CN113122482A - 一株铜绿假单胞菌GXun-2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株铜绿假单胞菌GXun‑2及其应用。本发明所述的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GXun‑2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年4月23日，保藏编号为GDMCC No：61615。本发明的菌株可完全降解羽毛，并且降解羽毛时产生的角蛋白酶的酶活力能达到1224.54U/mL。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株铜绿假单胞菌GXun-2及其应用。
背景技术
我国家禽产业是畜牧业领域中增长较快的领域，每年增速可达8～10％。随之，每年产生的羽毛含量也达到了数百万吨。只有少量的羽毛被服装、体育等行业利用，大部分羽毛均被废弃，长期堆积若不加以处理，不仅会加剧环境污染，还会引发健康问题。虽然羽毛是环境污染源之一，但它也是一种非常丰富的蛋白质来源，角蛋白占羽毛总蛋白的90％。角蛋白是一类不溶或微溶于水的硬性蛋白，主要存在于动物的毛发、羽毛、指甲、鼻、蹄和爪中。但角蛋白分子间通过大量的二硫键、氢键和疏水相互作用形成复杂的三维结构，具有极强的稳定性，很难被常见的蛋白酶水解。而角蛋白酶能够破坏二硫键，将角蛋白水解成氨基酸或多肽。目前，工业上对羽毛采用的高温加热、强酸、强碱等处理方法，产生的羽毛溶解度低，不易被动物利用，并且在处理过程中会消耗大量的能量、破坏氨基酸结构，还会产生有毒气体污染环境。然而利用产角蛋白酶的微生物降解羽毛，不仅成本低，处理条件温和，还可以将废弃蛋白转化为饲料应用于家畜业，同时对环境保护也起到了一定的积极作用。
目前已从真菌、放线菌和细菌中筛选到多种可以产生角蛋白酶的微生物。但并未见报道铜绿假单胞菌能够产生角蛋白酶，并具有降解羽毛的能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够产生角蛋白酶的铜绿假单胞，并且具有很好的降解含有角蛋白物质的能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株铜绿假单胞菌GXun-2，所述铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa GXun-2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年4月23日，保藏编号为GDMCC No：61615。
本发明还提供了所述的铜绿假单胞菌GXun-2在制备降解含有角蛋白物质的产品方面的应用。
作为优选，所述含有角蛋白物质为羽毛。
作为优选，所述羽毛为鸡羽毛、鸭羽毛、鹅羽毛中的一种或多种。
作为优选，铜绿假单胞菌GXun-2降解鸡羽毛时的方法为：将铜绿假单胞菌GXun-2的种子液接种于发酵培养基中，培养即可；
发酵培养基包括如下浓度的组分：羽毛20～25g/L、ZnSO4 0.05～0.15g/L、NaCl 4～6g/L，K2HPO4 1.3～1.5g/L、KH2PO4 0.6～0.8g/L。
作为优选，所述发酵培养基的pH为7.5～8.5。
作为优选，所述接种的种子液的量为：发酵培养基体积的0.8～1.2％。
作为优选，所述培养的温度为32～33℃，培养的时间为40～48h。
本发明提供了一株铜绿假单胞菌GXun-2及其应用。本发明的铜绿假单胞菌GXun-2在含有鸡羽毛20～25g/L、ZnSO4 0.05～0.15g/L、NaCl 4～6g/L、K2HPO4 1.3～1.5g/L、KH2PO4 0.6～0.8g/L的发酵培养基，并控制发酵培养基pH为7.5～8.0，在32～33℃条件下，培养40～48h，能使鸡羽毛完全降解，并且能产生高达1224.54U/mL的角蛋白酶。
附图说明
图1为含有透明圈的菌落。
图2为GXun-2菌株降解鸡羽毛时的降解情况(其中左图为接种GXun-2菌株前降解鸡羽毛的情况，右图为接种GXun-2菌株后降解羽毛的情况)。
图3为GXun-2菌株形态学及革兰氏染色图(其中左图为形态学图，右图为革兰氏染色图)。
图4为GXun-2菌株DNA琼脂糖凝胶电泳图。
图5为GXun-2菌株***发育树鉴定图。
图6为接种GXun-2菌株后不同时间段发酵液中产生的角蛋白酶的活力图。
保藏说明
铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa GXun-2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年4月23日，保藏编号为GDMCC No：61615。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1菌株的分离、鉴定
称取采自广西北部湾海鸭养殖场中的土壤样品10g，加入50mL无菌水，充分混匀，30℃，200r/min培养30min后，静置，取上清液采用10倍的稀释度进行梯度稀释，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的样品。取不同稀释度的样品100μL涂布于初筛培养基中，30℃培养48h，得到能够产生透明圈的单菌落，结果见图1。挑取单菌落接种于LB液体培养基中制备种子液。将制备得到的种子液按复筛培养基体积1％的接种量接种于含有鸡羽毛的复筛培养基中，35℃，200r/min发酵48h，测定不同菌株对鸡羽毛的降解情况以及发酵液中产生的角蛋白酶的酶活。结果见表1。将产生角蛋白酶酶活最高的菌株命名为GXun-2。其中GXun-2在降解鸡羽毛时的降解效果见图2。图2显示，鸡羽毛的降解率为90％。
将GXun-2进行形态学观察、革兰氏染色实验，结果如图3。
将GXun-2进行生理生化鉴定，结果如表2。
提取GXun-2菌株基因组DNA，进行16S rDNA序列扩增，得到扩增产物。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增产物的大小，结果见图4。将扩增产物进行测序，并进行序列比对，利用Mega5.0软件构建***发育树。发育树结果见图5。
所述初筛培养基包括如下浓度的组分：酪蛋白30g/L，K2HPO4 1.4g/L，KH2PO40.7g/L，NaCl 5g/L，MgSO4 0.1g/L，琼脂20g/L。
所述初筛培养基的pH7.0。
所述复筛培养基包括如下浓度的组分：鸡羽毛10g/L，NaCl 5g/L，K2HPO4 1.4g/L，MgSO4 0.1g/L，KH2PO4 0.7g/L。
所述复筛培养基的pH为7.0。
表1不同菌株对羽毛的降解情况
| 菌株编号 | 6 | 2 | 8 | 11 | 17 |
| 酶活(U/mL) | 451.0024 | 538.7748 | 388.2538 | 267.0005 | 353.6966 |
| 降解情况 | ++++ | +++++ | +++ | + | ++ |
所述：+表示羽毛降解效果；+++++表示羽毛完全降解。
表2菌株GXun-2生理生化特征
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 葡萄糖 | + | VP试验 | - |
| 果糖 | + | 甲基红试验 | - |
| 甘露醇 | - | 明胶液化 | + |
| 木糖 | - | 硝酸盐还原 | + |
| 鼠李糖 | - | 尿素酶 | - |
| 麦芽糖 | + | 氧化酶 | - |
| 七叶苷 | - | 吲哚 | - |
| 吐温-80 | - |
所述：+表示反应呈阳性；-表示反应呈阴性。
综合菌株GXun-2的形态特征、革兰氏染色、生理生化特征及16S rDNA基因序列，最终鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
应用实施例1
将实施例1筛选得到的GXun-2菌株的单菌落接种于LB液体培养基中制备种子液。将制备得到的种子液按发酵培养基体积1％的接种量接种于含有鸡羽毛25g/L、ZnSO40.1g/L、NaCl 4g/L、K2HPO4 1.4g/L、KH2PO4 0.7g/L的发酵培养基中，在32.5℃、200r/min发酵，每隔8h取发酵液，测定发酵液中角蛋白酶的酶活，酶活曲线如图6。并观察发酵液中鸡羽毛的降解情况。
所述发酵培养基的pH为8.0。
图6显示，在0～16h，酶活随时间变化而迅速增加；40h酶活趋于稳定，为1224.54U/mL；48h酶活为1240.30U/mL。
发酵液中鸡羽毛完全降解。
应用实施例2
将实施例1筛选得到的GXun-2菌株的单菌落接种于LB液体培养基中制备种子液。将制备得到的种子液按发酵培养基体积0.8％的接种量接种于含有鸡羽毛20g/L、ZnSO40.05g/L、NaCl 6g/L、K2HPO4 1.3g/L、KH2PO4 0.6g/L的发酵培养基中，在32℃、200r/min发酵，40h后测定发酵液中角蛋白酶的酶活。并观察发酵液中鸡羽毛的降解情况。
所述发酵培养基的pH为7.5。
发酵40h后发酵液中角蛋白酶的活力为1126.0585U/mL，发酵液中的鸡羽毛完全降解。
应用实施例3
将实施例1筛选得到的GXun-2菌株的单菌落接种于LB液体培养基中制备种子液。将制备得到的种子液按发酵培养基体积1.2％的接种量接种于含有鸡羽毛22g/L、ZnSO40.15g/L、NaCl 5g/L、K2HPO4 1.5g/L、KH2PO4 0.8g/L的发酵培养基中，在33℃、200r/min发酵，45h后测定发酵液中角蛋白酶的酶活。并观察发酵液中鸡羽毛的降解情况。
所述发酵培养基的pH为7.8。
发酵45h后发酵液中角蛋白酶的活力为1120.0463U/mL，发酵液中的鸡羽毛完全降解。
对比例1
按应用实施例1的方法设置GXun-2菌株对鸡羽毛的降解情况，与应用实施例1不同的是，发酵培养基中缺少了ZnSO4，pH还调为8.0按照应用实施例1的降解条件降解鸡羽毛。48h后检测发酵液中角蛋白酶的酶活，观察鸡羽毛的降解情况。
经检测，发酵液中角蛋白酶的活力为645.6023U/mL，鸡羽毛降解80.5％。
对比例2
按应用实施例2的方法设置GXun-2菌株对鸡羽毛的降解情况，与应用实施例2不同的是，培养温度为35℃，培养40h后测定发酵液中角蛋白酶的酶活。并观察发酵液中鸡羽毛的降解情况。
经检测，发酵液中角蛋白酶的活力为868.3952U/mL，鸡羽毛的降解85.8％。
对比例3
按应用实施例2的方法设置GXun-2菌株对鸡羽毛的降解情况，与应用实施例2不同的是，培养温度为31℃，培养40h后测定发酵液中角蛋白酶的酶活。并观察发酵液中鸡羽毛的降解情况。
经检测，发酵液中角蛋白酶的活力为781.0799U/mL，鸡羽毛的降解88.0％。
对比例4
按应用实施例3的方法设置GXun-2菌株对鸡羽毛的降解情况，与应用实施例3不同的是，发酵培养基的pH为8.5。45h后测定发酵液中角蛋白酶的酶活。并观察发酵液中鸡羽毛的降解情况。
经检测，发酵液中角蛋白酶的活力为805.4987U/mL，鸡羽毛的降解89.2％。
对比例5
按应用实施例3的方法设置GXun-2菌株对鸡羽毛的降解情况，与应用实施例3不同的是，发酵培养基的pH为7.0。45h后测定发酵液中角蛋白酶的酶活。并观察发酵液中鸡羽毛的降解情况。
经检测，发酵液中角蛋白酶的活力为778.5033U/mL，鸡羽毛的降解87.9％。
对比例6
按应用实施例1的方法设置GXun-2菌株对鸡羽毛的降解情况，与应用实施例1不同的是，发酵培养基中鸡羽毛的浓度为30g/L，按照应用实施例1的降解条件降解鸡羽毛。48h后检测发酵液中角蛋白酶的酶活，观察鸡羽毛的降解情况。
经检测，发酵液中角蛋白酶的活力为733.6166U/mL，鸡羽毛降解87.4％。
对比例7
按应用实施例1的方法设置GXun-2菌株对鸡羽毛的降解情况，与应用实施例1不同的是，发酵培养基中鸡羽毛的浓度为15g/L，按照应用实施例1的降解条件降解鸡羽毛。48h后检测发酵液中角蛋白酶的酶活，观察鸡羽毛的降解情况。
经检测，发酵液中角蛋白酶的活力为758.8942U/mL，鸡羽毛降解85％。
应用实施例4
按应用实施例1的方法设置GXun-2菌株对鸭羽毛的降解情况，与应用实施例1不同的是，发酵培养基中采用的鸭羽毛浓度为22g/L，按照应用实施例1的降解条件降解鸭羽毛。48h后检测发酵液中角蛋白酶的酶活，观察鸭羽毛的降解情况。
经检测，发酵液中角蛋白酶的活力为1103.46U/mL，鸭羽毛降解93％。
应用实施例5
按应用实施例1的方法设置GXun-2菌株对鹅羽毛的降解情况，与应用实施例1不同的是，发酵培养基中采用的鹅羽毛浓度为22g/L，按照应用实施例1的降解条件降解鹅羽毛。48h后检测发酵液中角蛋白酶的酶活，观察鹅羽毛的降解情况。
经检测，发酵液中角蛋白酶的活力为987.54U/mL，鹅羽毛降解91％。
由以上实施例可知，本发明提供了一株铜绿假单胞菌GXun-2及其应用。将本申请的GXun-2菌株用于本申请含有鸡羽毛的发酵培养基中，对含有角蛋白的鸡羽毛进行降解时。发现铜绿假单胞菌GXun-2在本申请发酵培养基，和发酵培养条件下能完全降解鸡羽毛，并且发酵液中角蛋白酶活力能达到1224.54U/mL。较实施例1复筛培养基在降解鸡羽毛时产生的角蛋白酶活力的538.7748，提高2.3倍。较对比例1～7改变发酵培养基组成、培养条件后得到的角蛋白酶活的活力高，降解鸡羽毛的降解效率也高。说明本申请铜绿假单胞菌GXun-2能产生角蛋白酶活力，并且采用含有鸡羽毛20～25g/L、ZnSO40.05～0.15g/L、NaCl4～6g/L、K2HPO4 1.3～1.5g/L、KH2PO4 0.6～0.8g/L的发酵培养基来降解鸡羽毛，pH控制在7.5～8.0，在32～33℃条件下，培养时间在40～48h时，对鸡羽毛的降解效果更优，发酵液中产生的角蛋白酶的酶活力更强。本申请的的菌株还对鸭羽毛和鹅羽毛具有降解效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一株铜绿假单胞菌GXun-2，其特征在于，所述铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa GXun-2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年4月23日，保藏编号为GDMCC No：61615。
2.权利要求1所述的铜绿假单胞菌GXun-2在制备降解含有角蛋白物质的产品方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述含有角蛋白物质为羽毛。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述羽毛为鸡羽毛、鸭羽毛、鹅羽毛中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，铜绿假单胞菌GXun-2降解鸡羽毛时的方法为：将铜绿假单胞菌GXun-2的种子液接种于发酵培养基中，培养即可；
发酵培养基包括如下浓度的组分：羽毛20～25g/L、ZnSO40.05～0.15g/L、NaCl 4～6g/L，K2HPO41.3～1.5g/L、KH2PO40.6～0.8g/L。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的pH为7.5～8.5。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述接种的种子液的量为：发酵培养基体积的0.8～1.2％。
8.根据权利要求5～7任意一项所述的应用，其特征在于，所述培养的温度为32～33℃，培养的时间为40～48h。
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