CN113116872B - 紫檀芪在抗甲型流感病毒药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗流感病毒应用的技术领域，具体涉及紫檀芪在抗甲型流感病毒药物方面的应用。一种紫檀芪在抗甲型流感病毒药物方面的应用，所述单体紫檀芪靶向流感病毒非结构蛋白NS1，抑制宿主PI3K/Akt信号通路激活，发挥抗病毒作用，可以用于制备预防和治疗流感的药物；所述单体紫檀芪能作为先导化合物进行结构修饰，获得活性更好地化合物并制成抗流感病毒药物。紫檀芪作为一种天然单体，为流感病毒性疾病的预防和治疗提供一种新的小分子天然药物，能够抑制甲型流感病毒感染宿主细胞，从而为流感病毒性疾病的预防和治疗提供一种新的途径和手段，具有重要的研发价值和开发意义。

Description

紫檀芪在抗甲型流感病毒药物方面的应用

技术领域

本发明属于抗流感病毒应用的技术领域，具体涉及紫檀芪在抗甲型流感病毒药物方面的应用。

背景技术

流行性感冒（简称流感），是一种由流感病毒引起的呼吸道传染病，具有发病率高、流行广泛、传播迅速等特点，对社会卫生健康及经济造成严重威胁与负担，据世界卫生组织统计，每年的季节性流感可导致大约300万至500万例重症病例，30万至50万例病例死亡。

接种疫苗是预防流感病毒感染的主要防线和最有效途径，由于甲型流感病毒的抗原性易发生变异，使机体内已形成的自身免疫记忆失效，因此，每年都需要根据当年的流行病毒株研发和接种新的疫苗，大大限制了疫苗的预防作用。抗病毒药物的使用是治疗流感的主要途径。目前临床上应用的两类抗病毒药物主要是靶向流感病毒蛋白，分别是M2离子通道抑制剂（如金刚烷类药物）以及神经氨酸酶抑制剂（如扎那米韦、奥司他韦以及帕拉米韦）。前者只能抑制甲型流感病毒，对乙型流感病毒无效，且在临床上已应用多年，已导致普遍耐药，故临床上治疗流感不再首选烷胺类药物。后者对甲、乙型流感病毒均有效，在2008年以前应用广泛，目前已经检测到耐奥司他韦的病毒株H1N1pdm09，且扎那米韦耐药性也因被广泛滥用而日益增。因此，迫切需要具有新作用机制的新型流感治疗药物来对抗流感病毒的持续威胁。

近年来，中药在治疗流感（如H5N1、H7N9）、SARS及现阶段流行的新型冠状病毒等病毒感染性疾病中发挥了重要作用，中药在病毒感染中的作用收到了国内外专家学者的高度关注，流感病毒感染归属中医学“瘟疫”、“温病”等范畴，为感受非时之气或疫疠之邪，外淫肌腠，内蕴肺胃而为病。在COVID-19流行期间，中药的应用及其良好的治疗效果将应用中医药治疗病毒感染性疾病再一次推上热点，人们愈来愈热衷于从植物中寻找治疗重大疾病的药物或先导化合物。因此，临床急需开发新型抗流感药物。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种紫檀芪在抗甲型流感病毒药物方面的应用，紫檀芪作为一种天然单体，能够抑制甲型流感病毒感染宿主细胞，从而为流感病毒性疾病的预防和治疗提供一种新的途径和手段。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种紫檀芪在抗甲型流感病毒药物方面的应用。

所述单体紫檀芪靶向流感病毒非结构蛋白NS1，抑制宿主PI3K/Akt信号通路激活，发挥抗病毒作用，可以用于制备预防和治疗流感的药物；

所述单体紫檀芪能作为先导化合物进行结构修饰，获得活性更好地化合物并制成抗流感病毒药物；

所述单体紫檀芪在制备抗甲型流感的药物方面的应用，结合现代常用药物制剂手段，可将所述的化合物制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液，从而采用比较方便的口服给药形式。

上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

紫檀，又名：榈木、花榈木、蔷薇木、羽叶檀、青龙木、黄柏木。分布广东、云南等地；夏、秋季采。我国早已发现紫檀的功效并应用于古代医学。根据古代文献《本草经疏》中记载：“紫真檀，主恶毒风毒。凡毒必因热而发，热甚则生风，而营血受伤，毒乃生焉。此药咸能入血，寒能除热，则毒自消矣。弘景以之敷金疮、止血止痛者，亦取此意耳。宜与番降真香同为极细末，敷金疮良。”现代医学研究发现，紫檀具有抗癌，抗氧化，治疗大鼠雄激素性脱发、消肿抗炎等功效；通过药理成分分析，紫檀含紫檀素、高紫檀素、紫檀红、脱氧紫檀红、紫檀芪、紫檀醇等有效成分。紫檀芪（Pterostilbene），又名3，5-二甲氧基-4'-羟基二苯乙烯（如图1），最早发现于紫檀中的得名，还广泛存在于蓝莓、葡萄等浆果中。大量研究证实，紫檀芪具有抗氧化、抗炎、抗衰老、调节血脂、肝肾保护等作用；同时，对代谢性疾病、心血管疾病、癌症等具有防治作用。

本发明的有益效果如下：

本发明的紫檀芪在抗甲型流感病毒药物方面的应用，紫檀芪作为一种天然单体，能够抑制甲型流感病毒感染宿主细胞，从而为流感病毒性疾病的预防和治疗提供一种新的途径和手段，具有重要的研发价值和开发意义；

本发明首次发现紫檀芪具有抗甲型流感病毒的作用，为流感病毒性疾病的预防和治疗提供一种新的小分子天然药物；

本发明的紫檀芪在浓度范围内没有细胞毒性，可以用于制备预防和治疗流感的药物；

本发明的紫檀芪可以作为先导化合物进行结构修饰；

本发明的紫檀芪抗甲型流感病毒的作用机制为靶向流感病毒NS1蛋白，抑制NS1蛋白与宿主PI3K/Akt信号通路相互作用，抑制病毒复制，可以用于制备预防和治疗流感的药物。

附图说明

图1为紫檀芪的化学结构式；

图2为紫檀芪用于细胞毒性实验结果图；

图3为紫檀芪抑制流感病毒蛋白表达的检测结果图；

图4为紫檀芪抑制流感病毒子代病毒复制的检测结果图；

图5为紫檀芪抑制流感病毒基因表达的检测结果图；

图6为紫檀芪对流感病毒NP蛋白表达抑制作用的检测结果图；

图7为采用时间点加药实验检测紫檀芪作用于病毒复制后期的结果图；

图8为紫檀芪与NS1蛋白之间结合作用的实验结果图；

图9为紫檀芪抑制流感感染后PI3K/Akt信号通路激活图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

材料准备：

人肺上皮细胞A549在含有10%热灭活胎牛血清（FBS），50单位毫升青霉素和50微克/毫升链霉素（P/S）的RPMI1640培养基中培养；

犬肾细胞（MDCK）在含有10%热灭活胎牛血清（FBS），50单位毫升青霉素和50微克/毫升链霉素（P/S）的DMEM培养基中培养；

流感病毒Influenza A/WSN/1933在9天的鸡胚中扩增后，存放于-80℃的环境中。

所有与病毒相关实验均在生物安全2级设施中进行。

实施例1

紫檀芪用于呼吸道上皮细胞以及毒性评估：

将A549细胞以1×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜；

细胞弃去上清，将倍比稀释的紫檀芪加入肺上皮细胞（A549）中；

MTT 法检测紫檀芪对呼吸道上皮细胞的细胞毒性：48小时后，弃去上清，将含有0.5 mg/ml MTT的培养基加入各孔，37℃孵育4 h后，酶标仪检测OD570 nm的吸光度。

如图2所示，实验结果表明，紫檀芪对A549细胞毒性较小，在最大浓度200μM时，细胞生存率>75%。

实施例2

紫檀芪用于呼吸道上皮细胞以及抑制病毒感染能力的评价：

1）将A549细胞以3×10⁵/孔接种于6孔板中，在37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜；

2）细胞弃去上清，以无血清的RPMI1640培养基稀释病毒，以MOI=1的病毒滴度接种A549细胞，在37℃、5% CO2培养箱中吸附1h；

3）病毒感染后，弃去病毒上清，将无血清RPMI1640倍比稀释的紫檀芪加入细胞中，在37℃、5% CO₂培养箱中继续培养；

4）24小时后，a）收集细胞蛋白，采用western blot检测流感病毒相关蛋白NP，M2及PB2的表达，结果如图3所示；与病毒对照组相比，细胞中加入紫檀芪处理后，流感病毒蛋白NP，PB2及M2的表达水平均低于对照组。

b）收集细胞上清，空斑实验检测维持液中子代病毒滴度，结果如图4所示：与病毒感染对照组相比，紫檀芪可以有效抑制流感病毒感染细胞中子代病毒的滴度，抑制效果呈浓度依赖性。

c）提取细胞RNA，采用Real-time PCR检测流感病毒相关基因的表达，结果如图5所示；20μM紫檀芪可以有效抑制流感病毒NP及PB2基因mRNA在A549细胞内表达。

由上表明，紫檀芪可以明显抑制流感病毒NP，M2及PB2蛋白的表达，抑制子代病毒的产生，同时抑制病毒基因的表达，表现出有效的抗流感作用。

实施例3

紫檀芪用于呼吸道上皮细胞以及检测对NP的表达：

1）A549细胞以2×10⁴个/孔接种于激光共聚焦培养皿，在5% CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h；

2）弃培养上清，PBS洗2次，加入200μL病毒液（MOI=1），于5% CO₂，37℃的细胞培养箱中吸附细胞1h；

3）弃病毒液，将指定浓度的化合物加入到培养皿中，设细胞对照孔和病毒对照孔，继续培养24h；

4）弃上清，经预冷的PBS洗3次；

5）细胞的固定和封闭：每孔加入200 μL 4%的多聚甲醛固定20min，PBS洗3次，用200 μL 3%牛血清蛋白液室温封闭1h；

6）孵一抗：弃封闭的牛血清蛋白液，每孔加入200 μL用3%牛血清蛋白液稀释的NP蛋白的一抗，4℃孵育过夜；

7）孵二抗：弃一抗，用0.05% PBST缓冲液洗涤3次，每次10min；加入200 μL叫用3%牛血清蛋白液稀释的二抗，室温孵育1h，用0.05% PBST缓冲液洗涤6次，每次5min；

8）细胞核染色：加入DAPI细胞核染料，室温染色5min，用PBS洗3次，每孔加入200 μL的PBS；

9）观察：通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM），选取不同的激发波长，观察绿色部分的NP蛋白以及蓝色部分的细胞核，每孔随机选取3个视野进行拍下NP蛋白在细胞核与细胞质中的分布情况。

如图6所示，实验结果表明，紫檀芪可以有效抑制宿主细胞中病毒NP蛋白的表达。

实施例4

紫檀芪用于呼吸道上皮细胞以及时间点加药实验：

1）A549细胞以2×10⁴个/孔接种于激光共聚焦培养皿，在5% CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h；

2）弃培养上清，PBS洗2次，加入200 μL病毒液（MOI=1），于5% CO₂，37℃的细胞培养箱中吸附细胞1h；

3）弃病毒液，PBS洗2次，在病毒单轮复制期间，于不同的时间间隔（0~2、2~5、5~8、8~10、0~10h）加入指定浓度的化合物；

4）于病毒感染后8h，弃上清，经预冷的PBS洗2次，Western blot检测病毒NP 蛋白的表达水平。

如图7所示，在病毒感染的各个阶段加入紫檀芪进行干预，在0-2小时病毒进入阶段，紫檀芪对NP蛋白表达没有明显的抑制作用；而在病毒的基因表达2-5小时和蛋白合成5-8小时阶段，紫檀芪对NP蛋白表达具有明显的抑制作用；由此可知，紫檀芪主要作用于病毒进入宿主细胞后的复制阶段。

实施例5

紫檀芪与NS1蛋白之间的结合：

从Protein Data Bank上下载H1N1 A/PuertoRico/8/1934(H1N1) NS1蛋白（PDB编号：3L4Q，分辨率：2.3 Å）。采用USCF Chimera准备蛋白和配体分子的结构，去除溶剂分子，修补蛋白质肽链。采用Chimera 中的DMS工具以半径为1.4 Å的探针生成蛋白的分子表面，使用sphgen模块生成围绕活性位点的球状集合（Spheres），使用Grid模块生成Grid文件，该文件用于快速的基于Grid的能量打分评价。采用DOCK6程序进行柔性对接（flxibledocking），生成1000个不同的构象取向（orientation）以及获得化合物与结合口袋中残基间的静电和范德华相互作用，并由此计算得到Grid打分。通过聚类分析，得到打分最佳的构象。最后，通过Chimera分析计算结果，并采用PyMOL生成图片。

如图8所示，NS1蛋白在病毒复制及调控宿主细胞抗病毒免疫反应中发挥重要的作用。NS1蛋白通过其ED结构域，与宿主细胞PI3K蛋白相互作用，干扰病毒感染后IRF3的磷酸化激活，进而帮助病毒对抗宿主抗病毒免疫反应。分子对接结果显示，紫檀芪可能通过靶向氨基酸残基位点为HIS169与GLN563有效结合于流感病毒非结构蛋白1（NS1）ED结构，干扰流感NS1蛋白的调控作用。

实施例6

紫檀芪用于呼吸道上皮细胞以及对病毒感染后PI3K/Akt信号通路调控作用：

1）将A549细胞以3×10⁵/孔接种于6孔板中，在37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜。

2）细胞弃去上清，PBS清洗细胞2次，以无血清的RPMI1640培养基稀释病毒，以MOI=1的病毒滴度接种A549细胞，在37℃、5% CO₂培养箱中吸附1h；

3）病毒感染后，弃去病毒上清，将无血清RPMI1640倍比稀释的紫檀芪加入细胞中，在37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。

4）24小时后，收集细胞蛋白，采用western blot检测PI3K/ Akt信号通路相关蛋白的表达。

如图9所示，PI3K蛋白通过其p85-β亚基与流感病毒NS1蛋白之间相互作用，进而激活下游信号分子Akt发生磷酸化，通过抑制病毒感染细胞凋亡等方式，帮助病毒在细胞内生存。我们的实验结果显示，紫檀芪可以有效抑制病毒感染后磷酸化p-Akt的表达明显降低，其作用呈浓度依赖性。

综上，我们推测小分子化合物紫檀芪通过靶向流感病毒NS1蛋白ED结构域，抑制NS1与PI3K相互作用，进而抑制PI3K/Akt信号通路激活，从而抑制病毒感染宿主细胞。

Claims (3)

1.一种紫檀芪在制备抗甲型流感病毒药物方面的应用，其特征在于，所述紫檀芪作为唯一的活性成分。

2.由权利要求1所述的紫檀芪在制备抗甲型流感病毒药物方面的应用，其特征在于，所述紫檀芪靶向流感病毒非结构蛋白NS1，抑制宿主PI3K/Akt信号通路激活。

3.由权利要求1所述的紫檀芪在制备抗甲型流感病毒药物方面的应用，其特征在于，所述紫檀芪制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或者口服液的一种。

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