CN113142055B - 一种香蕉种质资源离体增殖的保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香蕉种质资源离体增殖的保存方法，该方法在室温18～32℃条件下，应用多种植物生长调节剂不同浓度组合配制出的离体保存培养基，让香蕉吸芽或丛生芽在培养基中缓慢增殖生长，芽壮，每个转接周期的时间长，最长达17个月。该方法不仅节省了转接所需的材料费、人工费，还节省了培养室内空调的电费等，且保存的香蕉种质资源因不受低温及抑制剂或延缓剂的影响，长势好，离体培养结束后，种苗在大田种植中农艺性状稳定，可正常开花结果。本发明方法具有操作简单、成本低等优点，是一种安全高效的香蕉种质资源离体保存的方式。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是一种香蕉种质资源离体增殖的保存方法。
背景技术
香蕉是世界上主要水果作物和重要粮食作物之一，也是中国最重要的热带、亚热带水果。香蕉种植历史悠久，但产业发展中存在栽培品种单一化以及病虫害、冷害等生物和非生物逆境胁迫等问题，应用种质创新出诸多抗逆性强的新品系，丰富香蕉种质资源，是解决产业问题的有效途径。种质资源作为香蕉科技创新和现代种业发展的物质基础，收集、保存及利用好种质资源，对于香蕉产业发展尤为重要。
一般作物的种质资源保存分为种子、田间和离体培养三种保存方式。香蕉种质资源长期有效保存的方法探索：首先，种子保存不适用于香蕉种质资源，因为用于生产的香蕉品种为三倍体，一般不产生种子，以无性繁殖方式繁育种苗；其次，田间保存占用大量的土地和劳动力，成本高，且易受外界不利因素影响，造成香蕉种质资源流失；第三，离体培养保存常用于香蕉种质资源保存，培养条件可控，占用面积小，还可避免田间诸多不利因素，但由于香蕉的继代培养周期时间短，仅为20天左右，频繁转接，易造成培养苗的代数过高，增加了种质资源变异的几率。
目前，香蕉种质资源离体培养保存，常以抑制组培苗生长来达到较长时间保存的目的，以低温与生长抑制剂或延缓剂结合的方法最为常用。然而香蕉属于热带作物，对低温敏感，易受到冷害。因此，香蕉组培苗在低温加抑制剂或延缓剂环境影响下长时间的培养保存，芽的基部褐化变黑现象严重，生长点易受伤害，基本无增殖，长势差，电费成本较高；且香蕉种质资源在结束离体保存时还能否正常生根与大田生长也都是值得关注的问题。
发明内容
针对上述香蕉种质资源离体培养保存中存在的问题，本发明提供一种香蕉种质资源离体增殖的保存方法，该方法在室温条件下（18～32℃），应用多种植物生长调节剂不同浓度组合配制出的离体保存培养基，让香蕉吸芽或丛生芽在培养基中缓慢增殖生长，芽壮，每个转接周期的时间长，最长达17个月。该方法不仅节省了转接所需的材料费、人工费，还节省了培养室内空调的电费等，且保存的香蕉种质资源因不受低温及抑制剂或延缓剂的影响，长势好，离体培养结束后，种苗在大田种植中农艺性状稳定，可正常开花结果。
实现本发明目的的技术方案是：
一种香蕉种质资源离体增殖的保存方法，包括以下步骤：
（1）外植体处理及丛生芽诱导：
取无病虫害且健壮的香蕉吸芽，用刀削去外层，留最大处直径为10 cm的吸芽，将吸芽外表喷洒75%酒精灭菌后，在超净工作台上，再用刀将香蕉吸芽外层削去，剥成最大处直径2 cm的嫩小吸芽，切去顶部1/3，剩下的吸芽平均切分成两半，接入丛生芽诱导培养基中培养；3个月时，吸芽生长点处长出1个小芽；6个月时，芽长大，基部开始长出小芽，17个月时形成丛生芽；
所述丛生芽诱导培养基为：MS+芸苔素内酯0.1 mg/L+ 6-BA 0.3 mg/L + TDZ 0.2mg/L+ZT 0.2 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（2）丛生芽离体保存培养：
在超净工作台上，将丛生芽切分成2～3个芽为一小丛，接入离体保存的培养基中培养；2个月至4个月时，小芽慢慢长高长壮，基部长有少量根；5个月至17个月时，从芽的基部不断长出新芽，芽缓慢长大、长壮，抽出叶片，叶片展开，根系不断长长，达到营养供给与生长需求的平衡，苗的叶色青绿，长势好；每12-17个月为一个周期进行转接，周而复始；
所述离体保存培养基为：MS+ DA-6 0.05～0.5 mg/L+ ZT 0.05～0.3 mg/L +TDZ0.05～0.3 mg/L+ KT0.05～0.5 mg/L + 2,4-D 0.05～0.5 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂5g/L，pH值为6.0；
所述离体保存培养基优选为：MS+ DA-6 0.2 mg/L+ ZT 0.1 mg/L + TDZ0.1 mg/L+ KT 0.2 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0。
步骤（1）和（2）中的培养：培养温度为18～32℃, 光照时间为12 h/d, 光照强度为500lx。
所述培养基中，MS为基本培养基，DA-6为胺鲜酯，ZT为玉米素，TDZ为噻重氮苯基脲，KT为激动素， 2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
本发明香蕉种质资源离体增殖的保存方法中，植物生长调节剂的作用：芸苔素内酯具有促进生长，增加叶片厚实度，改善品质作用；DA-6能提高植物过氧化物酶和硝酸还原酶的活性，提高叶绿素的含量，加快光合速度，促进植物细胞的***和生长，促进根系的发育，调节体内养分的平衡；6-BA具有促进芽的形成，诱导愈伤组织发生，提高叶片的品质等功效；ZT能促进植物细胞***，阻止叶绿素和蛋白质降解，减慢呼吸作用，保持细胞活力，延缓植株衰老；TDZ能刺激体内生长素类物质合成，诱导不定芽发生和根部组织的再生作用；KT具有促进细胞***的作用，还能延缓离体叶片和切花衰老，诱导芽分化和发育及增加气孔开度的作用；2，4-D可以刺激植物生长，影响新陈代谢，使刺激部分生理机能旺盛等功效。
在初代丛生芽诱导中，植物生长调节剂芸苔素内酯、6-BA、TDZ、ZT、2,4-D共同作用，将香蕉吸芽缓慢诱导出丛生芽。在香蕉丛生芽离体保存培养中，植物生长调节剂DA-6、ZT、TDZ、KT、2,4-D共同作用，调控香蕉丛生芽内源激素变化，达到缓慢地生长和增殖目的。
本发明方法具有操作简单、成本低等优点，是一种安全高效的香蕉种质资源离体保存的方式。
本发明香蕉种质资源离体增殖的保存方法与常规香蕉组培苗在低温加抑制剂或延缓剂结合的保存方法比较，效率提高了60%以上，二种方法的不同点在于：
（1）每个转接周期时间不同：本发明方法为12-17个月，常规方法为8-10个月；
（2）培养成本不同：由于本发明方法转接次数少，所以培养基、人工和空调电费等成本均可降低，且保存时间更长，苗变异率更低；
（3）苗的长势不同：采用本发明方法，苗的长势好，常规方法苗较弱。
本发明方法突破传统思维，是一种经济实惠、安全有效、具有变革性的香蕉种质资源离体保存方法。
附图说明
图1为采用实施例3香蕉离体保存方法，培养17个月的香蕉组培苗的长势照片。
图2为采用常规香蕉离体保存方法，培养8个月的香蕉组培苗的长势照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例1
一种香蕉种质资源离体增殖的保存方法，包括以下步骤：
（1）外植体处理及丛生芽诱导：取无病虫害且健壮的香蕉吸芽，用刀削去外层，剥出最大处直径为10 cm的吸芽；将吸芽外表喷洒75%酒精灭菌后，在超净工作台上，再用刀将香蕉吸芽外层削去，剥出最大处直径为2 cm的嫩吸芽，切去顶部1/3，剩下的吸芽平均切分成两半，接入丛生芽诱导培养基中培养；3个月时，吸芽生长点处长出1个小芽；6个月时，芽长大，基部开始长出小芽，17个月时形成有6个芽左右的丛生芽；
所述丛生芽诱导培养基为：MS+芸苔素内酯0.1 mg/L+ 6-BA 0.3 mg/L + TDZ 0.2mg/L+ ZT 0.2 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（2）丛生芽离体保存培养：在超净工作台上，将丛生芽切分成2～3个芽为一小丛，接入离体保存的培养基中培养；4个月时，小芽慢慢长高长壮，长有少量根；5个月至14个月时，从芽的基部不断长出新芽，芽缓慢长大、一般壮，叶片展开，根系细长，苗的叶色青黄色，长势一般，有部分老叶片变黄；每14个月为一个周期进行转接，周而复始；
所述离体保存培养基为：MS+ DA-6 0.05 mg/L+ ZT 0.05 mg/L + TDZ0.05 mg/L+KT 0.05 mg/L + 2,4-D 0.05 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
步骤（1）和（2）中的培养：培养温度为18～32℃, 光照时间为12 h/d, 光照强度为500lx。
实施例2
一种香蕉种质资源离体增殖的保存方法，包括以下步骤：
（1）外植体处理及丛生芽诱导：取无病虫害且健壮的香蕉吸芽，用刀削去外层，剥出最大处直径为10 cm的吸芽；将吸芽外表喷洒75%酒精灭菌后，在超净工作台上，再用刀将香蕉吸芽外层削去，剥出最大处直径为2 cm左右的嫩吸芽，切去顶部1/3，剩下的吸芽平均切分成两半，接入丛生芽诱导培养基中；3个月时，吸芽生长点处长出1个小芽；6个月时，芽长大，基部开始长出小芽，17个月时形成有6个芽左右的丛生芽；
所述丛生芽诱导培养基为：MS+芸苔素内酯0.1 mg/L+ 6-BA 0.3 mg/L + TDZ0.2mg/L+ ZT 0.2 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（2）丛生芽离体保存培养：在超净工作台上，将丛生芽切分成2～3个芽为一小丛，接入离体保存的培养基中培养；2个月时，小芽慢慢长高长壮，长有较多不定根；3个月至12个月时，从芽的基部不断长出新芽，芽缓慢长大、芽壮，叶片展开，根系粗长，苗的叶色青绿色，长势好，老叶片变黄较多；每12个月为一个周期进行转接，周而复始；
所述离体保存培养基为：MS+ DA-60.5 mg/L+ ZT 0.3 mg/L + TDZ0.3 mg/L+ KT0.5 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
步骤（1）和（2）中的培养：培养温度为18～32℃, 光照时间为12 h/d, 光照强度为500lx。
实施例3
一种香蕉种质资源离体增殖的保存方法，包括以下步骤：
（1）外植体处理及丛生芽诱导：取无病虫害且健壮的香蕉吸芽，用刀削去外层，剥出最大处直径为10 cm的吸芽；将吸芽外表喷洒75%酒精灭菌后，在超净工作台上，再用刀将香蕉吸芽外层削去，剥出最大处直径为2 cm的嫩吸芽，切去顶部1/3，剩下的吸芽平均切分成两半，接入丛生芽诱导培养基中；3个月时，吸芽生长点处长出1个小芽；6个月时，芽长大，基部开始长出小芽，17个月时形成有6个芽左右的丛生芽；
所述丛生芽诱导培养基为：MS+芸苔素内酯0.1 mg/L+ 6-BA 0.3 mg/L + TDZ0.2mg/L+ ZT 0.2 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（2）丛生芽离体保存培养：在超净工作台上，将丛生芽切分成2～3个芽为一小丛，接入离体保存的培养基中培养；4个月时，小芽慢慢长高长壮，长有较多不定根；5个月至17个月时，从芽的基部不断长出新芽，芽缓慢长大、芽壮，叶片展开，根系粗长，苗的叶色青绿色，长势好，黄叶少，如图1所示；每17个月为一个周期进行转接，周而复始；
所述离体保存培养基为：MS+ DA-6 0.2 mg/L+ ZT 0.1 mg/L + TDZ0.1 mg/L+ KT0.2 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
步骤（1）和（2）中的培养：培养温度为18～32℃, 光照时间为12 h/d, 光照强度为500lx。
对比实验例：
采用常规方法，将香蕉组培苗在18℃，培养基中加入甘露醇和卡那霉素，培养8个月后，香蕉组培苗的长势照片，如图2所示，芽的基部褐化变黑，基本无增殖，长势差。
Claims (1)
1.一种香蕉种质资源离体增殖的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体处理及丛生芽诱导：
取无病虫害且健壮的香蕉吸芽，削去外层，留最大处直径为10 cm的吸芽，将吸芽外表喷洒75%酒精灭菌后，在超净工作台上，再将香蕉吸芽外层削去，剥成最大处直径2-3 cm的嫩小吸芽，切去顶部1/3，剩下的吸芽平均切分成两半，接入丛生芽诱导培养基中培养，直到形成丛生芽；
所述丛生芽诱导培养基为：MS+芸苔素内酯0.1 mg/L+ 6-BA 0.3 mg/L + TDZ 0.2 mg/L+ZT 0.2 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（2）丛生芽离体保存培养：
在超净工作台上，将丛生芽切分成2～3个芽为一小丛，接入离体保存的培养基中培养；4个月时，小芽长高长壮，基部长有少量根；5个月至17个月时，丛 芽的基部不断长出新芽，芽长大、长壮，抽出叶片，叶片展开，根系不断长长，达到营养供给与生长需求的平衡，苗的叶色青绿，长势好；每17个月为一个周期进行转接，周而复始；
所述离体保存培养基为：MS+ DA-6 0.2 mg/L+ ZT 0.1 mg/L + TDZ 0.1 mg/L+ KT0.2 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
步骤（1）和（2）中的培养：培养温度为18～32℃，光照时间为12 h/d，光照强度为500lx。
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