CN113144278A - 可注射可降解的抗菌peg水凝胶创面修复敷料材料及其制备方法和应用 - Google Patents

可注射可降解的抗菌peg水凝胶创面修复敷料材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可注射可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料及其制备方法和应用，所述方法步骤为：将不可降解交联剂和可水解降解交联剂与交联单体4‑arm‑PEG‑MAL在反应温度下，在溶剂中通过发生Michael加成反应，制得一种可注射且可降解的PEG水凝胶；其中，该PEG水凝胶具备可注射、自身能够被水解降解、有一定的抗菌性能、能够降低创面附近炎症反应、且能促进创面周围血管生成。本发明的PEG水凝胶具有孔洞结构均一、生物相容性好、成胶速度快、力学性能较好、无毒、能促进细胞增殖和迁移、具有较好的抑菌作用，能够降低创面附近炎症反应、促进创面周围血管生成，可作为创面修复材料的优点。

Description

可注射可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用高分子材料领域，尤其涉及一种可注射可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料及其制备方法和应用。
背景技术
目前，伤口治疗有两种主要类型：一种是非手术治疗，另一种是手术治疗。非手术治疗往往会使伤口迁延难愈，因此患者需要面对更长的医疗干预措施。皮瓣移植等外科手术治疗会对患者供体皮瓣附近的健康组织造成一定程度的损害。另外，非手术治疗和手术治疗都需要面对例如伤口感染等一些问题。理想的外科伤口敷料应具有抗菌性能。迄今为止，伤口敷料的大多数抗菌特性是由银化合物、抗生素、碘、苯扎氯铵和其他所载药物所提供。但是，在生物医学中使用的银化合物的安全性仍然是一个严重的问题。另外，最常用的抗生素制剂缺乏广谱抗菌活性，并且当与敷料结合时通常在初始状态表现出爆发释放。相比之下，具有固有抗菌特性的敷料材料则更具吸引力。为了克服上述缺点，已经开发了通过使用与组织工程有关的支架材料来使组织再生的方法。
在过去的十年中，组织工程作为传统组织再生方法的替代方法引起了极大的关注，并且在该领域内做出了巨大的尝试来合成和制造可以改善组织再生的支架。水凝胶是一种具有轻度交联的三维网络结构的亲水性聚合物材料，众所周知，该材料可吸收和保留大量水，同时保持其自身的结构不溶于水。由于其出色的特性，例如出色的吸水率和保水性、良好的生物相容性、和载药量而不会损失活性，水凝胶已被广泛用作组织工程支架材料，尤其是在伤口愈合中应用。对于伤口愈合，水凝胶可为伤口部位提供潮湿的环境，吸收渗出液，并清理局部环境以加速愈合而不会引起毒性。聚乙二醇(PEG)是制备水凝胶的最重要原料之一。它具有无毒、免疫原性低、生物相容性好等特点，可以通过肾脏***而不会在体内积聚。在组织工程中，随着细胞迁移和合成新的细胞外基质而被降解和重塑的支架被认为更有利于长期组织再生。水凝胶的降解特性通常可以通过在水凝胶主体结构中引入可水解降解基团或可酶解降解基团来实现。
发明内容
针对水凝胶存在的上述问题，本发明提供了一种生物相容性好、无细胞毒性、可促进细胞增殖和迁移、自身具有一定抗菌作用、成胶快、力学性能胶好、可水解降解的水凝胶创面修复敷料材料。
具体技术方案如下：
可注射可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料的制备方法，包括以下步骤：将不可降解交联剂HS-PEG-SH和可水解降解交联剂PEG-diester-dithiol与交联单体4-arm-PEG-MAL在反应温度下，在溶剂中通过发生Michael加成反应，制备得到可注射可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料，其中，水凝胶的降解时间由可水解降解交联剂PEG-diester-dithiol的含量进行调控。
进一步的，可水解降解交联剂PEG-diester-dithiol的含量为1％～100％。
进一步的，4-arm-PEG-MAL中功能基-MAL与交联剂中功能基-SH的摩尔比为1:1。
进一步的，具体步骤还包括，将交联单体4-arm-PEG-MAL与PEG-dithiol及PEG-diester-dithiol混合形成的交联剂分别溶解于含4mM TEA的PBS缓冲液中。
进一步的，反应温度为37℃，交联时间为1-10min。
所述的可注射且可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料作为促进创面修复的敷料材料的应用。
可注射且可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料，由上述制备方法制备得到。
上述方案的有益效果是：
1)、本发明的PEG水凝胶创面修复敷料材料具有孔洞结构均一、生物相容性好、无细胞毒性、成胶快、力学性能较好的优点；
2)、本发明的PEG水凝胶创面修复敷料材料具有促进细胞增殖和迁移的作用；
3)、本发明的PEG水凝胶创面修复敷料材料自身具有抗菌的特性；
4)、本发明的PEG水凝胶创面修复敷料材料能够降低创面附近炎症反应、促进创面周围血管生成；
5)、本发明的PEG水凝胶创面修复敷料材料可以通过调节水凝胶的降解速率而调控其降解周期。
附图说明
图1为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶的成胶效果图；
图2为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶的Ellman实验图；
图3为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶的流变测试图；
图4为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶的红外图谱；
图5为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶及其降解的扫描电镜图；
图6为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶的体外降解速折线图；
图7为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶的体外生物相容性实验图；
图8为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶的划痕愈合实验图；
图9为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶的抗菌实验效果图；
图10为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶的小鼠体内创面愈合实验图；
图11为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶的组织切片的HE染色和Masson染色图；
图12为本发明的实施例中提供的PEG水凝胶的免疫荧光染色图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
一种可注射且可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料，其制备方法包括如下步骤：将市购的交联单体4-arm-PEG-MAL与交联剂(由PEG-dithiol及PEG-diester-dithiol混合形成，其中功能基-MAL与功能基-SH的摩尔比为1:1)分别溶解于含4mM TEA的PBS缓冲液中，使它们充分的混合均匀，随后将交联剂和交联单体的三乙醇胺溶液转移至500μL模具中，在37℃生化培养箱中反应10min中，得一种可注射且可降解的抗菌PEG水凝胶。
本发明的实施例1-3及对比例中各参数如下表所示：
Figure BDA0002947411570000051
本发明中，交联剂中PEG-diester-dithiol的物质的量百分比可为1～100％，可以通过调节可降解交联剂和不可降解交联剂的比例来调节水凝胶的降解时间。将水凝胶作为创面敷料时，可根据创面愈合的大致时间来选用不同的可降解交联剂和不可降解交联剂的比例，一般而言，对于糖尿病等慢性伤口，可选用实施例1，对于刀伤枪伤等急性伤口，可选用实施例3，如无特殊要求，可直接选用实施例2，下文以实施例2为例研究其结构及性能。
以实施例2为例研究其结构及性能。
由图1所示，在混合交联剂和交联单体后成胶过程随即开始，大约十分中时即不随重力流动，图2的Ellman实验结果和图3所示的流变实验结果进一步证明了其成胶时间。图2中，在混合交联剂和交联单体到第十分钟时，体系中游离巯基的含量减小程度极快，到60分钟时趋于稳定。图3所示的流变实验结果同样表明在一小时左右，水凝胶的储能模量达到最大值。
图4所示为原料及PEG水凝胶的红外谱图，红外结果表明其反应完全、水凝胶交联充分。
图5所示为水凝胶及其在第7天、第14天、第21天的降解产物的扫描电镜图像，由图所示，本发明提供的PEG水凝胶均呈多孔海绵状结构，且其孔径均匀统一，平均孔径尺寸在10～30μm之间，具有较大的孔隙率。
降解曲线由图6所示，降解实验步骤如下：将PEG水凝胶冷冻干燥，准确称量其重量，然后将干燥的水凝胶加入完全培养基中，置于37℃转速为200R/min的恒温摇床中，在设定的时间点取出，蒸馏水漂洗，冷冻干燥，称重，计算每组水凝胶在溶液中的累积降解百分率(％)＝(降解前水凝胶重量-降解后水凝胶质量)/降解前水凝胶重量×100％，为了确保实验准确性，每组水凝胶取3个测试样，三个测试样取平均值。
由图7所示，本发明采用人类永生化角质形成细胞根据国标推荐的方法采用浸提液毒性实验研究了PEG水凝胶原料、材料及降解产物的生物相容性，其中，设置阴性对照组聚丙烯(PP)、阳性对照组苯酚(Phenol)。
由图8所示，通过划痕愈合实验探讨了本发明所提供的PEG水凝胶对细胞迁移的的影响，结果表明该水凝胶能显著促进人类永生化角质形成细胞的迁移。
抗菌实验结果由图9所示，蓝色虚线圆圈内的区域为抑制区。在本实验中设置了负载有庆大霉素(40000U/mL)的PEG水凝胶作为实验组，进一步探讨其负载药物之后的抗菌能力。结果表明，未负载抗生素的PEG水凝胶本身具有一定的抗菌能力，对普通的革兰氏阴性菌和革兰氏阴性菌均具有明显的抑制作用，与覆盖浸有抗生素滤纸的阳性对照组相比，未负载抗生素的PEG水凝胶显示出对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制作用，抗菌效率分别为64.1％和93.5％。实验结果还表明，在负载庆大霉素后，水凝胶的抗菌能力明显增强，抑菌环更大且抑菌时间更长，同时，在负载到PEG水凝胶内部之后，庆大霉素的功能及活性未受影响。从以上结果可知，PEG水凝胶可以作为能搭载药物且其自身具有一定抗菌能力的创面敷料材料，在搭载药物的过程中不会对药物的结构和功能产生不利影响。
以SD大鼠为创面愈合模型进行体内实验进一步探讨本发明所提供的PEG水凝胶对创面愈合的影响。由图10所示，切口后第7天、第10天和第14天，用PEG水凝胶和负载有庆大霉素的PEG水凝胶覆盖的创面区域均小于PBS覆盖的创面区域，一些覆盖PEG水凝胶的大鼠创面在手术后第14天完全愈合，而对照组中没有一个完全愈合。体内实验结果表明，无论是否负载庆大霉素，PEG水凝胶均能对创面愈合起到促进作用。
图11所示为大鼠创面附近组织切片的H&E染色(A)和Masson染色(B)图像，组织学分析表明，经PEG水凝胶和负载庆大霉素的PEG水凝胶处理后，大鼠创面的再上皮化过程得到明显改善，且与对照组相比，用PEG水凝胶或负载庆大霉素的PEG水凝胶处理后大鼠创面中的炎性细胞浸润较少。Masson染色结果表明，用PEG水凝胶或负载庆大霉素的PEG水凝胶处理后大鼠创面区域有更多的胶原蛋白沉积，这也是促进创面愈合的另一个最重要的指标。
通过免疫荧光染色分析研究创面区域附近的炎症反应和血管生成情况，图12所示为免疫荧光染色图像。其中，选择肿瘤坏死因子α(TNF-α)作为标记物，以研究其炎症反应情况。如图所示，红色荧光为TNF-α，蓝色荧光(DAPI)为细胞核，可以清楚地看出对照组中TNF-α的荧光强度高于PEG组和庆大霉素-PEG组，表明PEG水凝胶可以减轻创面周围的炎症反应程度。同时，选择血管内皮生长因子(VEGF)作为标志物来分析创面附近血管生成情况，如图所示，红色荧光为VEGF，蓝色荧光(DAPI)为细胞核，与对照组相比，可以明显观察到VEGF在PEG组和庆大霉素-PEG组中有更高水平的表达，进一步表明PEG水凝胶可以促进创面附近VEGF的表达并促进创面附近组织的生长和恢复。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.可注射可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将不可降解交联剂HS-PEG-SH和可水解降解交联剂PEG-diester-dithiol与交联单体4-arm-PEG-MAL在反应温度下，在溶剂中发生Michael加成反应，制备得到可注射可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料，其中，水凝胶的降解时间由可水解降解交联剂PEG-diester-dithiol的含量进行调控。
2.根据权利要求1所述的可注射可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料的制备方法，其特征在于，可水解降解交联剂PEG-diester-dithiol的含量为1％～100％。
3.根据权利要求1所述的可注射可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料的制备方法，其特征在于，4-arm-PEG-MAL中功能基-MAL与交联剂中功能基-SH的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求1所述的可注射可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料的制备方法，其特征在于，具体步骤还包括，将交联单体4-arm-PEG-MAL与PEG-dithiol及PEG-diester-dithiol混合形成的交联剂分别溶解于含4mM TEA的PBS缓冲液中。
5.根据权利要求1所述的可注射可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料的制备方法，其特征在于，反应温度为37℃，交联时间为1-10min。
6.可注射且可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到。
7.权利要求6所述的可注射且可降解的抗菌PEG水凝胶创面修复敷料材料作为促进创面修复的敷料材料的应用。
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