，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量得到大幅度提高，而杂质峰的数量得到明显减少，提高了分离效率，与实施例一显示的结果一致，说明CM-琼脂糖凝胶 FF柱的纯化明显优于现有技术，显著提高了槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量。
S5、取粗提物56.34mg用2mL的30%甲醇超声溶解，选择LC3000型制备型液相在254nm下用30%甲醇以4mL/min流速洗脱至图谱显示无峰时上样洗脱，待制备型液相图谱显示有吸收峰时，收集洗脱液，经 HPLC检测，图谱显示洗脱液中成分为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，对此部分洗脱液浓缩冻干，得精提物。HPLC测定精提物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为99.36%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表6所示：
表6
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.210 9141.7 99.36%
实施例三
一种实用的葶苈子中槲皮素糖苷的分离纯化工艺，包括如下步骤：
S1、取葶苈子干燥种子200kg过四号筛，加入4000L去离子水，水浴加热提取，提取温度为80℃，水浴时间1.5h，重复提取三次，合并滤液浓缩喷雾干燥，得干燥后样品。
S2、取干燥后样品400g，以60%乙醇3L超声溶解25min，避光静置20h后过滤，滤液浓缩减压干燥，得干燥样品。
S3、取干燥样品139g，pH 4.5的酸水3.6L超声25min溶解，取pH4.5的酸水洗脱活化后的LX-68G型大孔树脂后上样，上样后静置1.5h，去离子水洗脱1个柱体积后，依次用10%乙醇、20%乙醇梯度洗脱，洗脱流速为1.8mL/min，洗脱液用HPLC实时检测，待HPLC图谱显示杂质峰值降低至其峰高最大值的1/10时，收集20%乙醇洗脱液，浓缩减压干燥，得提取物。HPLC测定提取物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为13.39%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表7所示：
表7
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 1.0560 5976.3 13.39%
S4、取提取物0.3876g，用30%甲醇5mL超声5min溶解，用滴管缓慢均匀的铺展于再生后CM-琼脂糖凝胶 FF柱表面后，用30%甲醇以15mL/min的流速洗脱，HPLC实时检测洗脱液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量变化，当HPLC图谱显示有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，收集洗脱液，浓缩后冻干，得粗提物。HPLC测定粗提物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为50.31%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表8：
表8
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.1496 2528.3 50.31%
与S3比较，经过S4的CM-琼脂糖凝胶 FF柱的纯化，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量得到大幅度提高，与实施例一和二的提取结果类似，纯化效果明显优于现有技术。
S5、取粗提物52.76mg用30%甲醇2mL超声溶解，选择LC3000型制备型液相在254nm下用30%甲醇以4mL/min流速洗脱至图谱显示无峰时上样洗脱，待制备型液相图谱显示有吸收峰时，收集洗脱液，经 HPLC检测，图谱显示洗脱液中成分为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，对此部分洗脱液浓缩冻干，得精提物。HPLC测定精提物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为99.44%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表9所示：
表9
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.222 9669.1 99.44%
实施例四
一种实用的葶苈子中槲皮素糖苷的分离纯化工艺，包括如下步骤：
S1、取葶苈子干燥种子100kg过四号筛，加入2000L去离子水，水浴加热提取，提取温度为80℃，水浴时间1.5h，重复提取三次，合并滤液浓缩喷雾干燥，得干燥后样品。
S2、取干燥后样品325g，以60%乙醇3.5L超声溶解20min，避光静置28h后过滤，滤液浓缩减压干燥，得干燥样品。
S3、取干燥样品100g，pH 4.5的酸水2.5L超声20min溶解，取pH4.5的酸水洗脱活化后的LX-68G型大孔树脂后上样，上样后静置1.5h，去离子水洗脱2个柱体积后，依次用10%乙醇、20%乙醇梯度洗脱，洗脱流速为1.8mL/min，洗脱液用HPLC实时检测，待HPLC图谱显示杂质峰值降低至其峰高最大值的1/10时，收集20%乙醇洗脱液，浓缩后冻干，得提取物。HPLC测定提取物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为15.89%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表10所示：
表10
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 1.0370 6965.1 15.89%
S4、取提取物0.4298g，用30%甲醇5mL超声5min溶解，用滴管缓慢均匀的铺展于再生后CM-琼脂糖凝胶 FF柱表面后，用30%甲醇以20mL/min的流速洗脱，HPLC实时检测洗脱液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量变化，当HPLC图谱显示有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，收集洗脱液，浓缩冻干，得粗提物。HPLC测定粗提物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为52.47%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表11所示：
表11
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.2540 4991.6 52.47%
与S3比较，经过S4的CM-琼脂糖凝胶 FF柱的纯化，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量得到大幅度提高。
S5、取粗提物60.69mg用30%甲醇2mL超声溶解，选择LC3000型制备型液相在254nm下用30%甲醇以4mL/min流速洗脱至图谱显示无峰时上样洗脱，待制备型液相图谱显示有吸收峰时，收集洗脱液，经 HPLC检测，图谱显示洗脱液中成分为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，对此部分洗脱液浓缩冻干，得精提物。HPLC测定精提物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为99.65%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表12所示：
表12
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.237 10298.2 99.65%
实施例五
一种实用的葶苈子中槲皮素糖苷的分离纯化工艺，包括如下步骤：
S1、取葶苈子干燥种子50kg过四号筛，加入1000L去离子水，水浴加热提取，提取温度为80℃，水浴时间1.5h，重复提取三次，合并滤液浓缩喷雾干燥，得干燥后样品。
S2、取干燥后样品520g，以60%乙醇4L超声溶解25min，避光静置32h后过滤，滤液浓缩冻干，得冻干样品。
S3、取冻干样品170g，pH 4.5的酸水4L超声35min溶解，取pH4.5的酸水洗脱活化后的LX-68G型大孔树脂后上样，上样后静置2h，去离子水洗脱2个柱体积后，依次用10%乙醇、20%乙醇梯度洗脱，洗脱流速为2.5mL/min，洗脱液用HPLC实时检测，待HPLC图谱显示杂质峰值降低至其峰高最大值的1/10时，收集20%乙醇洗脱液，浓缩后冻干，得提取物。HPLC测定提取物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为11.49%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表13所示：
表13
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 1.0210 4959.7 11.49%
S4、取提取物0.3937g，用30%甲醇5mL超声3min溶解，用滴管缓慢均匀的铺展于再生后CM-琼脂糖凝胶 FF柱表面后，用30%甲醇以25mL/min的流速洗脱，HPLC实时检测槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量变化，当HPLC图谱显示有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，收集洗脱液，浓缩后冻干，得粗提物。HPLC测定粗提物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为48.65%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表14所示：
表14
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.4912 8767.9 48.65%
与S3比较，经过S4的CM-琼脂糖凝胶 FF柱的纯化，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量得到大幅度提高。
S5、取粗提物58.43mg用30%甲醇2mL超声溶解，选择LC3000型制备型液相在254nm下用30%甲醇以4mL/min流速洗脱至图谱显示无峰时上样洗脱，待制备型液相图谱显示有吸收峰时，收集洗脱液，经HPLC检测，图谱显示洗脱液中成分为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，对此部分洗脱液浓缩冻干，得精提物。HPLC测定精提物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为99.54%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表15所示：
表15
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.240 10417.4 99.54%
实施例六
一种实用的葶苈子中槲皮素糖苷的分离纯化工艺，包括如下步骤：
S1、取葶苈子干燥种子200kg过四号筛，加入4000L去离子水，水浴加热提取，提取温度为80℃，水浴时间1.5h，重复提取三次，合并滤液浓缩喷雾干燥，得干燥后样品。
S2、取干燥后样品470g，以60%乙醇4.5L超声溶解25min，避光静置24h后，过滤，滤液浓缩冻干，得冻干样品。
S3、取冻干样品150g，pH 4.5的酸水4L超声25min溶解，取pH4.5的酸水洗脱活化后的LX-68G型大孔树脂后上样，上样后静置1h，去离子水洗脱1.5个柱体积后，依次用10%乙醇、20%乙醇梯度洗脱，洗脱流速为2mL/min，洗脱液用HPLC实时检测，待HPLC图谱显示杂质峰值降低至其峰高最大值的1/10时，收集20%乙醇洗脱液，浓缩后冻干，得提取物。HPLC测定提取物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为11.93%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表16所示：
表16
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 1.0080 5085.1 11.93%
S4、取提取物0.3742g，用30%甲醇5mL超声3min溶解，用滴管缓慢均匀的铺展于再生后CM-琼脂糖凝胶 FF柱表面后，用30%甲醇以25mL/min的流速洗脱，HPLC实时检测洗脱液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量变化，当HPLC图谱显示有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，收集洗脱液，浓缩冻干，得粗提物。HPLC测定粗提物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为46.78%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表17所示：
表17
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.4248 7276.2 46.78%
与S3比较，经过S4的CM-琼脂糖凝胶 FF柱的纯化，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量得到大幅度提高。
S5、取粗提物63.29mg用30%甲醇2mL超声溶解，选择LC3000型制备型液相在254nm下用30%甲醇以4mL/min洗脱至图谱显示无峰时上样洗脱，待制备型液相图谱显示有吸收峰时，收集洗脱液，经 HPLC检测图谱显示洗脱液中成分为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，对此部分洗脱液浓缩冻干，得精提物。HPLC测定精提物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量为99.41%。
HPLC测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量结果如下表18所示：
表18
名称 浓度（mg/mL） 峰面积 含量
样品 0.238 10316.4 99.41%
现有的南葶苈子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的分离纯化工艺一般为大孔树脂、聚酰胺等方式分离后，再经硅胶柱层析或者SephadexLH-20，对槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的分离不完全，纯度较低，很难达到国家中药对照品的98.5%的技术要求。但是，本发明的以上具体实施例部分显示，采用CM-琼脂糖凝胶FF提取纯化槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷效果明显。本领域的技术人员公知的CM-琼脂糖凝胶FF为弱阳离子交换介质的层析分离介质，多用作蛋白质、多肽、DNA等大分子的提取分离，没有文献报道其可用于中药化合物的分离纯化。本发明的关键在于选用了CM-琼脂糖凝胶FF柱用于葶苈子中槲皮素糖苷的分离纯化，CM-琼脂糖凝胶FF柱的使用可显著提高葶苈子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷纯化效率，原因即在于CM-琼脂糖凝胶FF柱对于葶苈子提取物中的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷显示出明显的选择吸附，而对葶苈子提取物中其它的物质（如多糖、强心苷、异硫氰酸类等成分）吸附效果较差，因此，CM-琼脂糖凝胶FF柱对于葶苈子提取物中的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的提取纯化具有突出的实质性特点。
本发明所述葶苈子中槲皮素糖苷分离提取方法的纯化技术效果显著，提取的糖苷含量高达99.0%以上，符合国家中药对照品98.5%的技术要求。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (6)

1.一种葶苈子中槲皮素糖苷的纯化方法，包括如下步骤：
S1、取葶苈子种子与去离子水混合水浴加热提取，提取温度为80℃，水浴时间1～2h，重复提取三次后合并滤液，滤液浓缩后喷雾干燥得干燥后样品；
S2、取干燥后样品用60%乙醇超声溶解15～45min，静置20～30h后过滤，滤液浓缩后冻干，得冻干样品；
S3、取冻干样品用pH 4.5的酸水超声5min溶解，然后于活化的LX-68G型大孔树脂上样，上样后静置1～2h，去离子水洗脱1～2个柱体积后，依次用10%乙醇、20%乙醇梯度洗脱，洗脱流速为1～2mL/min，洗脱过程中HPLC实时检测，待HPLC图谱显示杂质峰值降低至其峰高最大值的1/10时换下一洗脱梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱液，浓缩后冻干得提取物；
S4、取提取物以30%甲醇配制浓度为0.06～0.08mg/mL的溶液，超声3～5min溶解后用滴管吸取后缓慢均匀的铺展于再生后的CM-琼脂糖凝胶FF柱表面， 30%甲醇在15～25mL/min流速下洗脱，HPLC实时检测槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量变化，当HPLC图谱显示有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，收集洗脱液，浓缩后冻干后得粗提物；
S5、取粗提物以30%甲醇超声溶解，选用LC3000制备型液相在254nm下用30%甲醇以4mL/min洗脱至图谱显示无峰时上样洗脱，待制备型液相图谱显示有吸收峰时收集洗脱液，经HPLC检测洗脱液中成分为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷时，对此部分洗脱液浓缩冻干得精提物。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于S2中，超声功率为140～160Hz。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于S2中，过滤选用的纱布为200目。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于S3中，液相条件为：C18反向色谱柱250*4.6mm,5μm；进样量为20μL；流动相为：乙腈：0.1%冰乙酸=10：90；检测时间：20min；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：254nm。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于S3中，pH 4.5的酸水配制是以稀盐酸进行调节的。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于S4中，收集洗脱液时，以每50mL为一单位收集洗脱液并测定其成分。
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