CN110724657A - 一种调控细胞形态改善聚乳酸生产性能的策略 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调控细胞形态改善聚乳酸生产性能的策略，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段，利用细胞***抑制剂，抑制细胞***，达到提高细胞的体积和比表面积，便于胞内产品的积累。通过引入靶向细胞***抑制剂的调控线路，扩大了细胞的体积，使得聚乳酸胞内积累变多。通过本发明生产的聚乳酸含量达到53.8w％，干重达到27.2g/L。

Description

一种调控细胞形态改善聚乳酸生产性能的策略
技术领域
本发明涉及一种调控细胞形态改善聚乳酸生产性能的策略，属于生物工程技术领域。
背景技术
聚乳酸是一种良好的生物兼容性材料，聚乳酸是以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物，原料来源充分而且可以再生。聚乳酸的生产过程无污染，而且产品可以生物降解，实现在自然界中的循环，因此是理想的绿色高分子材料。
动态调控***是代谢工程领域中新兴的代谢流调控手段，其区别于静态调控的主要特征是在发酵过程中，工程菌株会根据发酵时间、生理状态、胞内代谢物浓度、胞外环境变化做出相应的酶活调整，进而影响代谢流分布，提高产品生产能力。目前生产聚乳酸的方法主要有控制路径酶比例、调节辅因子平衡、模型预测敲除靶点，含量最高能到49％，但是存在含量低、下游分离困难、耗时长、污染大的问题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，表达调控细胞大小的靶点基因和调控聚乳酸生产的靶点基因；所述调控细胞大小的靶点基因包括编码细胞***抑制剂SuaA的基因sulA，所述细胞***抑制剂SuaA的氨基酸序列与SEQ ID NO.1编码的氨基酸序列一致；所述调控聚乳酸生产的靶点基因包括编码酮酯宪硫解酶phaA的基因phaA，编码乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB的基因phaB，编码聚羟基丁酸合酶phaC的基因phaC和编码丙酰辅酶A转移酶pCT的基因pct；所述酮酯宪硫解酶phaA的氨基酸序列与SEQ ID NO.2编码的氨基酸序列一致，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.3编码的氨基酸序列一致，所述聚羟基丁酸合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.4编码的氨基酸序列一致，所述丙酰辅酶A转移酶pCT的氨基酸序列与SEQ ID NO.5编码的氨基酸序列一致。
在本发明的一种实施方式中，编码细胞***抑制剂SuaA的基因sulA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码酮酯宪硫解酶phaA的基因phaA的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB的基因phaB的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码聚羟基丁酸合酶phaC的基因phaC的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，编码丙酰辅酶A转移酶pCT的基因pct的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，以PJ23119-phaABC-pCT和pSC101-sulA为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，以乳酸生产菌株GL0002为宿主。
所述乳酸生产菌株GL0002的构建方法公开于文献：Guo L,Zhang F,Zhang C,HuG,Gao C,Chen X,et al.Enhancement of malate production through engineering ofthe periplasmic rTCA pathway in Escherichia coli.Biotechnol Bioeng 2018,115(6):1571-1580.。
所述PJ23119-phaABC-pCT表达了酮酯宪硫解酶phaA、乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB、聚羟基丁酸合酶phaC和丙酰辅酶A转移酶pct。
所述的PJ23119-phaABC-pCT质粒的构建方法为：
(1)以商业化质粒pTargetF(Addgene Plasmid#62226)为基础，采用全质粒PCR的方式，在rrnB T1终止子后***T7Te终止子序列，以减少泄露表达；进一步地，采用全质粒PCR的方式，去除sgRNA表达框，获得仅含有Pj23119组成型启动子和双终止的工程质粒pJ01；
(2)以罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)基因组为模板，设计含有B0034RBS(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)的引物，分别扩增获得phaA、phaB基因，将phaA、phaB两个基因采用多基因一步同源重组的方式，***至Pj23119(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)的表达框中，获得PJ23119-phaAB质粒；以相同的方法，以运动假单胞菌(Pseudomonas)基因组为模板将phaC、pct两个基因采用多基因一步同源重组的方式，***至Pj23119的表达框中，最后组合成PJ23119-phaABC-pCT；
所述的PJ23119-phaABC-pCT质粒的构建方法为：
以大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655基因组为模板，设计含有B0034RBS的引物，扩增获得含有B0034RBS的sulA基因，将该片段***至pSC101质粒中，获得pSC101-sulA质粒。
本发明的第二个目的是一种生产聚乳酸的方法，利用上述基因工程菌发酵生产聚乳酸。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的培养基包括NBS无机盐培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为35-38℃，200-220rpm，菌株发酵初始OD600为0.04-0.1，发酵70-100h；或，所述发酵的条件为35-38℃，480-530rpm，接种量为5-10％，装液量为30-50％，pH为6.0-7.0，菌株发酵初始OD600为0.04-0.3，通气量为1-2vvm，发酵70-100h。
本发明的第三个目的是提供上述的一种基因工程菌或上述的一种生产聚乳酸的方法在制备目的蛋白中的应用，所述目的蛋白包括酶蛋白或非酶蛋白。
本发明的第四个目的是提供上述的一种基因工程菌或上述的一种生产聚乳酸的方法在生物、制药、食品或化工领域内的应用。
有益效果：本发明提供了一种构建调控基因线路的方法。此外，该方法设计简单，***元件少，菌株生长负荷低。通过构建聚乳酸生产工程菌株和引入调控基因线路，聚乳酸含量高达53.8w％，具有较好的应用前景。
附图说明
图1：调控细胞形态的细胞参数。
图2：聚乳酸的生产路径。
图3：质粒图谱，PJ23119-phaABC-pCT和pSC101-sulA。
图4：摇瓶中聚乳酸含量的变化。
图5：7.5L发酵罐中聚乳酸含量的变化。
具体实施方式
材料与方法
质粒构建采用经典分子生物手段进行。
细胞形态学参数检测使用荧光显微镜(Nikon microscop,80i)进行测定，控制环境温度30度。
种子培养基：LB培养基，成分包含蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
发酵培养基：NBS无机盐培养基，成分包含葡萄糖50g/L、CaCl2·2H2O 15mg/L、微量元素液0.667mL/L、灭菌后补加MgSO4·7H2O 0.25g/L，VB1 0.5mg/L，盐酸甜菜碱1mM。微量元素液的配置方法为FeCl3·6H2O 2.4g/L、CoCl2·6H2O 0.3g/L、CuCl2 0.15g/L、ZnCl2·4H2O0.3g/L、NaMnO4 0.3g/L、H3BO3 0.075g/L、MnCl2·4H2O 0.5g/L，溶于0.1M HCl中配制。
发酵样品制备：取发酵液样品，12000rpm离心5min，取上清液稀释后，过0.22μm水系膜过滤，滤液作为用来液相色谱分析。
聚乳酸含量的测定：戴安高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)，采用伯乐AminexHPX-87H(300×7.8mm，9μm)色谱柱，流动相为浓度0.005M的H2SO4，流动相经0.22μm滤膜过滤，超声脱气，流速为0.6mL/min，柱温为35℃，在紫外检测波长210nm下检测。
实施例1细胞形态的评估
将编码细胞***抑制剂sulA的sulA基因、编码隔膜形成蛋白的minC基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)、minD基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)、minE基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)、编码细胞骨架蛋白的mreB基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)，采用融合PCR的方式分别基因前面的ATG位置加上B0034RBS。将上述PCR产物回收，并与载体pSC101质粒通过酶切连接，分别获得重组质粒pSC101-sulA、pSC101-minC、pSC101-minD、pSC101-minE、pSC101-mreB。
将获得的重组质粒pSC101-sulA、pSC101-minC、pSC101-minD、pSC101-minE、pSC101-mreB分别导入感受态细胞E.coli JM109中，获得含有细胞***抑制剂sulA的质粒。
在LB培养基中，使用荧光显微镜和场发式扫描电镜对上述菌株进行细胞形态学参数的评估。结果如图1所示。由图1A-D可知，表达sulA基因，使得平均细胞长度明显增长，从4.5μm增长到22.5μm，平均细胞宽度没有明显变化；表达minC基因，使得平均细胞长度达18.6μm，平均细胞宽度没有明显变化；表达minD基因，使得平均细胞长10.8μm，平均细胞宽度没有明显变化；表达minE基因，使得平均细胞长度达6.5μm，平均细胞宽度没有明显变化；表达mreB基因，使得平均细胞长度达4.01μm，平均细胞宽度没有明显变化。而相比含有空质粒的对照组，细胞的平均体积从6.3μm3增长到43.2μm3，细胞表面积从25.6μm2增长到101.2μm2。说明表达sulA使得细胞形态具有较大的变化。
实施例2摇瓶中聚乳酸含量的检测
将已经构建好的表达聚乳酸合成路径(图2)相关基因的载体PJ23119-phaABC-pCT和pSC101-sulA(图3)导入乳酸生产菌株GL0002感受态细胞中，获得带有PJ23119-phaABC-pCT和pSC101-sulA质粒的聚乳酸生产菌株。
将上述聚乳酸生产菌株置于NBS培养基中培养，37℃，200rpm，菌株发酵初始OD600为0.04，发酵85h。对含量进行鉴定。结果如图4所示，随着细菌培养时间的延长，胞内聚乳酸含量可增多至24.2w％，干重也可增加至8.12g/L，葡萄糖消耗逐渐增加。同时可以看出，由于细胞变长，使得胞内聚乳酸含量增多到24.2w％，只有聚乳酸生产路径的对照组只有13.5w％。
如图4所示，通过尼罗红染色和荧光显微镜观察，相比只有聚乳酸生产路径的对照组，表达了sulA的胞内聚乳酸含量有明显增加。
实施例3发酵罐中聚乳酸含量的检测
在7.5L装有NBS培养基的发酵罐中检测DS7菌株的发酵性能。装液量为3.5L，pH为6.7，压力为1mpa温度恒定37℃，500rpm，初始接种OD600为0.2，通气量1vvm，发酵周期为84h。
如图5所示，发酵结束时，聚乳酸含量积累量达53.8w％，干重达到27.2g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种调控细胞形态改善聚乳酸生产性能的策略
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
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ccagcagcag tgaaacgctt cttcgaaacc ggtggcaaaa gcctgctgga cggtctgact 480
catctggcaa aggacctggt taacaacggt ggtatgccaa gccaggttga catgggtgca 540
ttcgaagtgg gcaaatctct gggtactacc gaaggtgcag tggtgttccg taacgacgtg 600
ctggaactga tccagtaccg tccaactact gaacaggtgc acgaacgtcc actgctggta 660
gtgccgccgc aaattaacaa attctacgtg ttcgacctgt ccccggacaa atccctggct 720
cgtttctgtc tgtctaacaa ccagcagacc ttcatcgtgt cctggcgtaa cccgactaaa 780
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actctgctgg ttacggttct ggataccacc ctggactctc aggttgctct gttcgttgat 1020
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accacccgcc tgccggcggc gtttcacggc gatctgattg aaatgtttaa aaacaacccg 1260
ctggtacgcg cgaacgcgct ggaagtaagc ggcaccccga ttgatctgaa acaggttacc 1320
gcggatatct atagcctggc gggcaccaat gatcacatta ccccgtggaa atcctgttac 1380
aaaagcgccc agctgtttgg cggcaaagta gaatttgtac tgagctccag cggccacatt 1440
aagagcattc tgaatccgcc gggcaatccg aaatcccgct atatgacctc taccgatatg 1500
ccggcgaccg cgaatgaatg gcaggaaaat tctaccaaac ataccgattc ttggtggctg 1560
cattggcagg cgtggcaggc cgaacgctct ggcaaactga agaaatctcc gacctctctg 1620
ggcaacaaag cctatccgtc tggcgaagcg gcgccgggca cctatgttca tgaacgctaa 1680
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atgagaaaag tagaaatcat tactgctgaa caagcagctc agctcgtaaa agacaacgac 60
acgattacgt ctatcggctt tgtcagcagc gcccatccgg aagcactgac caaagctttg 120
gaaaaacggt tcctggacac gaacaccccg cagaacttga cctacatcta tgcaggctct 180
caggacaaac gcgatggccg tgccgctgaa catctggcac acacaggcct tttgaaacgc 240
gccatcatcg gtcactggca gactgtaccg gctatcggta aactggctgt cgaaaacaag 300
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cataagctcg gcgtcttcac cgacatcggt ctggaaactt tcctcgatcc ccgtcagctc 420
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gctgatgaat ccggcaatat caccatggac gaagaaatcg ggcctttcga aagcacttcc 600
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<213> 人工合成
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<212> DNA
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<210> 8
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工合成
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atgtctagaa tgtacacttc aggctatgca catcgttctt cgtcgttctc atccgcagca 60
agtaaaattg cgcgtgtctc tacggaaaac actacagccg ggcttatcag tgaagttgtc 120
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
atggcacgca ttattgttgt tacttcgggc aaagggggtg ttggtaagac aacctccagc 60
gcggccatcg ccactggttt ggcccagaag ggaaagaaaa ctgtcgtgat agattttgat 120
atcggcctgc gtaatctcga cctgattatg ggttgtgaac gccgggtcgt ttacgatttc 180
gtcaacgtca ttcagggcga tgcaacgcta aatcaggcgt taattaaaga taagcgtact 240
gaaaatctct atattctgcc ggcatcgcaa acacgcgata aagatgccct cacccgtgaa 300
ggggtcgcca aagttcttga tgatctgaaa gcgatggatt ttgaatttat cgtttgtgac 360
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attaccacca acccggaagt ctcctcagta cgcgactctg accgtatttt aggcattctg 480
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acgcgctata acccaggccg cgtaagcaga ggtgacatgc tgagcatgga agatgtgctg 600
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gataccgtag aacgtctgtt gggagaagaa cgtcctttcc gcttcattga agaagagaag 780
aaaggcttcc tcaaacgctt gttcggagga taa 813
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
atgttgaaaa aatttcgtgg catgttttcc aatgacttgt ccattgacct gggtactgcg 60
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cgtaaccttg accgtttgtt aatggaagaa accggcattc cagtcgttgt tgctgaagac 960
ccgctgacct gtgtggcgcg cggtggcggc aaagcgctgg aaatgatcga catgcacggc 1020
ggcgacctgt tcagcgaaga gtaa 1044

Claims (10)

1.一种基因工程菌，其特征在于，表达调控细胞大小的靶点基因和调控聚乳酸生产的靶点基因；所述调控细胞大小的靶点基因包括编码细胞***抑制剂SuaA的基因sulA，所述细胞***抑制剂SuaA的氨基酸序列与SEQ ID NO.1编码的氨基酸序列一致；所述调控聚乳酸生产的靶点基因包括编码酮酯宪硫解酶phaA的基因phaA，编码乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB的基因phaB，编码聚羟基丁酸合酶phaC的基因phaC和编码丙酰辅酶A转移酶pCT的基因pct；所述酮酯宪硫解酶phaA的氨基酸序列与SEQ ID NO.2编码的氨基酸序列一致，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.3编码的氨基酸序列一致，所述聚羟基丁酸合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.4编码的氨基酸序列一致，所述丙酰辅酶A转移酶pCT的氨基酸序列与SEQ ID NO.5编码的氨基酸序列一致。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以乳酸生产菌株GL0002为宿主。
3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述调控细胞大小的靶点基因和调控聚乳酸生产的靶点基因的表达方式为游离表达。
4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的表达载体PJ23119-phaABC-pCT和pSC101-sulA为表达载体。
5.一种生产聚乳酸的方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一所述基因工程菌发酵生产聚乳酸。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基为NBS无机盐培养基。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为35-38℃，200-220rpm，菌株发酵初始OD600为0.04-0.1，发酵70-100h。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为35-38℃，480-530rpm，接种量为5-10％，装液量为30-50％，pH为6.0-7.0，菌株发酵初始OD600为0.04-0.3，通气量为1-2vvm，发酵70-100h。
9.权利要求1-4任一所述的基因工程菌在制备目的蛋白中的应用，其特征在于，所述目的蛋白包括酶蛋白或非酶蛋白。
10.权利要求1-4任一所述的基因工程菌在生物、制药、食品或化工领域内的应用。
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