CN113122480A - 一种争论贪噬菌、用途及转化褐煤生产腐植酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种争论贪噬菌、用途及转化褐煤生产腐植酸的方法，涉及微生物及其应用技术领域。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21852。该争论贪噬菌是从河北省石家庄市辛集市的土壤中分离和筛选得到，具有高效降解褐煤生成腐植酸的功能，并且该菌株还具有病原真菌抗性和促进作物生长的作用。该菌株的发现为褐煤的降解以及作物促生和防病提供了一种新的资源。

Description

一种争论贪噬菌、用途及转化褐煤生产腐植酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物及其应用技术领域，尤其是涉及一种争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)、用途及转化褐煤生产腐植酸的方法。

背景技术

腐植酸主要是动、植物的遗骸，经过微生物的分解和转化以及地球化学的一系列过程形成和积累起来的一类成分复杂的天然有机物质。其分子量从几百到几百万，外观为黑色或棕色粉粒状，大多难溶于水，呈弱酸性。

按照腐植酸在溶剂中的溶解度不同，腐植酸可分为黄腐酸(Fulvic acid)、棕腐酸(Hymotometanic acid)和黑腐酸(Humic acid)。黄腐酸即溶于酸碱，又溶于水和乙醇，并且分子量较小；棕腐酸溶于碱和乙醇，不溶于酸和水：黑腐酸只溶于碱，不溶于酸、乙醇和水。腐植酸含有酚羟基、醇羟基、羟基醌、烯醇基、磺酸基、胺基、醌基、半醌基、甲氧基和羧基等多种官能团，以及少量的氨基酸、维生素、酶类和多种微量元素，其主要组成元素是C、H、O、N和S。腐植酸具有广泛的应用领域，例如在畜牧业领域，腐植酸能增强动物肠胃消化功能，促进蛋白质的同化作用；可提高动物细胞膜和原生质的渗透性。腐植酸具有吸附作用，可增加饲料的吸收消化时间，提高了吸收率。在农业领域，腐植酸类物质可以合成高吸水性树脂，一方面它作为保水剂给植物生长提供生长发育所必需的水分，另一方面腐植酸类物质本身对植物生长具有促进作用。在农药方面，腐植酸不仅具有适合农药高分子化和高分子农药的基本条件，还具有其他高分子物质或一般农药增效剂难以完全具备的无毒、无臭、无公害的特性，而且腐植酸物质本身就有抗病作用。

腐植酸广泛存在于土壤有机质、褐煤、泥炭、风化煤及湖泊和海洋沉积物中。但是由于风化煤、褐煤和煤炭等原料中含有的腐植酸类物质多数不溶于水，一般都要经过一定的活化处理以对其提取利用。目前研究中对褐煤的活化方法有很多，根据作用方式的不同可分为物理活化法、化学活化法、微生物活化法以及各种方法综合运用的活化法。

褐煤的物理活化常规的有机械破碎与超声波处理等。机械破碎是通过对褐煤采取强烈机械振动等的方式使其破碎，断裂其内部结构中的弱化学键和烷基支链，达到分子量变小，溶解性提高的目的。超声波活化是通过超声波在水溶液中产生空化效应，进而产生大量的HO₂-、OH-以及氧自由基氧化降解腐植酸的一种活化方法。

褐煤的化学活化方法有氧化法和碱溶解等，氧化法包括酸氧化、热氧化、空气氧化和光氧化等。酸氧化中研究较早的为HNO₃氧化法，其中徐云龙等(两种细菌降解内蒙古褐煤过程及液相产物分析[J].煤炭转化,2017,40(6):34-40)采用8mol/L HNO₃为活化剂对内蒙古褐煤进行了处理，得出少动鞘脂单胞菌和红城红球菌对其的最大降解率为50.86％和52.86％；除此之外，还可采用硝酸、硫酸或者两者混酸作为催化剂。热氧化是以提高煤炭氧含量为目的，断开煤炭中的化学键。光氧化是根据煤炭中含有的多环芳烃与铁等金属元素具有光催化氧化结构，对煤进行催化氧化分解的活化法。李慧等(光氧化预处理对神府煤生物转化的影响[J].应用化工,2007,36(4):325-333.)对神府煤进行了光氧化预处理，得出黄孢原毛平革菌对紫外氧化预处理煤的降解作用加强。

但是普通的物理化学法直接降解转化低阶煤需要采用大型的设备，动用大量的人力物力，并且条件要求较为苛刻；煤的微生物转化与理化方法进行比较，微生物方法具有工艺简单、低能耗、无污染等许多常规处理技术难以比拟的优点。此外微生物的煤溶解物的氮含量、氧含量升高，碳含量下降，且功能基团发生改变，使其具有很好的表面活性剂特点和有较好生物活性，可刺激植物生长。

低阶煤结构分子中价键和侧链比较多，也含有较多的活性官能团，最容易被微生物利用，另外煤是由植物演化得到的，大部分低变质煤中存在很多类木质素结构。大量研究表明，真菌、细菌和放线菌具有很强烈的木腐作用，而且在生长过程中会释放出木质素降解煤系，如漆酶(Lac)、木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)，这些酶能通过消化芳香结构的木质素，从而降解木质素。

合理的开发和充分利用褐煤资源是一个值得深入研的课题，且利用微生物方法降解低阶煤的优越性越来越被人们重视。采用微生物技术来降解风化煤资源，使其液化后，可以将其转化成另一种产品，也可以作为燃料使用，在多个方面的应用都具有较好的发展前景和方向。国内外研究表明，能够降解褐煤的微生物种类包括真菌、细菌和放线菌。褐煤的微生物降解有着广阔的应用空间，然而，目前已知的降解菌种不仅降解效果一般，而且在生长过程中要加入大量营养物质，成本较高。因此有必要，筛选和研发新的能够高效降解褐煤的菌种。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)、用途及转化褐煤生产腐植酸的方法。本发明的争论贪噬菌菌株能够高效降解褐煤生成腐植酸，并且该菌株还具有病原真菌抗性和促进作物生长的作用，为褐煤的降解以及作物促生和防病提供了一种新的资源。

本发明提供的技术方案如下:

一种争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)，所述争论贪噬菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO.21852。

所述争论贪噬菌菌株的保藏名称为：争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)XJ-4。所述争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)的16S rDNA序列为SEQ ID No.1所示序列。上述争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)XJ-4是从河北省石家庄市辛集市采集的土壤中富集培养分离得到的。

XJ-4的菌株测序结果(16S rDNA序列)如下(SEQ ID No.1)：

GGGCAATGGGGCATGCTTACCATGCAGTCGAACGGCAGCGCGGGAGCAATCCTGGCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCAATCGTGGGGGATAACGCAGCGAAAGCTGTGCTAATACCGCATACGATCTACGGATGAAAGCAGGGGATCGCAAGACCTTGCGCGAATGGAGCGGCCGATGGCAGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGCCTTCGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCAGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACTGCTTTTGTACGGAACGAAACGGCCTTTTCTAATAAAGAGGGCTAATGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTAATGTAAGACAGTTGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGTGACTGCATTGCTGGAGTACGGCAGAGGGGGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAATCCCCTGGGCCTGTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTTGGGTCTTCACTGACTCAGTAACGAAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCCACCTTTGACATGTACGGAATCCTTTAGAGATAGAGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACTCTTGTCATTAGTTGCTACAATTTAGTT。

一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有前述争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)或前述争论贪噬菌的培养物。

在一个实施方案中，所述微生物菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。进一步地，所述微生物菌剂中还包含有常用的载体，例如滑石粉、轻质碳酸钙、硅藻土、白炭黑或植物油和水等。此外，所述微生物菌剂还可以包含其他常用的助剂或营养素，例如葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、豆粕、硫胺素、生物素等。

在一个实施方案中，所述微生物菌剂所含争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)XJ-4的总活菌数为1×10⁸-2.5×10¹⁰cfu·mL^-1或1×10⁸-2.5×10¹⁰cfu·g^-1。

在一个具体的实施方案中，所述微生物菌剂所含争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)XJ-4的总活菌数为10⁸cfu·mL^-1、10⁹cfu·mL^-1、10¹⁰cfu·mL^-1或10⁸cfu·g^-1、10⁹cfu·g^-1、10¹⁰cfu·g^-1。

本发明还提供了所述争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)XJ-4或所述微生物菌剂在降解褐煤中的用途。本发明根据褐煤微生物降解的酶机制，以及漆酶、木质素过氧化物酶等可以使苯胺蓝、天青B和考马斯亮蓝褪色的功能，选择合适的筛选培养基，并通过摇瓶降解试验筛选具有高效降解褐煤的菌株。本发明筛选到的争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)XJ-4具有高效降解褐煤，生成腐植酸功能。因此，可以用于褐煤的降解应用方面。

本发明还提供了所述争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)XJ-4或所述微生物菌剂在促进植物生长中的用途。

在一个具体的实施方案中，所述促进植物生长为促进植物种子发芽。

在一个具体的实施方案中，所述植物包括玉米、小麦、水稻、黄豆、绿豆、黑豆、红豆、花生、小白菜和苜蓿中的一种或多种。

进一步地，所述争论贪噬菌可用于制备植物生长调节制剂，例如可以制备促进植物生长的微生物菌肥。

本发明还提供了所述争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)XJ-4或所述微生物菌剂在用于防治植物病害中的用途。

在一个具体的实施方案中，所述植物病害包括小麦纹枯病菌、梨黑斑病菌和番茄早疫病菌中的一种或多种。

进一步地，所述争论贪噬菌可用于制备植物病害防治剂。本发明的菌株可以与其他功能类似的菌株一起整体形成复合菌，制备防治植物病害的微生物农药组合物。

本发明在筛选得到具有高效降解褐煤功能的菌株的基础上，进一步筛选了菌株对于作物促生作用、抗土壤真菌病害等方面的功能；最终得到的菌株同时具有高效降解褐煤、促进植物生长以及防治植物病害的功能。因此，本发明的菌株或所述微生物菌剂可以用于同时实现降解褐煤、促进植物生长以及防治植物病害的作用。

此外，本发明还提供了一种转化褐煤生产腐植酸的方法，包括将所述的争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)XJ-4接种到培养基中进行培养发酵以转化褐煤生产腐植酸。

在一个实施方案中，发酵采用的培养基为缺素R2A培养基；优选地，所述培养基的pH为6.5-7.5。

所述缺素R2A培养基的组成为：酵母粉0.5g、蛋白胨0.5g、葡萄糖0.5g、磷酸氢二钾0.3g、丙酮酸钠0.3g、七水硫酸镁0.05g、水1L。

在一个实施方案中，所述发酵为在28℃-32℃下震荡培养7-10天。

生物样品保藏信息：争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)XJ-4，该菌株已于2021年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCC No.21852；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。经保藏中心于2021年3月1日检测为存活菌株。

有益效果：

(1)本发明筛选得到几百株微生物菌株，经过进一步验证这些菌株的对风化煤转化为腐植酸的产率、对作物促生作用、抗土壤真菌病害等方面的功能筛选，进一步筛选和选育，获得争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)XJ-4。通过对所获菌株进行形态特征及相应16S rDNA序列分析，确定了其分类地位和属性，所述菌株可发酵将褐煤有效降解解液化，能够高效降解褐煤生产腐植酸；发酵过程无污染且安全环保，实验验证其降解效果较为稳定。

(2)本发明得到的菌株除了具有高效降解褐煤的功能之外，还同时具有良好地促进植物生长的作用以及防治植物病害的作用(本发明的菌株对多种病原菌有较强的拮抗作用)，具有良好的开发应用前景。

(3)本发明提供了一种利用争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)菌株XJ-4转化褐煤生产腐植酸的方法，生产工艺简单且成本低，稳定性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为采用苯胺蓝褪色实验筛选阳性菌株的结果图；

图2为平板降解褐煤试验筛选菌株的结果图(上下图均表示筛选的降解褐煤的菌株)；

图3为菌株对植物病原真菌和细菌的对峙试验(其中，a为水稻纹枯病菌；b为西瓜枯萎病菌；c为棉花枯萎病菌；d为小麦纹枯病菌；e为小麦根腐病菌；f为灰霉病菌；g为苹果斑点落叶病菌；h为番茄早疫病菌；i为梨黑斑病菌；j为黄瓜枯萎病菌；k为青枯病菌；l为白枯病菌；m为软腐病菌)；

图4为碱法腐植酸与发酵腐植酸在相同稀释度下的有效活菌数；

图5为10X显微镜下碱法腐植酸与发酵腐植酸在pH 7.0的溶解情况就(其中，a为碱法腐植酸；b为发酵腐植酸)；

图6为不同腐植酸在不同浓度下对玉米生长的影响(其中F代表发酵腐植酸的浓度，J代表碱法腐植酸的浓度)；

图7为SZ-2与XJ-4对不同作物发芽的影响的实验结果图(其中，a：玉米；b：小麦；c：水稻；d：黄豆；e：绿豆；f：红豆；g：黑豆；h：花生；i：小白菜；j：苜蓿)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.菌种筛选

1.1土样的采集

选择具有代表性的样品进行采样，样品可以来源于农田、牧草地、森林土等不同的区域，尤其是来源于矿区以及褐的样品。每个点采集15-20克样品，同时标明来源地(省，县)、采集年和月、土壤的来源(植物或其他)，放于80％甘油管中保藏在-80℃冰箱。

1.2目标微生物的筛选

将土样稀释后涂布于筛选培养基(酵母粉10g、葡萄糖20g、苯胺蓝0.1g、琼脂18g、蒸馏水1L)，30℃培养2天，挑取能够使培养基变色的菌株于R2A培养基(酵母粉0.5g、胰蛋白胨0.5g、蛋白胨0.5g、葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.05g、丙酮酸钠0.3g、琼脂15g、水1L)上培养。

1.3微生物功能重复验证

将挑取菌株，纯化后接种于含有苯胺蓝、天青B和考马斯亮蓝的三种不同筛选培养基(酵母粉10g、葡萄糖20g、苯胺蓝/天青B/考马斯亮蓝0.1g、琼脂18g、蒸馏水1L)上，观察菌株的降色反应，进行功能复筛。

实施例2.菌种鉴定

2.1 CTAB法提取细菌DNA

1、接种一单菌落于5mL的R2A中，30℃培养过夜；

2、取1mL种子培养液接入100mL的R2A液体中，37℃、220r/min培养16小时；

3、5000r/min离心10分钟，弃去上清；

4、加入10mL的TE离心洗涤后，用10mL的TE溶解菌体，混匀，-20℃保存备用；

5、取3.5mL菌悬液，加入184μL 10％SDS，混匀，加入37μL的10mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃温育1小时；

6、加入740μL的5mol/LNaCl，再加入512μL的CTAB/NaCl，混匀，65℃温育10分钟；

7、加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；

8、上清中加入与上清等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)的混合物，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；

9、加入0.6倍的异丙醇，混匀，10000r/min离心5分钟，收集DNA沉淀，用70％乙醇离心洗涤DNA沉淀；

10、用1mL的TE溶解DNA，加入终浓度为20μg/mL的RNaseA，4℃保存。

2.2扩增与测序

采用16S rDNA通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rDNA的PCR扩增。

PCR反应条件：94℃预变性30s；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。将PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化测序(上海生工生物工程有限公司，通过MEGA5.0软件，建立***发育。)，根据获得的16S rDNA序列在GenBank中Blast搜索。

实施例3褐煤降解试验

3.1平皿降解试验

将筛选的菌株接种到R2A平皿上，用200目筛子均匀的铺撒于培养基上，30℃培养，观察是否有黑色液体出现。

3.2摇瓶降解试验

将上一步筛选得到的菌株，将菌液接种于灭菌的含有0.25g褐煤的50mL改良的R2A培养基(酵母粉0.5g、蛋白胨0.5g、葡萄糖0.5g、磷酸氢二钾0.3g、丙酮酸钠0.3g、七水硫酸镁0.05g、水1L)的250mL摇瓶中，同时设置白腐菌(康生元(肇庆)生物科技有限公司自有菌株)和枯草芽孢杆菌(中国农业科学院农业资源与农业区划研究所提供)为阳性对照，未接菌的阴性对照，30℃震荡培养7天，离心取上清，按行标《NYT1971-2010水溶肥料腐植酸含量的测定》中规定测定腐植酸含量，按比例计算释放率。

此计算方法中不用预先对褐煤进行任何氧化的预处理，而褐煤在经过硝酸氧化、热氧化等氧化处理后，有利于微生物的降解，从而测定数值偏高，王龙贵等(白腐真菌对煤炭的降解转化试验[J].煤炭学报，2006(02):241-244.)研究在不同影响因素下白腐菌降解经硝酸预处理的义马褐煤的降解从3.32％—41.54％，而阿拉坦其其格(能降解风化煤微生物的筛选及初步鉴定[D].内蒙古农业大学，2011.)在0.5g/1000mL体系中测定的微生物降解褐煤的转化率是4.57％—23.25％。两者的测定公式为：转化率＝(最初加入风化煤的重量-经菌种降解后的风化煤重量)/最初加入风化煤的重量)×100％，且在测定菌种降解后的风化煤重量时采取烘干，这样会失去水分，导致测定数据偏大。

除了不同褐煤本身天然存在的氧化程度不同的因素之外，褐煤是否经过预处理对微生物的降解也有重要影响。而本实验中所用褐煤没有经过任何预处理，这样就增加了微生物降解的难度，且反应体系为5g/1000mL。进一步地，测定方法采取的是测定上清腐植酸含量后，折算其重量，这样在测定腐植酸含量时不包含不能用碱测定的黄腐酸以及其他物质，同时为了便于计算和比较，不排除褐煤的含水率等因素，从而使测定的释放率较其他文献偏低。但是在相同的体系中采用一致的测定方法，本实验中的数据间是具有可比性的，但与其他试验数据不能直接进行对比。

实施例4.菌株与植物病原真菌和细菌的拮抗试验

由于腐植酸天然具有抗菌作用，本试验的目的是筛选具有抗植物病原真菌和细菌作用的菌株，增强后续产品对真菌的抗性，提高产品效果。

植物病原真菌拮抗实验：将筛选得到并经过测序安全的功能菌株与实验室现有植物病原真菌接种到PDA培养基上进行平板对峙试验，根据不同病原真菌适宜的温度分别培养，观察试验结果，测定菌株对病原真菌抗性。

植物病原细菌拮抗实验：将植物病原细菌接种到R2A液体培养基中，30℃培养24h，测定OD₆₀₀，后按终浓度OD₆₀₀ 0.05稀释于R2A固体培养基中，倒平皿，将筛选得到的菌株接种在该培养皿上，测定菌株对病原细菌的抗性。

实验中用到的植物病原真菌和细菌如下：

实施例5.种子发芽指数测定

由于腐植酸天然具有促生作用，若菌株同时具有促进作物生长的作用，将有效地增强后续产品对植物的促生作用，提高产品效果。

在试验中，将筛选到的菌株接种于R2A液体培养基上，30℃培养1d，测定OD₆₀₀，按比例稀释至OD₆₀₀ 0.1，称取一定重量的种子进行包衣，放置于0.5％琼脂水培养基上，各植物种子每皿10粒(其中小白菜、苜蓿15粒，花生6粒)，每个处理重复3次，并设置空白对照，放置于28℃黑暗培养2-3d，测量根长，计算发芽指数。采用SPSS软件处理试验数据，用Ducan's新复极差法进行数据显著性比较，分析不同菌株对种子萌发的影响。

发芽指数计算公式：

发芽指数G＝N*(0+X)+N*(1+X)+N*(2+X)+N*(3+X)+N*(4+X)；

其中，N：该级别的个数；X：该级别种子的侧根数，无侧根则为0。

表1.不同种子发芽等级分级标准

实施例6.碱法腐植酸与发酵腐植酸活性对比试验

6.1活菌数对比试验

称取等量的褐煤和功能菌株发酵的褐煤样品，前者按碱法提取腐植酸，后者加入与前者等量的水提取腐植酸，将两种腐植酸按比例稀释后，涂布于R2A平皿上，测定两种腐植酸含有的有效活菌数。

6.2中性条件下溶解度对比试验

将碱法提取的腐植酸与微生物发酵褐煤后提取的腐植酸测定含量，用金属浴蒸干液体后，用蒸馏水稀释，在pH 7.0条件下，显微镜下观察两种腐植酸溶液的溶解情况。

6.3植物促生对比试验

以蛭石为基质，每盆装土500g，先加入少量、等量的水使其湿润，选取大小均匀一致的玉米种子(京粘一号，北京思贝奇种子有限公司)，每盆栽种6粒(同一深度)，设置500ppm、250ppm、100ppm和50ppm四个不同浓度的碱法腐植酸和发酵腐植酸处理的对比试验，采用水处理作为空白对照(CK)，共计9个不同处理。在实验过程中，按照玉米生长要求，适时、适量的浇灌等量的不同浓度的两种腐植酸液体或水，21天后取根和茎叶分别烘干称重，比较实验结果。

实验结果：

1.菌株筛选

本试验共从17个省20个市县采集到50个土样以及20个褐煤样品中，通过筛选实验共筛选得到200多株可以使苯胺蓝、天青B和考马斯亮蓝褪色的菌株(使得苯胺蓝褪色的阳性菌株的筛选结果如图1示出)。

通过褐煤平皿降解试验(如图2)和摇瓶降解试验，进一步筛选具有高效降解褐煤的菌株30多株，通过进行16S rDNA测序，去除有害菌株和已经报道的具有功能的菌株，剩余菌株20多株，后续菌株进行抗真菌试验和种子发芽实验，从中选择了两株生物安全性高、降解褐煤能力强、抗真菌且对植物生长有促进作用的菌株——SZ-2和XJ-4，其中一株为SZ-2，其与Brevibacillus brevis(短短芽孢杆菌)同源性高达99.9％；另一株为XJ-4，其与Variovorax paradoxus(争论贪噬菌)同源性高达99.9％。

2.菌株降解褐煤释放率

实验中，采用2种已经报道的可以降解褐煤的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)92068菌株(Bacillus subtilis，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所提供)和白腐菌(Phanerochaetechrysosporium，康生元(肇庆)生物科技有限公司自有菌株)菌株作为本实验的对照CK1和CK2，以及不接菌的空白对照CK。

在本实验中，褐煤不经过任何预处理，为了方便比较，在计算释放率时是腐植酸占全部褐煤的重量(包括含水)。

由表2可知，实验组中腐植酸释放率最高的菌株为NKY-2，往后依次XJ-4、SZ-2、KY354和CF-3。NKY-2和XJ-4的腐植酸释放率是CK1的近8倍，CK2的近5倍；SZ-2腐植酸释放率是CK1的6.6倍，CK2的4.1倍；KY354和CF-3的腐植酸释放率均为2.4％，是CK1的5倍，CK2的3.1倍。筛选到的功能菌株的降解效率明显高于对照组菌株。

表2.不同菌株对褐煤的释放率(腐殖酸重量占褐煤重量的百分率)

3.菌株抗真菌测定结果

将上一步筛选得到的高效降解褐煤的菌株，进行与植物病原真菌的对峙实验(如图3所示)。由表3可知，只有SZ-2和XJ-4对部分植物病原真菌具有拮抗作用，其中SZ-2对水稻纹枯病菌、西瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、小麦根腐病菌、灰霉病菌、梨黑斑病菌和苹果斑点落叶病菌具有拮抗作用，而XJ-4只对小麦纹枯病菌、梨黑斑病菌和番茄早疫病菌三种植物病原真菌具有拮抗作用。SZ-2对青枯病、白枯病和软腐病三种植物细菌性病害具有拮抗作用，而NKY-2和CF-3只对白枯病菌具有拮抗作用。

表3.不同菌株对不同病原真菌的抗性

注：+表示具有拮抗作用，-表示无拮抗作用。

选取对植物病原真菌和细菌具有拮抗作用的细菌与腐植酸具有的天然抗菌作用相结合，将有效的增强后续产品对真菌的抗性，提高产品的抗菌效果。

4.菌株对种子发芽指数的影响

菌株对种子发芽指数的影响的结果如下表4所示。

表4.不同菌株作用下不同种子的发芽指数

注：同列不同大写字母表示Ducans检验达0.01显著水平，不同小写字母表示Ducans检验达0.05显著水平。

通过表4可知，对于玉米种子，XJ-4、KY354和NKY-2处理下发芽指数与对照组存在极显著性差异，SZ-2和CF-3处理下与对照组存在显著性差异；对于小麦种子，所有处理与对照组间均存在显著性差异；对于水稻种子，XJ-4和KY354处理下发芽指数与对照组存在极显著性差异，SZ-2处理下与对照组存在显著性差异；对于黄豆种子，SZ-2、XJ-4和CF-3处理下发芽指数与对照组存在极显著性差异；而对于绿豆和黑豆种子，所有处理均与对照组存在极显著性差异；对于红豆种子，SZ-2和XJ-4处理下发芽指数与对照组存在极显著性差异；而花生种子只在NKY-2处理下与对照组存在极显著性差异，在XJ-4、KY354和CF-3处理下发芽指数与对照组存在显著性差异；小白菜种子只在XJ-4处理下与对照组存在极显著性差异；KY354、NKY-2和CF-3处理下发芽指数与对照组存在显著性差异；对于苜蓿种子，CF-3处理下发芽指数与对照组存在极显著性差异，XJ-4处理下发芽指数与对照组存在显著性差异。

实验结果表明，SZ-2和XJ-4对供试的十个作物品种的绝大多数作物的发芽指数具有显著影响，在SZ-2作用下，黄豆、绿豆、红豆和黑豆的发芽指数极显著地高于对照组，而玉米、小麦和水稻的发芽指数显著地高于对照组；在XJ-4作用下，玉米、水稻、黄豆、绿豆、红豆、黑豆和小白菜的发芽指数极显著的高于对照组，而花生和苜蓿的发芽指数显著的高于对照组。SZ-2与XJ-4菌株对不同作物发芽的影响的实验结果图见图7(图7中各图的左列为CK，表示未使用菌种的空白对照；中间列为SZ-2，表示使用菌种SZ-2的处理；右列为XJ-4，表示使用菌种XJ-4的处理)。

5.碱法腐植酸与微生物发酵腐植酸对比试验

5.1.细菌活性测定结果

细菌活性测定结果见图4，从图4中可以看到，在10^-4稀释度下，发酵样品的活菌数是明显高于碱法样品。通过计算，碱法腐植酸的活菌数是2.4*10³个/g，而发酵样品中活菌数可以达到8.7亿/g，是前者的30多万倍。

实验表明，功能菌株可以在发酵过程中存活，在形成产品后，不仅腐植酸对植物的生长起促进作用，功能菌株也起到抗病和促生的作用，极大的提高了产品的有效性。

5.2.溶解度测定结果

溶解度测定结果见图5，从图5中可以直观地看到，在pH 7.0时，发酵腐植酸溶液均匀、无明显颗粒，而碱法腐植酸出现大量明显的颗粒。由此可以表明，发酵腐植酸的溶解度在pH中性时明显优于碱性腐植酸，这样我们的发酵腐植酸就有效避免了碱法腐植酸在农业应用上的局限性，可以更好的与肥料进行复配，不会因pH过高对植物造成影响，在pH中性时，也不会因溶解度过低，影响使用效果。

5.3植物促生测定结果

不同腐植酸在不同浓度下对玉米生长的影响见图6。从图6可以明显看到，发酵腐植酸处理的结果均好于相对应的碱法腐植酸处理，且随着腐植酸浓度的升高，玉米的长势越好。

通过对玉米茎叶部分干重(表5)的测定也证实了这一结果。由此可以证明，发酵腐植酸的促生作用优于碱法腐植酸。

表5.不同腐植酸在不同浓度下对玉米茎叶干重的影响

注：在各个浓度下，发酵腐植酸vs碱法腐植酸具有极显著性差异。

结论：

综合上述实验结果，SZ-2和XJ-4在具有高效降解褐煤功能的基础上，同时兼具病原真菌抗性和促进作物生长的作用。通过发酵试验，菌株可以良好的在发酵样品中存活，且发酵的腐植酸溶液在中性条件下的溶解度和对植物生长的促进作用均优于碱法腐植酸。通过国内外文献查询，本发明关于这两种菌株在降解褐煤方面的功能为首次发现。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北萌帮生物科技有限公司

<120> 一种争论贪噬菌、用途及转化褐煤生产腐植酸的方法

<130> PA21007812

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1101

<212> DNA

<213> 争论贪噬菌（Variovorax paradoxus）16S rDNA

<400> 1

gggcaatggg gcatgcttac catgcagtcg aacggcagcg cgggagcaat cctggcggcg 60

agtggcgaac gggtgagtaa tacatcggaa cgtgcccaat cgtgggggat aacgcagcga 120

aagctgtgct aataccgcat acgatctacg gatgaaagca ggggatcgca agaccttgcg 180

cgaatggagc ggccgatggc agattaggta gttggtgagg taaaggctca ccaagccttc 240

gatctgtagc tggtctgaga ggacgaccag ccacactggg actgagacac ggcccagact 300

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cgcgtgcagg atgaaggcct tcgggttgta aactgctttt gtacggaacg aaacggcctt 420

ttctaataaa gagggctaat gacggtaccg taagaataag caccggctaa ctacgtgcca 480

gcagccgcgg taatacgtag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgtgc 540

gcaggcggta atgtaagaca gttgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcatctgt 600

gactgcattg ctggagtacg gcagaggggg atggaattcc gcgtgtagca gtgaaatgcg 660

tagatatgcg gaggaacacc gatggcgaag gcaatcccct gggcctgtac tgacgctcat 720

gcacgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat 780

gtcaactggt tgttgggtct tcactgactc agtaacgaag ctaacgcgtg aagttgaccg 840

cctggggagt acggccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg 900

gtggatgatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaaaaacct tacccacctt tgacatgtac 960

ggaatccttt agagatagag gagtgctcga aagagaaccg taacacaggt gctgcatggc 1020

tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aactcttgtc 1080

attagttgct acaatttagt t 1101

Claims (10)

1.一种争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)，其特征在于，所述争论贪噬菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCCNo.21852。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)或者所述争论贪噬菌的培养物。

3.权利要求1所述的争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)或权利要求2所述的微生物菌剂在降解褐煤中的用途。

4.权利要求1所述的争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)或权利要求2所述的微生物菌剂在促进植物生长中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述植物包括玉米、小麦、水稻、黄豆、绿豆、黑豆、红豆、花生、小白菜和苜蓿中的一种或多种。

6.权利要求1所述的争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)或权利要求2所述的微生物菌剂在防治植物病害中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述植物病害包括小麦纹枯病菌、梨黑斑病菌和番茄早疫病菌中的一种或多种。

8.一种转化褐煤生产腐植酸的方法，其特征在于，包括采用权利要求1所述的争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)对褐煤进行发酵得到腐植酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵采用的培养基为缺素R2A培养基；优选地，所述培养基的pH为6.5-7.5。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵为在28℃-32℃下震荡培养7-10天。

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