CN113122563B - 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明通过基因工程构建了一种R‑3‑氨基丁酸生产菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22076。本发明的R‑3‑氨基丁酸生产菌能够通过发酵直接产生R‑3‑氨基丁酸，开发应用前景广阔。

Description

构建R-3-氨基丁酸生产菌的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种能够通过发酵直接产生R-3-氨基丁酸的基因工程生产菌及其构建方法。
背景技术
R-3-氨基丁酸，CAS号3775-73-3，是合成抗HIV新药度鲁特韦的重要中间体，目前该化合物的合成方法主要有化学合成法和酶催化法。化学合成法反应条件苛刻，需要使用大量化工原料，成本较高，重金属污染，不利于工业化大生产。酶催化法，一般需要使用化工原料丁烯酸做底物，经天冬氨酸酶或突变体可以制备R-3-氨基丁酸。两种工艺均对化工原料生产供应有高度的依赖型。
以经济的微生物发酵法生产R-3-氨基丁酸是一种值得探索的研究方向。迄今为止，尚没有通过发酵法生产R-3-氨基丁酸的文献报道。因此，构建能够直接生物合成R-3-氨基丁酸的工程菌具有挑战性，将会是一种走向工业化应用的技术突破。
发明内容
为了研究发酵法生产R-3-氨基丁酸的可行性，发明人通过代谢工程来改造工业上最常用的基因工程菌宿主大肠杆菌，使得大肠杆菌过表达下列酶的基因：3-酮硫裂解酶(phbA)或乙酰乙酰辅酶合成酶(atoB)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase)、硫酯酶(thioesterase)、氨基裂合酶或称天冬氨酸氨裂合酶(AspB)，以便实现R-3-氨基丁酸的生物合成，最终获得了一株能够产生R-3-氨基丁酸的工程菌。具体而言，本发明包括如下技术方案。
一种构建R-3-氨基丁酸生产菌的方法，其包括以下步骤：
A.构建用于实现巴豆酸(又名丁烯酸)合成的质粒A，其包含下述酶的基因：
3-酮硫裂解酶(PhbA)或者乙酰乙酰辅酶合成酶(AtoB)，
乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)，
巴豆酸酶(crotonase，Crt，又称烯酰水合酶、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶，3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase)，以及
硫酯酶(thioesterase，YdiI)，
该质粒A可以在微生物比如大肠杆菌中构建巴豆酸(丁烯酸)合成途径；
B.构建用于表达氨基裂合酶，优选天冬氨酸氨裂合酶(AspB)的质粒B；
C.将对步骤A中所构建的质粒A和步骤B中所构建的质粒B共转入大肠杆菌中，得到同时表达3-酮硫裂解酶(phbA)或乙酰乙酰辅酶合成酶(atoB)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)、巴豆酸酶(Crt)、硫酯酶(YdiI)和氨基裂合酶(优选天冬氨酸氨裂合酶AspB)基因的阳性克隆；
D.从步骤C中所构建的阳性克隆中，筛选出生产R-3-氨基丁酸的菌株。
其中，上述质粒A的构建可以包括下述步骤：
A-1.将3-酮硫裂解酶基因phbA、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB、巴豆酸酶基因crt和硫酯酶基因ydiI用核糖体结合位点(ribosomebinding site，RBS)序列rbs串联起来，得到表达这4个基因的表达元件phbA-phbB-crt-ydiI；
A-2.将步骤A-1中所构建的表达元件phbA-phbB-crt-ydiI装载到载体pTrcHis2B的BamH1/HindIII位点之间，Trc启动子下游，获得pTrcHis2B-ABcy质粒即质粒A。
上述步骤C中的质粒转入可以是氯化钙转化法或电转化，优选电转化。
优选地，上述3-酮硫裂解酶(PhbA)基因为NCBI:J04987；
上述乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)基因为NCBI:L01112；
上述巴豆酸酶来源于贝氏梭状芽胞杆菌(Clostridium beijerinckii)，其基因编号为GenBank:AGF54251.1(KEGG，csr:Cspa_c04330 K01715)；
上述硫酯酶(thioesterase，YdiI)的基因为Gene ID:946190。
优选上述表达元件phbA-phbB-crt-ydiI的核苷酸序列是SEQ ID NO:1。
在一种实施方式中，上述质粒B的构建可以包括下述步骤：
将天冬氨酸氨裂合酶基因AspB克隆到载体pCDFDuet-1的NcoI/NotI位点之间，T7启动子下游，获得pCDF-AspB质粒。
优选上述天冬氨酸氨裂合酶AspB的基因为SEQ ID NO:2，其是专利文献CN110791493A中报道的(N142V、H188A)突变体基因SEQ ID NO:4，在本文实施例中也沿用称为AspB-11-D4。
相对应地，野生型天冬氨酸氨裂合酶在本文实施例中也沿用称为AspB1，其编码基因是SEQ ID NO:3，是专利文献CN110791493A中报道的密码子优化基因SEQ ID NO:2。
本发明的第二个目的在于提供一种R-3-氨基丁酸生产菌，其通过上述的方法构建和筛选得到。
该生产菌可以是基因工程中应用最广泛的宿主-大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)或者大肠杆菌MG1655。
优选的R-3-氨基丁酸生产菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.22076。
本发明的第三个目的在于提供上述R-3-氨基丁酸生产菌比如CGMCC No.22076用于生产R-3-氨基丁酸的用途。
具体地，可以通过上述R-3-氨基丁酸生产菌比如CGMCC No.22076的发酵来生产R-3-氨基丁酸。
其中，发酵时所用的培养基可以是任何适用于大肠杆菌生长发酵的培养基。例如，发酵培养基组成如下：125mM MOPS(pH7.4)，20g/L甘油或者葡萄糖，10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5mM泛酸钙，2.78mM Na2HPO4，5mM(NH4)2SO4，30mM NH4Cl，5g/L CaCO3。
优选地，上述发酵培养基中包含添加10μm IPTG。
发酵温度是优选37℃左右。
本发明构建的基因工程菌能够通过发酵来生产R-3-氨基丁酸，值得进一步开发利用，一起实现工业化生产。
本发明构建的R-3-氨基丁酸高产基因工程菌的拉丁学名是Escherichia coli，中文名称是大肠埃希氏菌，即，大肠杆菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2021年3月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22076。
附图说明
图1为本发明构建的生物合成R-3-氨基丁酸的代谢路线图。
图2为巴豆酸表达元件phbA-phbB-crt-ydiI的结构示意图。
图3是本发明构建的包含巴豆酸合成途径的质粒的结构示意图。
具体实施方式
本发明对大肠杆菌内在的代谢途径进行了改变，如图1所示，大肠杆菌利用葡萄糖可生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A在3-酮硫裂解酶(PhbA)或乙酰乙酰辅酶合成酶(AtoB)催化下，生成乙酰乙酰辅酶A，进一步经乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)催化生成3-羟基丁酰辅酶A，进一步经3-羟基丁酰辅酶A脱水酶即巴豆酸酶(Crt)催化生成巴豆酰辅酶A，巴豆酰辅酶A经硫酯酶(YdiI)催化生成巴豆酸即丁烯酸，巴豆酸经氨基裂合酶例如天冬氨酸氨裂合酶(AspB)催化可生成3-氨基丁酸。
这些过表达的酶PhbA或AtoB、PhbB、Crt、YdiI、AspB的基因可以分别单独地克隆在一个质粒上，然后分别地、或者同时地转入同一个大肠杆菌感受态细胞中；也可以将两个以上酶的基因克隆在一个质粒上，然后分别地、或者同时地转入同一个大肠杆菌感受态细胞中。
其中，可用的质粒载体包括pTrcHis2B、pCDFDuet-1等，但不限于此。
在一种优选的实施方式中，可以将PhbA或AtoB、PhbB、Crt、YdiI这4种酶的基因克隆在一个质粒上，构建出巴豆酸合成途径；并将氨基裂合酶例如AspB单独地克隆在一个质粒上，然后将两种质粒共转入大肠杆菌感受态细胞中。
例如，可以将PhbA、PhbB、Crt、YdiI这4种酶的基因用核糖体结合位点序列rbs串联起来，得到如图2所示的表达元件或称表达盒phbA-phbB-crt-ydiI。为描述方便起见，可以缩写为ABcy。
应理解，在构建表达这4种酶基因的表达元件时，它们之间的排序并非固定不变，它们可以交叉、颠倒，只要每个酶都能顺利实现充分表达即可。
在本文中，为了描述简便，有时会将某种酶比如PhbA与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于PhbA，用于描述3-酮硫裂解酶的功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该酶的基因。
研究中还发现，氨基裂合酶例如天冬氨酸氨裂合酶AspB的酶活力必须足够强，才能催化巴豆酸转化为3-氨基丁酸，打通完整的代谢路线。比如，野生型天冬氨酸氨裂合酶AspB1(编码基因SEQ ID NO:3)酶活力不够强，无法在大肠杆菌中实现巴豆酸至3-氨基丁酸的转化；但其(N142V、H188A)突变体AspB-11-D4(编码基因是SEQ ID NO:2)的酶活力显著高于野生酶，才实现了3-氨基丁酸的生物合成。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
包含AspB1基因片段的质粒模板pET24a-AspB1和包含AspB-11-D4-R基因片段的质粒模板pET24a-AspB-11-D4由浙江华睿生物技术有限公司惠赠。
培养基：
LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
摇瓶发酵方法：
发酵培养基：125mM MOPS(pH7.4)，20g/L甘油或者葡萄糖，10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5mM泛酸钙，2.78mM Na2HPO4，5mM(NH4)2SO4，30mM NH4Cl，5g/L CaCO3。
发酵步骤：
小摇瓶发酵：
1.单菌落LB试管培养过夜，1％接种15ml培养基中(25ml三角瓶)；
2.添加10μm IPTG，相对应的抗生素，37℃，200rpm，培养48h。
HPLC检测方法：
巴豆酸检测方法：安捷伦1260高效液相色谱仪；采用HPX-87H色谱柱，柱温箱35℃，以5mM硫酸为流动相，流速0.4ml/min，检测波长210nm，进样量5μl，运行32分钟。
R-3-氨基丁酸检测方法：安捷伦1260高效液相色谱仪；色谱柱：SB-Aq 4.6*250*5；流速：1mL/min；波长：205nm；柱温：30℃；进样量：5μl；流动相：NaH2PO4(0.75％)：乙腈＝85：15；稀释液：水；运行时间：10min。
实施例1：大肠杆菌中巴豆酸合成途径的构建
根据图1的途径设计，选取3-酮硫裂解酶(PhbA)基因为NCBI:J04987；乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)基因为NCBI:L01112；巴豆酸酶(Crt)基因为GenBank:AGF54251.1；硫酯酶(thioesterase，YdiI)的基因为Gene ID:946190。
根据基因表达所需的元件，串联rbs序列和基因序列，形成表达元件phbA-phbB-crt-ydiI，其结构如图2所示，其核苷酸序列是SEQ ID NO:1，送苏州金唯智公司进行全序列DNA合成。
DNA序列合成后，装载到载体pTrcHis2B的BamH1/HindIII位点之间，Trc启动子下游，获得pTrcHis2B-ABcy质粒，如图3所示。四个基因可以在trc启动子控制下实现转录表达。
实施例2：巴豆酸工程菌的发酵验证
使用电转化方法，将实施例1中构建的pTrcHis2B-ABcy质粒转入到大肠杆菌宿主BL21(DE3)(Invitrogen公司)感受态细胞中，获得pTrcHis2B-ABcy/BL21(DE3)工程菌。平板划线，挑取单克隆，进行摇瓶发酵，24h，取样检测，确定巴豆酸产量水平。参见表1，摇瓶发酵表达水平可达3g/L以上。
实施例3：R-氨基丁酸工程菌的构建
根据发明人的专利文献CN110791493A，分别选择野生型天冬氨酸氨裂合酶AspB1基因序列(本文中序列号是SEQ ID NO:3)和其(N142V、H188A)突变体AspB-11-D4基因序列(本文中序列号是SEQ ID NO:2)，克隆到载体pCDFDuet-1的NcoI/NotI位点之间，使用载体上的T7启动子控制转录表达。分别获得用于表达天冬氨酸氨裂合酶AspB的质粒pCDF-AspB1和质粒pCDF-AspB-11-D4。包括如下步骤。
3.1设计如下引物对AspB1-F/AspB1-R：
AspB1-F：aaaccatggATGAACACCGACGTTCGTATCG；
AspB1-R：cccgcggccgcTTTACGACCAGCGATACCCG。
使用引物AspB1-F和AspB1-R扩增AspB1基因片段，PCR反应体系包括：10ng浙江华睿生物技术有限公司惠赠的质粒模板pET24a-AspB1，50pmol一对引物AspB1-F和AspB1-R，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(fermentas公司)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。
胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)PCR扩增片段，进行NcoI/NotI双酶切后，片段与经相同双酶切处理的pCDFDuet-1载体进行连接，完成pCDF-AspB1质粒构建。
3.2设计如下引物对AspB-11-D4-F/AspB-11-D4-R：
AspB-11-D4-F：aaaccatggATGAACACCGACGTTCGTAT；
AspB-11-D4-R:cccgcggccgcTTATTTACGACCAGCGATAC。
使用引物对AspB-11-D4-F/AspB-11-D4-R扩增AspB-11-D4-R基因片段，PCR反应体系包括：10ng浙江华睿生物技术有限公司惠赠的质粒模板pET24a-AspB-11-D4，50pmol一对引物AspB-11-D4-F/AspB-11-D4-R，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(fermentas公司)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。
胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)PCR扩增片段，进行NcoI/NotI双酶切后，片段与经相同双酶切处理的pCDFDuet-1载体进行连接，完成pCDF-AspB-11-D4质粒构建。
3.3使用电转化方法，将质粒pCDF-AspB1与实施例1中得到的质粒pTrcHis2B-ABcy共同转入到大肠杆菌宿主BL21(DE3)(Invitrogen公司)感受态细胞中，获得工程菌株pTrcHis2B-ABcy&pCDF-AspB1/BL21(DE3)。
使用电转化方法，将质粒pCDF-AspB-11-D4与实施例1中得到的质粒pTrcHis2B-ABcy共同转入到大肠杆菌宿主BL21(DE3)(Invitrogen公司)感受态细胞中，获得工程菌株pTrcHis2B-ABcy&pCDF-AspB-11-D4/BL21(DE3)。
实施例4：R-氨基丁酸工程菌的发酵验证
分别在不表达ABcy的空白质粒pTrcHis2B对照菌株pTrcHis2B/BL21(DE3)、表达ABcy但不表达AspB的菌株pTrcHis2B-ABcy/BL21(DE3)、不表达ABcy和AspB的空白质粒对照菌株pTrcHis2B&pCDFDuet-1/BL21(DE3)、表达ABcy和野生型AspB1的菌株pTrcHis2B-ABcy&pCDF-AspB1/BL21(DE3)、表达ABcy和突变酶AspB-11-D4的菌株pTrcHis2B-ABcy&pCDF-AspB-11-D4/BL21(DE3)的LB培养平板上挑取单菌落，接种至5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。然后1v/v％接种装有15ml培养基的25ml三角瓶中，于37℃，250rpm培养2-3h，至OD600 0.6-0.8时，添加10μm IPTG，50μg/mL硫酸卡那霉素，于37℃，200rpm，培养48h。然后于4℃，10000rpm，离心10min，检测发酵液上清液中巴豆酸和R-3-氨基丁酸产量水平。结果列于表1中。
表1、不同菌株发酵液中巴豆酸和R-3-氨基丁酸的含量
上述实验结果表明，本发明的代谢工程途径是可行的，四种酶PhbA、PhbB、Crt、YdiI的过表达能够实现大肠杆菌发酵法生产巴豆酸(丁烯酸)；五种酶PhbA、PhbB、Crt、YdiI、AspB的过表达能够实现大肠杆菌发酵法生产3-氨基丁酸，但前提是天冬氨酸氨裂合酶AspB的酶活力必须足够大，才能打通大肠杆菌内巴豆酸转化为3-氨基丁酸的生物合成步骤，否则只能停留在巴豆酸的生物合成阶段。
本发明构建的菌株pTrcHis2B-ABcy&pCDF-AspB-11-D4/BL21(DE3)具有R-3-氨基丁酸生产能力，能够实现发酵液中R-3-氨基丁酸的积累，具有工业化开发前景，已对其进行菌种保藏，保藏编号为CGMCC No.22076。
序列表
<110> 洛阳华荣生物技术有限公司
<120> 构建R-3-氨基丁酸生产菌的方法
<130> SHPI2110068
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3201
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gagctcagga ggtaaaaaaa catgaccgac gttgttattg tgagtgcggc ccgtacggcc 60
gtgggcaaat tcggtggcag tctggcgaaa attccggccc cagaactggg tgcggttgtt 120
atcaaggcgg cgctggaacg tgcgggtgtg aaaccggagc aagttagtga ggtgatcatg 180
ggccaagttc tgacggccgg tagtggtcag aatccagcgc gccaagccgc gatcaaagcg 240
ggtctcccag cgatggtgcc agcgatgacg atcaacaagg tttgtggcag cggcctcaaa 300
gccgttatgc tggcggcgaa cgcgattatg gccggtgatg ccgagatcgt tgttgccggc 360
ggccaagaaa acatgagtgc ggcgccgcat gttctgccgg gcagccgtga tggcttccgc 420
atgggcgacg cgaaactggt tgacaccatg attgtggacg gtctgtggga cgtgtacaac 480
cagtatcaca tgggtattac ggccgagaac gtggcgaaag agtatggcat cacccgcgaa 540
gcccaagatg agttcgccgt tggtagccag aacaaagccg aggcggccca gaaagccggc 600
aagttcgatg aggagatcgt gccagtgctg atcccacagc gcaagggcga tccggtggcg 660
ttcaaaacgg acgagtttgt tcgccaaggc gcgacgctgg atagtatgag cggtctgaaa 720
ccagccttcg acaaagccgg taccgtgacc gcggcgaatg ccagtggtct gaatgatggt 780
gccgcggcgg ttgttgttat gagcgccgcc aaggccaaag aactgggtct gaccccactg 840
gcgacgatca agagctacgc caatgccggc gttgatccga aagttatggg catgggcccg 900
gttccagcga gtaaacgtgc gctgagtcgt gcggaatgga ccccgcaaga tttggatctg 960
atggagatca atgaggcgtt tgcggcccaa gcgctcgccg ttcaccagca gatgggctgg 1020
gacaccagca aggtgaatgt gaatggtggc gccattgcga tcggtcaccc gattggtgcg 1080
agcggttgtc gtattctggt gacgctgctg cacgagatga agcgtcgcga tgcgaaaaaa 1140
ggtctcgcga gtctgtgcat tggtggcggc atgggtgttg cgctggccgt tgaacgtaaa 1200
taaaggaggt aaaaaaacat ggcccgcatt gcgctggtta ccggtggtat cggcggtatc 1260
ggcaccagca tctgcacccg tctggcgaaa gatggctgca cggtggttgc gaattgccac 1320
ccaagtgaag cggccgccgc ggaagagtgg aaacaagcgc gcgccgccga aggtttcgat 1380
attgcggtgt tcaccgcgga cgttagtagc ttcgatgata gcgcccgcat ggttcgcgaa 1440
atcacggaac aagttggccc gatcgatatt ctggtgaatt gcgcgggcat cacccgtgac 1500
aagaccttca agaagatgga gcaagcccat tgggaggccg tgatcaatgt gaacctcaac 1560
agcgtgttca acgtgacccg tcaagtttgg gatggcatgc tggaacgtgg ctttggccgc 1620
attatcaaca tcagcagcgt gaacggccag cgcggtcagt ttggtcaagc caactacagc 1680
gcggccaaag cgggcatgca cggtttcacg atggcgctgg cgcaagaagg tgccagcaaa 1740
ggtgtgaccg tgaacaccat cagtccgggc tacgttgaaa cggcgatgac gctggccatg 1800
aacgacgatg tgcgcaacag catcatcagt ggtatcccaa tgcgccgcat ggcccagccg 1860
aatgagatcg cggcggcgat tgcctttctg gccggtgacg aaagtggcta catgaccggt 1920
gcgaatctgc cggtgaacgg tggtctgttc atgcattaac tgcataaagg aggtaaaaaa 1980
acatggaatt aaagaatgtg attcttgaaa aagaaggaca tttagctatt gttacaatta 2040
atagaccaaa agcactaaat gcattgaact ctgaaacatt aaaggatatt gatgcagttt 2100
tagatgattt agaaaatgat actaatgtat atgccgttat agtaactggt gcaggagaaa 2160
aatcttttgt tgctggagca gatatttcag aaatgaaaga tcttaacgaa gaacaaggta 2220
aagaatttgg aattttagga aacaaagttt tcagaagatt agaaaaattg gataagccag 2280
ttattgcagc agtatcagga tttgctcttg gtggcggatg cgaacttgct atgtcatgtg 2340
atattagaat agcttcagtg aaagctaaat ttggtcaacc agaagctggt cttggaataa 2400
ctccaggatt tggtggaact caaagattag ctagaattgt agggcctgga aaggctaaag 2460
aattaatata tacttgtgac ttaataaatg ctgaagaagc atatagaata ggtttagtaa 2520
acaaaatagt tccattagaa agtttaatgg atgaagctaa agctatggct aataaaattg 2580
cagctaatgc tccaaaggca gttgcttact gtaaagatgc aattgacaga ggaatgcaag 2640
tagatataga tgcagctata ttaatagaag cagaagactt tggaaagtgt tttgcaacag 2700
aggatcaaac tgaaggaatg actgcatttt tagaaagaag agcagaaaag aatttccaaa 2760
ataaataata actttaataa ggagatatac atgatatgga aacgaaaaat caccctggaa 2820
gcactgaatg ctatggggga aggaaacatg gtgggattgc tggatattcg ctttgaacat 2880
attggtgatg acacccttga agcgacaatg ccagtagact cacggacaaa gcagcctttc 2940
gggttgctgc atggaggtgc atctgtggta ctggccgaaa gtatcggttc cgttgccggt 3000
tatttatgta ccgaaggtga gcaaaaagtg gttggtctgg aaatcaatgc taaccacgtc 3060
cgctcggcac gagaagggcg ggtgcgcggc gtatgcaaac cgttgcatct cggttcgcgt 3120
caccaggtct ggcagattga aatcttcgat gagaaagggc gtttgtgctg ttcgtcacga 3180
ttgacgaccg ctattttgtg a 3201
<210> 2
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgaacaccg acgttcgtat cgaaaaagac ttcctgggtg aaaaagaaat cccgaaagac 60
gcttactacg gtgttcagac catccgtgct accgaaaact tcccgatcac cggttaccgt 120
atccacccgg aactgatcaa atctctgggt atcgttaaaa aatctgctgc tctggctaac 180
atggaagttg gtctgctgga caaagaagtt ggtcagtaca tcgttaaagc tgctgacgaa 240
gttatcgaag gtaaatggaa cgaccagttc atcgttgacc cgatccaggg tggtgctggt 300
acctctatca acatgaacgc taacgaagtt atcgctaacc gtgctctgga actgatgggt 360
gaagaaaaag gtaactactc taaaatctct ccgaactctc acgttaacat gtctcagtct 420
accgttgacg ctttcccgac cgctacccac atcgctgttc tgtctctgct gaaccagctg 480
atcgaaacca ccaaatacat gcagcaggaa ttcatgaaaa aagctgacga attcgctggt 540
gttatcaaaa tgggtcgttg cgccctgcag gacgctgttc cgatcctgct gggtcaggaa 600
ttcgaagctt acgctcgtgt tatcgctcgt gacatcgaac gtatcgctaa cacccgtaac 660
aacctgtacg acatcaacat gggtgctacc gctgttggta ccggtctgaa cgctgacccg 720
gaatacatct ctatcgttac cgaacacctg gctaaattct ctggtcaccc gctgcgttct 780
gctcagcacc tggttgacgc tacccagaac accgactgct acaccgaagt ttcttctgct 840
ctgaaagttt gcatgatcaa catgtctaaa atcgctaacg acctgcgtct gatggcttct 900
ggtccgcgtg ctggtctgtc tgaaatcgtt ctgccggctc gtcagccggg ttcttctatc 960
atcccgggtc tggttgctcc ggttatgccg gaagttatga accaggttgc tttccaggtt 1020
ttcggtaacg acctgaccat cacctctgct tctgaagctg gtcagttcga actgaacgtt 1080
atggaaccgg ttctgttctt caacctgatc cagtctatct ctatcatgac caacgttttc 1140
aaatctttca ccgaaaactg cctgaaaggt atcaaagcta acgaagaacg tatgaaagaa 1200
tacgttgaaa aatctatcgg tatcatcacc gctatcaacc cgcacgttgg ttacgaaacc 1260
gctgctaaac tggctcgtga agcttacctg accggtgaat ctatccgtga actgtgcatc 1320
aaatacggtg ttctgaccga agaacagctg aacgaaatcc tgaacccgta cgaaatgacc 1380
cacccgggta tcgctggtcg taaataa 1407
<210> 3
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
atgaacaccg acgttcgtat cgaaaaagac ttcctgggtg aaaaagaaat cccgaaagac 60
gcttactacg gtgttcagac catccgtgct accgaaaact tcccgatcac cggttaccgt 120
atccacccgg aactgatcaa atctctgggt atcgttaaaa aatctgctgc tctggctaac 180
atggaagttg gtctgctgga caaagaagtt ggtcagtaca tcgttaaagc tgctgacgaa 240
gttatcgaag gtaaatggaa cgaccagttc atcgttgacc cgatccaggg tggtgctggt 300
acctctatca acatgaacgc taacgaagtt atcgctaacc gtgctctgga actgatgggt 360
gaagaaaaag gtaactactc taaaatctct ccgaactctc acgttaacat gtctcagtct 420
accaacgacg ctttcccgac cgctacccac atcgctgttc tgtctctgct gaaccagctg 480
atcgaaacca ccaaatacat gcagcaggaa ttcatgaaaa aagctgacga attcgctggt 540
gttatcaaaa tgggtcgttg ccacctgcag gacgctgttc cgatcctgct gggtcaggaa 600
ttcgaagctt acgctcgtgt tatcgctcgt gacatcgaac gtatcgctaa cacccgtaac 660
aacctgtacg acatcaacat gggtgctacc gctgttggta ccggtctgaa cgctgacccg 720
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gctcagcacc tggttgacgc tacccagaac accgactgct acaccgaagt ttcttctgct 840
ctgaaagttt gcatgatcaa catgtctaaa atcgctaacg acctgcgtct gatggcttct 900
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aaatctttca ccgaaaactg cctgaaaggt atcaaagcta acgaagaacg tatgaaagaa 1200
tacgttgaaa aatctatcgg tatcatcacc gctatcaacc cgcacgttgg ttacgaaacc 1260
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aaatacggtg ttctgaccga agaacagctg aacgaaatcc tgaacccgta cgaaatgacc 1380
cacccgggta tcgctggtcg taaa 1404

Claims (7)

1.一种构建R-3-氨基丁酸生产菌的方法，其包括以下步骤：
A.构建用于实现巴豆酸合成的质粒A，其包含3-酮硫裂解酶PhbA、乙酰乙酰辅酶A还原酶PhbB、巴豆酸酶Crt和硫酯酶YdiI的基因；
B.构建用于表达天冬氨酸氨裂合酶AspB的质粒B，所述天冬氨酸氨裂合酶AspB的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
C.将对步骤A中所构建的质粒A和步骤B中所构建的质粒B共转入大肠杆菌中，得到阳性克隆；
D.从步骤C中所构建的阳性克隆中，筛选出生产R-3-氨基丁酸的菌株，其中
所述质粒A的构建包括下述步骤：
A-1.将3-酮硫裂解酶基因phbA、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB、巴豆酸酶基因crt和硫酯酶基因ydiI用核糖体结合位点序列rbs串联起来，得到表达这4个基因的表达元件phbA-phbB-crt-ydiI，所述表达元件phbA-phbB-crt-ydiI的核苷酸序列是SEQ ID NO:1；
A-2.将步骤A-1中所构建的表达元件phbA-phbB-crt-ydiI装载到载体pTrcHis2B的BamH1/HindIII位点之间，Trc启动子下游，获得pTrcHis2B-ABcy质粒即质粒A。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒B的构建包括下述步骤：
将天冬氨酸氨裂合酶基因AspB克隆到载体pCDFDuet-1的NcoI/NotI位点之间，T7启动子下游，获得pCDF-AspB质粒。
3.一种R-3-氨基丁酸生产菌，其通过如权利要求1或2所述的方法构建得到。
4.如权利要求3所述R-3-氨基丁酸生产菌，其为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22076。
5.如权利要求4所述R-3-氨基丁酸生产菌用于生产R-3-氨基丁酸的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，通过如权利要求4所述R-3-氨基丁酸生产菌CGMCC No.22076的发酵来生产R-3-氨基丁酸。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，发酵培养基组成如下：125mM MOPS，pH7.4，20g/L甘油或者葡萄糖，10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5mM泛酸钙，2.78mMNa2HPO4，5mM(NH4)2SO4，30mMNH4Cl，5g/L CaCO3。
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