CN113121648B

CN113121648B - N-甲基环五肽化合物及其合成方法与应用

Info

Publication number: CN113121648B
Application number: CN202110306713.0A
Authority: CN
Inventors: 刘守信; 葛晓琳; 相晨爽; 黄净; 杨毅华
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2015-06-02
Filing date: 2015-06-02
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2035-06-02
Also published as: CN104861046A; CN113121648A

Abstract

本发明公开了一种N‑甲基环五肽化合物及其合成方法与应用，该N‑甲基环五肽化合物具有通式(Ⅰ)结构：

其中：Ar为稠环芳基或取代稠环芳基；R1～R4各自为独立的异丙基、异丁基、甲基；R`1～R`5各自为独立氢、甲基。本发明的N‑甲基环五肽化合物具有良好的抗肿瘤活性，尤其是对抗胃癌细胞、抗***细胞、抗肾透明癌细胞或抗胰腺癌细胞具有较高的活性,其作用途径是通过caspase‑9诱发caspase‑3使肿瘤细胞凋亡发挥作用的。这些环肽表现出良好的酶稳定性，有较长的半衰期。

Description

N-甲基环五肽化合物及其合成方法与应用

技术领域

本发明涉及一类环五肽化合物，特别涉及一类具有抗肿瘤活性的含有稠环芳基丙氨酸的N-甲基环五肽化合物及其合成制备方法与应用。

背景技术

环肽是一类结构比较特殊的肽类化合物，这些化合物大多具有良好的生理和药理活性，其中抗肿瘤活性尤为突出，其中N-甲基化环肽广泛存在于天然产物中，环肽的N-甲基化能极大地改善分子结构，其表现出良好的生物活性。随着氨基酸排列顺序的不同，环肽的结构不同，性质和活性也不相同。

发明内容

本发明的目的是提供一种N-甲基环五肽化合物，该N-甲基环五肽具有良好的抗肿瘤活性，尤其是对抗胃癌细胞、抗***细胞、抗肾透明癌细胞或抗胰腺癌细胞具有较高的活性，N-甲基环五肽具有较高的稳定性，有较长的半衰期。

本发明的又一目的是提供N-甲基环五肽的合成制备方法，其具有合成步骤较少，产物产率较高，成本较低的优点。

为解决上述技术问题，本发明提供一种通式(Ⅰ)的N-甲基环五肽化合物：

其中：

Ar为稠环芳基或取代稠环芳基；

R1～R4各自为独立的异丙基、异丁基、甲基；

R`1～R`5各自为独立氢、甲基。

其中，所述稠环芳基包括萘基、取代萘基、喹啉基或取代喹啉基；

所述取代稠环芳基中的取代基包括卤素、甲氧基。

其中，所述N-甲基环五肽化合物由五个L-氨基酸组成。

其中，所述五个L-氨基酸彼此之间以肽键连接成环状结构，所述五个L-氨基酸选自N-甲基氨基酸、萘丙氨酸或取代萘丙氨酸或稠环芳基丙氨基酸、脂肪基氨基酸；且五个L-氨基酸相互独立，并非完全相同，按随机顺序排列。

其中，所述五个L-氨基酸中，

一个L-氨基酸为N-甲基氨基酸；

一个L-氨基酸为稠环芳基丙氨基酸或取代稠环芳基丙氨基酸；

另外三个L-氨基酸为脂肪基氨基酸或环状氨基酸。

其中，所述脂肪基氨基酸为L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸或L-丙氨酸。

其中，所述N-甲基氨基酸为N-甲基化氨基酸。

该N-甲基环五肽化合物为具有化学式LX-1、LX-2、LX-3、LX-4、LX-5、LX-6、LX-7、LX-8、LX-9、LX-10、LX-11或LX-12中的一种

所述LX-3，即亮-N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸环五肽在制备通过caspase-3酶使黑色素肿瘤细胞、胃癌细胞、抗***细胞、抗肾透明癌细胞或抗胰腺癌细胞凋亡的抗癌的药物中的应用。

本发明提供一种合成N-甲基环五肽化合物的方法，其包括以下步骤：

步骤一：三肽片段的合成，化学反应式如下：

步骤二：二肽片段的合成，化学反应式如下：

步骤三：五肽的合成和环合反应，化学反应式如下：

其中：

Ar为稠环芳基或取代稠环芳基；

R1～R4各自为独立的异丙基、异丁基、甲基；

R`1～R`5各自为独立氢、甲基。

其中，所述LX-1为亮-亮-缬-N-甲基亮-2-萘丙环五肽，其合成步骤如下：

步骤A:合成N-甲基-亮-2-萘丙氨酸甲酯二肽；

A1:将一定量2-萘丙氨酸甲酯、Boc-N-甲基-亮氨酸HATU、DIPEA、DCM和N,N-二甲基甲酰胺加入到配有氯化钙的容器中，室温搅拌过夜；

A2:步骤A1中得到溶液减压浓缩，并通过乙酸乙酯萃取，合并有机相；

A3:将上述有机相依次用水、K₂CO₃溶液、HCl溶液、饱和NaCl溶液各洗数次后，浓缩，纯化得到无色粘稠液体；

A4:将所述无色粘稠液体溶解于二氯甲烷和三氟乙酸溶液中，搅拌5-8小时，然后减压除去二氯甲烷和三氟乙酸，得到N-甲基-亮-2-萘丙氨酸甲酯粗产品；

步骤B:合成Boc-亮-亮-缬三肽；

B1:在干燥容器中，加入缬氨酸甲酯、Boc-亮氨酸、HBTU、DIPEA、DCM和DMF，室温搅拌过夜；

B2:将步骤B1中得到的溶液，减压浓缩，并通过乙酸乙酯萃取数，合并有机相；

B3:将上述有机相依次用水、K₂CO₃溶液、HCl溶液，饱和NaCl溶液各洗数次，干燥，过滤，浓缩得到产物，在产物中加入DCM和TFA，室温下搅拌反应5-7h，减压除去DCM和TFA，得到亮-缬甲酯三氟醋酸盐；

B4:将亮-缬甲酯三氟醋酸盐溶于DCM和DMF中，加入Boc-亮氨酸、HBTU和DIPEA，搅拌过夜；

B5:将步骤B4的反应液浓缩，在产物中加入水，用乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、K₂CO₃溶液、HCl溶液，饱和NaCl溶液各洗数次，干燥，过滤、浓缩，纯化得固体产物；

B6:用THF溶解所得固体产物，并转移到盛有LiOH与水形成的溶液容器中，室温下搅拌过夜，减压除去THF，加入水，用盐酸调节溶液的pH至3-4，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，干燥过夜，过滤，浓缩得Boc-亮-亮-缬三肽；

步骤C:合成亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸甲酯五肽；

C1：将N-甲基-亮-2-萘丙氨酸甲酯、Boc-亮-亮-缬三肽、HATU、DIPEA、DCM和DMF，室温搅拌过夜；

C2：将步骤C1中的反应物减压浓缩，用乙酸乙酯萃取数次，合并有机相，依次用水、K2CO3溶液、HCl溶液以及饱和NaCl溶液各洗数次，干燥，过滤，浓缩，纯化得到Boc-亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸甲酯；

C3：用THF溶解所得固体，并转移到盛有LiOH与水形成的溶液容器中，室温下搅拌过夜，待反应结束后减压除去THF，在残余物中加水，用稀盐酸调pH＝3-4，并用乙酸乙酯萃取，合并有机相，干燥过夜，减压浓缩得Boc-亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸五肽后，将其溶解到DCM和TFA的溶液中，常温搅拌反应5-8h，减压除去DCM和TFA，即得亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸五肽；

步骤D:合成亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸环五肽；

D1：将亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸五肽加入到容器中，溶解于DMF、四氢呋喃和二氯甲烷形成的溶液，搅拌溶解后，加入PyAOP HATU、二异丙基乙胺，常温搅拌反应65-75h；

D2：将步骤D1中的反应液减压、浓缩，在残余液中加入水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相,依次用水、K₂CO₃溶液、盐酸溶液、水和饱和NaCl溶液各洗数次，干燥过夜，抽滤，浓缩，纯化得到亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸环五肽。

本发明的N-甲基环五肽化合物在制备治疗胃、宫颈、胰腺、黑色素、肾透明癌症的药物中的应用。

本发明相对于现有技术具有以下有益效果：

本发明的N-甲基环五肽化合物具有良好的抗肿瘤活性，尤其是对抗黑色素癌细胞、胃癌细胞、抗***细胞、抗肾透明癌细胞或抗胰腺癌细胞具有较高的活性，表现出良好的酶稳定性，且该N-甲基环五肽在体内不易降解，有较长的半衰期；本发明的N-甲基环五肽对平滑肌细胞、淋巴细胞以及心肌细胞具有非常小的副作用；N-甲基环五肽对肿瘤细胞的抑制作用是通过诱导凋亡的途径发挥作用的；本发明的N-甲基环五肽的合成制备方法，其具有合成步骤较少，产物产率较高，成本较低的优点。

附图说明

图1为本发明的LX-3对B16作用的Western-Blot检测结果图像。

具体实施方式

本发明提供一种新的抗肿瘤N-甲基环五肽化合物，该抗肿瘤N-甲基环五肽化合物，具有式(Ⅰ)结构：

其中：

Ar为稠环芳基或取代稠环芳基，稠环芳基包括萘基、取代萘基、喹啉基或取代喹啉基等，取代稠环芳基中的取代基包括卤素、甲氧基等；

R1～R4各自为独立的异丙基、异丁基、甲基等；

R`1～R`5各自为独立氢、甲基等。

本发明的抗肿瘤N-甲基环五肽化合物，由五个L-氨基酸彼此之间以肽键连接成环状结构，五个氨基酸选自N-甲基氨基酸、萘丙氨酸或取代萘丙氨酸或稠环芳基丙氨基酸、脂肪基氨基酸；且五个氨基酸相互独立，并非完全相同，按随机顺序排列。

具体的讲，本发明的抗肿瘤N-甲基环五肽化合物，五个L-氨基酸中，只含有一个N-甲基氨基酸，一个稠环芳基丙氨基酸或取代稠环芳基丙氨基酸，其他均为脂肪基氨基酸或环状氨基酸。其中，N-甲基氨基酸为N-甲基化氨基酸，脂肪基氨基酸选自L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸。

本发明的抗肿瘤N-甲基环五肽化合物的代表化合物的化学式为LX-1、LX-2、LX-3、LX-4、LX-5、LX-6、LX-7、LX-8、LX-9、LX-10、LX-11或LX-12。

本发明的抗肿瘤N-甲基环五肽化合物的合成制备方法如下：

抗肿瘤N-甲基环五肽化合物的合成采用液相合成方法实现，其策略为Boc保护氨基酸氮端的技术，合成路线为2+3的会聚式或逐一连接法，肽链的增长使用HBTU或HATU或HCTU或PyBOP等作为缩合剂，其合成方法具体包括如下步骤：

步骤一：三肽片段的合成，化学反应式如下：

步骤二：二肽片段的合成，化学反应式如下：

步骤三：五肽的合成和环合反应，化学反应式如下：

本发明的N-甲基环五肽的合成制备方法，其具有合成步骤较少，产物产率较高，成本较低。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实例1 亮-亮-缬-N-甲基亮-2-萘丙环五肽(LX-1)的合成

1、N-甲基-亮-2-萘丙氨酸甲酯二肽的合成。

将2mmol的2-萘丙氨酸甲酯、3mmol Boc-N-甲基-亮氨酸、2.4mmol HATU、14mmolDIPEA、50mL DCM和5mL N,N-二甲基甲酰胺加入到配有氯化钙干燥管的100mL单口烧瓶中，室温搅拌过夜。减压浓缩，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到无色粘稠液体，收率79％。然后将此液体溶解到12mL二氯甲烷和8mL三氟乙酸中，常温搅拌6h。减压除去DCM和TFA，即得到产物N-甲基-亮-2-萘丙氨酸甲酯粗产品。

2、Boc-亮-亮-缬三肽的合成。

在带有干燥管的100mL单口烧瓶中，加入2mmol的缬氨酸甲酯、3mmol Boc-亮氨酸、2.4mmol HBTU、14mmol DIPEA、50mLDCM和5mL DMF，室温搅拌过夜。减压浓缩，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，在剩余物中加入12mL DCM和8mL TFA，室温下搅拌反应5-7h(较佳的为6h)。减压除去DCM和TFA，获得亮-缬甲酯三氟醋酸盐。将此盐溶于50mL DCM和5mL DMF，此后加入3mmol Boc-亮氨酸和2.4mmol HBTU以及14mmol的DIPEA，搅拌过夜。反应液浓缩，在所得残余物中加入300mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、5％K₂CO₃、2％HCl饱和NaCl各洗3次，无水硫酸镁干燥过夜。过滤、浓缩，产物经硅胶柱层析纯化，得固体产物，产率98％。用52.5mL THF溶解所得固体，并转移到盛有18mmol LiOH与15mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌过夜。减压除去THF，加入60mL水，用2％盐酸调节溶液的pH至3-4，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥过夜。过滤，浓缩，即得Boc-亮-亮-缬三肽。

3、亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸甲酯五肽的合成。

将2mmol的N-甲基-亮-2-萘丙氨酸甲酯、3mmol Boc-亮-亮-缬三肽、2.4mmolHATU、14mmol DIPEA、50mL DCM和5mL DMF，室温搅拌过夜，用TLC检测反应的进展。减压浓缩，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化得到Boc-亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸甲酯，收率68％。用17.5mL THF溶解所得固体，并转移到盛有3mmol LiOH与2.5mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌过夜。用TLC跟踪反应，待反应结束后减压除去THF。在残余物中加水60mL，用稀盐酸调pH＝3-4，60mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥过夜。减压浓缩获得Boc-亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸五肽后，溶解到6mLDCM和4mL TFA的溶液中，常温搅拌反应5-8h(较佳的为6h)。减压除去DCM和TFA，即得亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸五肽。

4、亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸环五肽的合成。

将0.5mmol亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸五肽加入到单口瓶中，溶解于60mLDMF、240mL四氢呋喃和240mL二氯甲烷形成的溶液。搅拌溶解之后，加入3mmol PyAOP、1mmolHATU、3.5mmol二异丙基乙胺，常温搅拌反应65-75h(较佳的为72h)。减压、浓缩，在残余液中加入400mL水，用90mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。依次用水、5％K₂CO₃、2％盐酸、水和饱和食盐水各洗两次，无水硫酸钠干燥过夜。抽滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸环五肽，产率37％。

1H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.81(t,J＝4.5Hz,1H),7.78-7.74(m,2H),7.67(d,J＝9.0Hz,1H),7.63(s,1H),7.49-7.43(m,3H),7.34-7.32(dd,J＝8.5Hz,J＝1.5Hz,1H),7.04(d,J＝6.5Hz,1H),6.79(d,J＝7.5Hz,1H),4.77(d,J＝7.5Hz,1H),4.49(t,J＝8.5Hz,1H),4.28(d,J＝7.5Hz,1H),3.83-3.81(m,1H),3.40-3.37(dd,J＝9.0Hz,J＝6.0Hz,1H),3.34-3.25(m,2H),3.20(s,3H),2.12(brs,1H),2.03-1.88(m,3H),1.64-1.61(m,1H),1.57-1.49(m,3H),1.40-1.34(m,1H),1.28-1.25(m,1H),0.96-0.90(m,12H),0.85-0.79(m,12H)；13CNMR(125MHz,CDCl₃)δ173.62,173.54,172.61,171.30,171.01,133.78,133.55,132.64,128.74,128.03,127.77,127.53,127.14,126.43,125.99,58.14(2C),55.36,54.71,53.06,40.40,39.18,37.64,37.59,30.62(2C),25.52,25.26,24.79,22.90,22.80,22.56,22.25,22.07,21.82,19.53,18.38；HRMS(ESI,M+1)C₃₇H₅₆N₅O₅计算值为650.4203，实测值为650.4221。

实例2 亮-亮-N-甲基-缬-亮-2-萘丙环五肽(LX-2)的合成

1、Boc-亮-亮二肽的合成。

将2mmol的亮氨酸甲酯、3mmol Boc-亮氨酸、0.24mmol HBTU、14mmol DIPEA、50mLDCM和5mL DMF加入到盛有干燥管的100mL单口烧瓶中，室温搅拌过夜。减压、浓缩，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到白色固体，收率97％。用52.5mL THF溶解所得固体，并转移到盛有18mmol LiOH与15mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌过夜。待反应结束后减压除去THF。在残余物中加水60mL，用稀盐酸调pH＝3-4，60mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥过夜。减压浓缩获得Boc-亮-亮二肽粗品。

2、N-甲基-缬-亮-2-萘丙氨酸甲酯三肽的合成。

将2mmol的-2-萘丙氨酸甲酯、3mmol Boc-亮氨酸、0.24mmol HBTU、14mmol DIPEA、50mL DCM和5mL DMF加入到盛有干燥管的100mL单口烧瓶中，室温搅拌过夜。减压、浓缩，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到白色固体，收率78％。然后将此溶解到12mL DCM和8mL TFA中，于室温下搅拌反应6h。减压除去DCM和TFA，得亮-2-萘丙氨酸甲酯醋酸盐。将此盐溶于50mL THF和5mL DMF，此后加入3mmol Boc-N-甲基-缬氨酸和2.4mmol HATU以及14mmol的DIPEA，搅拌过夜。减压蒸去溶剂，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到无色粘稠液体，收率70％。后将此溶解到12mL DCM和8mL TFA中，于室温下搅拌反应6h。减压除去DCM和TFA，得N-甲基-缬-亮-2-萘丙氨酸甲酯粗产品。

3、亮-亮-N-甲基-缬-亮-2-萘丙氨酸五肽的合成。

将2mmol的N-甲基-缬-亮-2-萘丙氨酸甲酯三肽、3mmol Boc-亮氨酸-L-亮氨酸二肽、2.4mmol HATU、14mmol DIPEA、50mL DCM和5mL DMF加入到带有干燥管的100mL单口烧瓶中，室温搅拌过夜。减压蒸去溶剂，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥过夜。抽滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到Boc-亮-亮-N-甲基-缬-亮-2-萘丙氨酸甲酯五肽纯品。用17.5mL THF溶解所得固体，并转移到盛有3mmol LiOH与2.5mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌过夜。用TLC跟踪反应，待反应结束后减压除去THF。在残余物中加水60mL，用稀盐酸调pH＝3-4，60mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无水硫酸镁干燥过夜。减压浓缩获得Boc-亮-亮-N-甲基-缬-亮-2-萘丙氨酸五肽后，溶解到6mL DCM和4mL TFA的溶液中，常温搅拌反应6h。减压除去DCM和TFA，即得亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸五肽。

4、亮-亮-N-甲基-缬-亮-2-萘丙氨酸环五肽的合成。

将0.5mmol的亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸五肽加入到带有干燥管的1000mL的单口瓶中(注射泵滴加)，加入3mmol PyAOP、1mmol HATU、3.5mmol DIPEA、240mL DCM、240mL THF和60mL DMF，常温搅拌72h。减压除去溶剂，加水400mL，用90mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥过夜。抽滤、浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到亮-亮-N-甲基-缬-亮-2-萘丙氨酸环五肽，产率35％。

1H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.12(brs,1H),7.81-7.72(m,4H),7.64(s,1H),7.48-7.45(m,3H),7.33-7.31(dd,J＝8.0Hz,J＝1.5Hz,1H),6.24(d,J＝7.0Hz,1H),4.83-4.79(dd,J＝16.0Hz,J＝7.0Hz,1H),4.51-4.47(dd,J＝16.5Hz,J＝7.0Hz,1H),4.35-4.29(m,1H),4.10-4.05(m,1H),3.49-3.44(m,1H),3.30-3.26(m,1H),3.18-3.14(m,1H),2.72(s,3H),2.38(d,J＝11.5Hz,1H),1.82-1.80(m,1H),1.76-1.67(m,4H),1.61-1.50(m,4H),0.95(t,J＝7.0Hz,7H),0.86-0.81(dd,J＝17.5Hz,J＝6.0Hz,6H),0.74(d,J＝5.5Hz,8H),0.69(d,J＝6.5Hz,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ174.19,172.38,171.43,171.35,170.75,134.54,133.64,132.49,128.97,128.51,127.99,127.71,127.21,126.43,125.96,65.69,56.74,54.37.,51.90,48.74,41.24,40.32,40.06,35.25,30.70,26.57,26.50,25.03,24.94,24.80,23.17,22.86,22.80,22.06,21.05,19.77,19.14；HRMS(ESI,M+1)C₃₇H₅₆N₅O₅，计算值为650.4203,实测值为650.4266。

实例3 亮-N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸环五肽(LX-3)的合成

1、缬-亮-2-萘丙氨酸甲酯三肽的合成。

将2mmol的2-萘丙氨酸甲酯、3mmol Boc-亮氨酸、0.24mmol HBTU、14mmol DIPEA、50mL DCM和5mL DMF加入带有干燥管的100mL单口烧瓶中，室温搅拌过夜。减压蒸去溶剂，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥过夜。抽滤，浓缩，硅胶柱层析纯化，得到白色固体，收率78％。然后将此溶解到12mL DCM和8mL TFA中，于室温下搅拌反应6h。减压除去DCM和TFA，得亮-2-萘丙氨酸甲酯醋酸盐。将此盐溶于50mL DCM和5mL DMF，此后加入3mmol Boc-缬氨酸和2.4mmol HATU以及14mmol的DIPEA，搅拌过夜。减压蒸去溶剂，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到白色固体，收率75％。将此溶解到12mL DCM和8mL TFA中，于室温下搅拌反应6h。减压除去DCM和TFA，得到缬-亮-2-萘丙氨酸甲酯三肽。

2、N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸甲酯四肽的合成。

将2mmol的缬-亮-2-萘丙氨酸甲酯三肽、3mmol Boc-N-甲基-亮氨酸、2.4mmolHATU、14mmol DIPEA、50mL DCM和5mL DMF加入到带有干燥管的100mL单口烧瓶中，室温搅拌过夜。减压蒸去溶剂，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥过夜。抽滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到白色固体，收率70％。将此溶解到12mL DCM和8mL TFA中，于室温下搅拌反应6h。减压除去DCM和TFA，即得N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸甲酯四肽。

3、亮-N-甲基-亮-缬-亮-L-2-萘丙氨酸五肽的合成。

将N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸甲酯四肽、3mmol Boc-L-亮氨酸、2.4mmol HATU、14mmol DIPEA、50mL DCM和5mL DMF加入到带有干燥管的100mL单口烧瓶中，室温搅拌过夜。减压蒸去溶剂，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥过夜。抽滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到白色固体，收率65％。用17.5mL THF溶解所得固体，并转移到盛有3mmol LiOH与2.5mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌过夜。用TLC跟踪反应，待反应结束后减压除去THF。在残余物中加水60mL，用稀盐酸调pH＝3-4，60mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无水硫酸镁干燥过夜。减压浓缩获得Boc-亮-N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸五肽。取0.5mmol溶解到6mLDCM和4mL TFA中，于室温下搅拌反应6h。减压除去DCM和TFA，即得亮-N-甲基-亮-缬-亮-L-2-萘丙氨酸五肽。

4、亮-N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸环五肽的合成。

将0.5mmol的亮-N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸五肽加入到带有干燥管的1000mL的单口瓶中(注射泵滴加)，加入3mmol PyAOP、1mmol HATU、3.5mmol DIPEA、240mL DCM、240mL THF和60mL DMF，常温搅拌72h。减压除去溶剂，加水400mL，用90mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥过夜。抽滤，减压除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，得亮-N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸环五肽，产率36％。

1H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.18(d,J＝6.5Hz,1H),7.83-7.81(m,1H),7.78(d,J＝8.5Hz,1H),7.75-7.72(m,1H),7.67-7.63(m,3H),7.49-7.46(m,2H),7.32-7.30(dd,J＝8.5Hz,J＝1.5Hz,1H),6.41(d,J＝7.0Hz,1H),4.86-4.82(dd,J＝14.5Hz,J＝8.0Hz,1H),4.49-4.45(dd,J＝13.0Hz,J＝7.5Hz,1H),4.09(t,J＝9.0Hz,1H),3.93-3.89(m,1H),3.55-3.50(dd,J＝13.5Hz,J＝7.5Hz,1H),3.37(t,J＝8.0Hz,1H),3.32-3.28(dd,J＝14.0Hz,J＝5.5Hz,1H),3.00(s,3H),2.14-2.10(m,1H),2.07-2.01(m,1H),1.95-1.88(m,1H),1.82-1.80(m,1H),1.75-1.72(m,1H),1.62-1.53(m,3H),1.46-1.42(m,2H),0.95-0.88(m,18H),0.76(t,J＝6.0Hz,6H)；13C NMR(125MHz,CDCl₃)δ173.34,172.86,171.99,171.76,170.63,133.93,133.62,132.73,128.89,128.18,127.88,127.57,127.23,126.57,126.12,59.68,56.04,54.12,49.21,46.46,46.42,41.15,39.75,38.76,37.18.30.02,26.59,26.34,24.94,24.74,23.01,22.90,22.64,22.23,21.68,19.29,18.97；HRMS(ESI,M+1)C₃₇H₅₆N₅O₅，计算值为650.4203,实测值为650.4280。

化合物(LX-6)，将实例3中(2-萘基)丙氨酸用[2-(5-甲氧基萘基)]丙氨酸代替即可合成之，收率30％。

化合物(LX-7)，将实例3中(2-萘基)丙氨酸用(2-喹啉基)丙氨酸代替即可合成之，收率26％。

化合物(LX-8)，将实例3中(2-萘基)丙氨酸用色氨酸代替即可合成之，收率28％。

化合物(LX-10),将实例3中(2-萘基)丙氨酸用[2-(5-溴萘基)]丙氨酸代替即可合成之，收率42％。

实例4 亮-亮-缬-N-甲基亮-2-萘丙氨酸环五肽(LX-4)的合成

1、亮-亮-缬-N-甲基亮-2-萘丙氨酸五肽的合成。

按照实例1所描述的3+2的方法，合成得到Boc-亮-亮-缬-N-甲基-亮-萘丙氨酸甲酯后，将其0.5mmol溶解于3mL四氢呋喃，并转入100mL的单口烧瓶中。在搅拌的同时加入3mmol氢氧化锂与2.5mL水和17.5mL四氢呋喃形成的溶液，常温搅拌过夜。减压除去四氢呋喃，加水60mL，用稀盐酸调pH＝3-4，60mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无水硫酸镁干燥过夜。减压回收溶剂后，得到的剩余物转移到100mL的单口烧瓶中，加入二氯甲烷6mL和三氟乙酸3mL，常温搅拌6h。浓缩，回收二氯甲烷，即得亮-亮-缬-N-甲基-亮-2-萘丙氨酸五肽，无需纯化直接用于下步反应。

2、亮-亮-缬-N-甲基亮-2-萘丙氨酸环五肽(LX-4)的合成。

在盛有3mmol PyAOP、1mmol HATU、3.5mmol(8mL)二异丙基乙胺、240mL二氯甲烷、240mL四氢呋喃和60mL N,N-二甲基甲酰胺的1000mL的单口瓶中，于搅拌的同时缓慢加入0.5mmol上步获得的链五肽粗产物的四氢呋喃溶液。常温搅拌反应72h，减压除去溶剂。残余物中加水400mL，用90mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用90mL水、75mL 5％碳酸钾溶液、75mL 2％盐酸、90mL水、75mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。抽滤，减压除去溶剂，经硅胶柱层析纯化得目标化合物环肽LX-4，收率37％。

1H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.81(t,J＝4.5Hz,1H),7.78-7.74(m,2H),7.67(d,J＝9.0Hz,1H),7.63(s,1H),7.49-7.43(m,3H),7.34-7.32(dd,J＝8.5Hz,J＝1.5Hz,1H),7.04(d,J＝6.5Hz,1H),6.79(d,J＝7.5Hz,1H),4.77(d,J＝7.5Hz,1H),4.49(t,J＝8.5Hz,1H),4.28(d,J＝7.5Hz,1H),3.83-3.81(m,1H),3.40-3.37(dd,J＝9.0Hz,J＝6.0Hz,1H),3.34-3.25(m,2H),3.20(s,3H),2.12(brs,1H),2.03-1.88(m,3H),1.64-1.61(m,1H),1.57-1.49(m,3H),1.40-1.34(m,1H),1.28-1.25(m,1H),0.96-0.90(m,12H),0.85-0.79(m,12H)；13CNMR(125MHz,CDCl3)δ173.62,173.54,172.61,171.30,171.01,133.78,133.55,132.64,128.74,128.03,127.77,127.53,127.14,126.43,125.99,58.14(2C),55.36,54.71,53.06,40.40,39.18,37.64,37.59,30.62(2C),25.52,25.26,24.79,22.90,22.80,22.56,22.25,22.07,21.82,19.53,18.38；HRMS(ESI,M+1)计算值为C₃₇H₅₆N₅O₅650.4203,实测值为650.4221。

实例5 亮-亮-缬-亮-N-甲基萘丙氨酸环五肽(LX-5)的合成

1、亮-亮-缬-亮-N-甲基萘丙氨酸五肽的合成。

按照实例1所描述的3+2的方法，合成得到Boc-亮-亮-缬-亮-N-甲基萘丙氨酸甲酯后，将其0.5mmol溶解于3mL四氢呋喃，并转入100mL的单口烧瓶中。在搅拌的同时加入3mmol氢氧化锂与2.5mL水和17.5mL四氢呋喃形成的溶液，常温搅拌过夜。减压除去四氢呋喃，加水60mL，用稀盐酸调pH＝3-4，60mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无水硫酸镁干燥过夜。减压回收溶剂后，得到的剩余物转移到100mL的单口烧瓶中，加入二氯甲烷6mL和三氟乙酸3mL，常温搅拌6h。浓缩，回收二氯甲烷，即得亮-亮-缬-亮-N-甲基萘丙氨酸五肽，无需纯化直接用于下步反应。

2、亮-亮-缬-亮-N-甲基萘丙氨酸环五肽(LX-5)的合成。

在盛有3mmol PyAOP、1mmol HATU、3.5mmol(8mL)二异丙基乙胺、240mL二氯甲烷、240mL四氢呋喃和60mL N,N-二甲基甲酰胺的1000mL的单口瓶中，于搅拌的同时缓慢加入0.5mmol上步获得的链五肽粗产物的四氢呋喃溶液。常温搅拌反应72h，减压除去溶剂。残余物中加水400mL，用90mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用90mL水、75mL 5％碳酸钾溶液、75mL 2％盐酸、90mL水、75mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。抽滤，减压除去溶剂，经硅胶柱层析纯化得目标化合物环肽LX-5，收率30％。

1H NMR(500MHz,MeOD)δ7.83-7.78(m,3H),7.70(s,1H),7.48-7.43(m,2H),7.40-7.38(dd,J＝8.5Hz,J＝1.5Hz,1H),4.67-4.64(dd,J＝11.0Hz,J＝4.0Hz,1H),4.58(brs,2H),4.53-4.50(m,1H),3.52-3.49(dd,J＝14.0Hz,J＝4.5Hz,1H),3.28(brs,1H),3.21-3.18(m,1H),3.15(s,3H),2.67-2.59(m,1H),1.79-1.73(m,1H),1.70-1.65(m,2H),1.63-1.55(m,2H),1.51-1.45(m,1H),1.40-1.27(m,3H),1.01-0.95(m,18H),0.77(d,J＝6.5Hz,3H),0.68(d,J＝7.0Hz,3H)；13C NMR(125MHz,MeOD)δ174.87,174.67,173.94,173.41(2C),136.41,134.94,133.96,129.39,128.87,128.66,128.55,127.92,127.22,126.78,67.52,66.40,57.23,54.09,49.00,41.38,40.75,39.65,37.68,37.51,29.22,26.31,26.25,26.00,23.63,23.02,22.93,22.65,22.58,21.50,20.24,19.80；HRMS(ESI,M+1)C₃₇H₅₆N₅O₅计算值为650.4203,实测值为650.4236。

化合物(LX-9),将实例5中N-甲基-(2-萘基)丙氨酸用N-甲基-[2-(5-甲氧基萘基)]丙氨酸代替即可合成之，收率24.6％。

实例6 脯-亮-缬-亮-萘丙氨酸环五肽(LX-11)的合成

1、脯-萘丙氨酸甲酯二肽的合成。

将2mmol的L-2-萘丙氨酸甲酯、3mmol Boc-L-脯氨酸、2.4mmol HATU、14mmolDIPEA、50mL DCM和5mL DMF加入到带有干燥管的100mL单口烧瓶中，室温搅拌过夜。减压蒸去溶剂，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥过夜。抽滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到白色固体，收率80％。然后将此溶解到12mL DCM和8mL TFA中，于室温下搅拌反应6h。减压除去DCM和TFA，得脯-2-萘丙氨酸甲酯二肽。

2、Boc-亮-亮-缬三肽的合成。

在带有干燥管的100mL单口烧瓶中，加入2mmol的缬氨酸甲酯、3mmol Boc-亮氨酸、2.4mmol HBTU、14mmol DIPEA、50mLDCM和5mL DMF，室温搅拌过夜。减压浓缩，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，在剩余物中加入12mL DCM和8mL TFA，室温下搅拌反应6h。减压除去DCM和TFA，获得亮-缬甲酯三氟醋酸盐。将此盐溶于50mL DCM和5mL DMF，此后加入3mmol Boc-亮氨酸和2.4mmol HBTU以及14mmol的DIPEA，搅拌过夜。反应液浓缩，在所得残余物中加入300mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、5％K₂CO₃、2％HCl饱和NaCl各洗3次，无水硫酸镁干燥干燥过夜。过滤、浓缩，产物经硅胶柱层析纯化，得固体产物，产率98％。用52.5mL THF溶解所得固体，并转移到盛有18mmol LiOH与15mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌过夜。减压除去THF，加入60mL水，用2％盐酸调节溶液的pH至3-4，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥过夜。过滤，浓缩，即得Boc-亮-亮-缬三肽。

3、脯-亮-缬-亮-萘丙氨酸五肽的合成。

在带有干燥管的100mL单口烧瓶中，加入2mmol的脯-2-萘丙氨酸甲酯二肽、3mmolBoc-亮-亮-缬三肽、2.4mmol HBTU、14mmol DIPEA、50mLDCM和5mL DMF，室温搅拌过夜。减压浓缩，加水300mL，用60mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到白色固体，产率69％。用17.5mL THF溶解0.5mmol所得固体，并转移到盛有3mmol LiOH与2.5mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌过夜。用TLC跟踪反应，待反应结束后减压除去THF。在残余物中加水60mL，用稀盐酸调pH＝3-4，60mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无水硫酸镁干燥过夜。减压浓缩获得Boc-亮-N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸五肽。溶解到6mL DCM和4mL TFA中，于室温下搅拌反应6h。减压除去DCM和TFA，即得脯-亮-缬-亮-萘丙氨酸五肽。

4、脯-亮-缬-亮-萘丙氨酸环五肽的合成。

将0.5mmol的脯-亮-缬-亮-萘丙氨酸五肽加入到带有干燥管的1 000mL的单口瓶中(注射泵滴加)，加入3mmol PyAOP、1mmol HATU、3.5mmol DIPEA、240mL DCM、240mL THF和60mL DMF，常温搅拌72h。减压除去溶剂，加水400mL，用90mL乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。有机相依次用水、5％K₂CO₃、2％HCl、饱和NaCl各洗三次，无水硫酸镁干燥过夜。抽滤，减压除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，得脯-亮-缬-亮-萘丙氨酸环五肽，产率31％。

1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.43(d,J＝9.0Hz,1H),7.87(d,J＝7.5Hz,1H),7.83-7.80(m,3H),7.57(s,1H),7.49-7.42(m,3H),7.29-7.27(dd,J＝8.5Hz,J＝1.5Hz,1H),7.06(d,J＝9.5Hz,1H),4.75-4.71(m,1H),4.44(d,J＝7.5Hz,1H),4.29-4.26(dd,J＝9.0Hz,J＝3.0Hz,1H),4.15(t,J＝9.5Hz,1H),3.73-3.68(m,1H),3.51-3.48(m,1H),3.41-3.37(m,1H),3.08-3.04(dd,J＝13.5Hz,J＝5.5Hz,1H),2.95-2.90(m,1H),1.93-1.83(m,2H),1.75-1.69(m,1H),1.60-1.55(m,1H),1.53-1.44(m,3H),1.39-1.34(m,1H),1.32-1.21(m,3H),0.89-0.83(m,13H),0.76-0.73(m,5H)；13C NMR(125MHz,DMSO)δ171.67,171.30,170.63,170.30,169.71,134.88,133.14,132.27,128.25,128.09,127.90(2C),127.62,126.42,125.93,61.28,55.38,55.09,54.73(2C),46.61,42.05,40.70(2C),32.50,31.55,24.77,24.68,23.39,23.09,22.59,22.26,21.17,18.90,18.53；HRMS(ESI,M+1)C₃₅H₅₀N₅O₅,计算值为620.3734,实测值为620.3820。

化合物(LX-12)可用类似的方法合成，收率32％。

实例7 抗肿瘤活性实验

基于磺酰罗丹明B(SRB)法进行测试，将待测样品抗肿瘤N-甲基环五肽化合物分别配制成1000、500、250、100、50、10μmol/L等不同浓度的DMSO溶液。

将选择的肿瘤细胞悬浮于10％新鲜的胎牛血清的PRMI或DMEM培养液中，胰酶消化，并细胞计数，将细胞浓度定容到5×10⁴cells/mL，96孔板中每孔加入90μL细胞，每孔大约4500个细胞，然后在每孔中加入不同浓度的药液10μL，在37℃、100％相对湿度和含CO₂与空气比例为5：95的混合气氛的培养箱中培养48h。96孔板弃液，轻柔加入100ul10％TCA，4℃固定30min；弃液，每孔加入100ul ddH₂O洗三次，室温干燥1h或更久；加入100ul 0.4％SRB，染色20min(平板震荡)；弃染液，1％乙酸洗三次，室温干燥6h或过夜；加入100ul Trisbase溶解，平板震荡5min，用酶标仪测定在570nm处与活细胞数相关的溶液吸光率，测定细胞增殖情况。每组实验均有备份，报道数据为其平均值。

在0.05μmol/mL的条件下亮-N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸环五肽对小鼠黑色素瘤细胞株B16、胃癌细胞株BGC-823、***细胞株Hela、乳腺癌细胞株MDA-MB231、乳腺癌细胞株MCF-7以及胰腺癌细胞株BXPC-3的抑制率超过80％，并且具有诱导小鼠黑色素瘤细胞株B16凋亡的作用。

实验证明本发明的抗肿瘤N-甲基环五肽化合物对多种肿瘤细胞，显示出良好的活性。特别是针对小鼠黑色素瘤细胞株B16、胃癌细胞株BGC-823、***细胞株Hela、肾透明癌细胞786-O、乳腺癌细胞株MDA-MB231、乳腺癌细胞株MCF-7以及胰腺癌细胞株BXPC-3更为突出。且本发明的抗肿瘤N-甲基环五肽化合物在50μM浓度下，对正常细胞的毒性极低。本发明的N-甲基环五肽对平滑肌细胞、淋巴细胞以及心肌细胞具有非常小的副作用；N-甲基环五肽对肿瘤细胞的抑制作用是通过诱导凋亡的途径发挥作用的。

表一：LX-1、LX-2、LX-3、LX-5，N-甲基环五肽化合物抗肿瘤活性IC50(μM)

实例8 Western-Blot检测化合物LX-3(亮-N-甲基-亮-缬-亮-2-萘丙氨酸环五肽)对B16细胞中Caspase相关蛋白的表达。

请配合参阅图1所示，LX-3对B16作用的Western-Blot检测结果图像，由图中可知，caspase-9诱导caspase-3的表达，从而对肿瘤细胞的凋亡发挥作用，因此，包括LX-3的N-甲基环五肽对B16的抑制是通过caspase-9诱导caspase-3执行肿瘤细胞凋亡的途径发挥作用。在实际应用的过程中，可以利用N-甲基环五肽化合物对caspase-9的作用，作为抗肿瘤药物的候选物得以应用，以caspase-9作为药物靶标，开发制备抗肿瘤的药物中的应用。

具体的，得到图1的实验结构，需以下步骤：

将蛋白样品与上样缓冲液混匀，煮沸5min，冷却至室温，加入凝胶板上样孔中，上样量约为40～60μg，灌制成12％的分离胶和5％的浓缩胶。施加90V稳压电泳约30min，待蛋白样品至分离胶和浓缩胶界面时，换用120V稳压电泳，至溴酚蓝前缘移动到凝胶底部，约1.5h。取出凝胶，并将制备好的PVDF膜平铺在凝胶上，PVDF膜和凝胶两侧各放三层滤纸，凝胶在负极，PVDF膜在正极，放入电转仪中，4℃、200～300mA，转移时间1～2h。取出PVDF膜，置于5％BSA(牛血清白蛋白)的TTBS中，37℃封闭1h。此后将PVDF膜置入用TTBS适当稀释的一抗中，4℃缓慢摇动孵育过夜。用TTBS洗涤10min×3次后，置于TTBS稀释的相应二抗(稀释比例为1:500)中，37℃孵育2h。TTBS洗膜20min×3次，ECL发光，暗室曝光，凝胶成像***扫描分析。

本发明的N-甲基环五肽化合物，在其结构中，没有确切的碳端和氮端，特别是N-甲基化后，该N-甲基环五肽化合物在体内不易降解，有较长的半衰期，表现出良好的酶稳定性，所以N-甲基环五肽化合物可在制备抗胃癌药物、抗***药物、抗肾透明癌药物或抗胰腺癌药物中的应用。

以上仅为本发明的较佳实施例，不得以此限定本发明实施的保护范围，因此凡参考本发明的说明书内容所作的简单等效变化与修饰，仍属本发明的保护范围。

Claims

1.一种具有促使黑色素肿瘤细胞、胃癌细胞、***细胞、肾透明癌细胞或胰腺癌细胞凋亡活性的N-甲基环五肽化合物，具有化学式LX-1、LX-2、LX-3、LX-5中的一种

2.权利要求1所述的N-甲基环五肽化合物，其在制备治疗胃、宫颈、胰腺、黑色素、肾透明癌症的药物中的应用。