CN115531384A - 双苄基异喹啉类生物碱在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用 - Google Patents
双苄基异喹啉类生物碱在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于兽药技术领域，具体涉及一种双苄基异喹啉类生物碱在制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)药物中的应用。所述双苄基异喹啉类生物碱：莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱、千金藤碱、粉防己碱、防己诺林碱、小檗胺可以显著抑制ASFV的增殖，对ASFV的半数有效抑制浓度为0.31～2.34μM。并且，所述双苄基异喹啉类生物碱对ASFV天然靶细胞猪肺泡巨噬细胞的毒性作用较小，能在无细胞毒性的浓度下对ASFV具有显著的抗病毒活性，安全性高；再加上所述双苄基异喹啉类生物碱来源于常见中药，来源广泛、成本低廉，非常适合开发防治非洲猪瘟的药物。
Description
技术领域
本发明属于兽药技术领域。更具体地，涉及一种双苄基异喹啉类生物碱在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)感染所引起的一种传染性极高的病毒病，该病发病率高，发病猪常表现出急性、热性、出血性临床症状，其器官则呈现严重的血管性病变，例如***出血、肾脏出血、弥漫性血管内凝血、血小板减少等特点，死亡率接近100％。 ASF是世界动物卫生组织(OIE)法定通报疾病，是我国一类动物疫病，在《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中被列为优先防治类疫病。非洲猪瘟病最早于1921年在非洲肯尼亚被发现；1957年，ASF首次在非洲大陆以外的葡萄牙爆发；2007年，ASFV再次由非洲大陆传入欧亚接壤的高加索地区；2018年，中国爆发首例ASF疫情，随后在周边国家陆续爆发。 ASF已经成为对全球养猪业危害最严重的传染病，造成了严重的经济损失。
疫苗和抗病毒药物是预防和控制病毒性疾病的有效手段。如中国专利申请CN110093324A公开了一种基因缺失的减毒ASFV及其作为疫苗的应用，采用 ASF中国流行株Pig/CN/HLJ/2018经基因工程技术，将ASFV的毒力基因缺失，从而获得MGF360-505R缺失和CD2V与MGF360-505R联合缺失的基因缺失病毒，进一步将其作为疫苗对ASF中国流行强毒株的免疫保护高达100％；类似地，中国专利申请CN114107228A公开了一种缺失十二个基因的减毒ASFV疫苗株以及含有疫苗株的疫苗，该疫苗通过对中国流行株ASFV CN/GS 2018株进行减毒制备相应的ASFV疫苗。但由于安全性、毒力返强等多种原因，目前ASF减毒疫苗在中国未能批准上市，并且随着病毒的不断重组和进化，减毒疫苗可能对新的变异亚型ASFV失去免疫保护作用。除了疫苗，中国专利申请CN113797184A 公开了丹叶大黄素在制备防治ASFV药物中的应用，通过实验证明，在低于最大无毒剂量条件下，丹叶大黄素能够有效的抑制ASFV在细胞中的感染和增殖。但目前有关防治ASF药物的研究报道较少，至今还没有临床具有抗ASFV作用的药物。因此，抗ASFV的药物研发需求迫切。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有抗ASFV药物缺乏，无药可用的局面，提供一种双苄基异喹啉类生物碱在制备抗ASFV药物中的应用。
因此，本发明的目的是提供一种双苄基异喹啉类生物碱在制备防治ASF药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
双苄基异喹啉类生物碱(Bisbenzylisoquinolie alkaloid)是植物界分布范围较为广泛，且具有多变结构类型和多样生理活性的一大类天然存在的生物碱，存在于毛莨科、防已科、小檗科、木兰科、番荔科等植物中。双苄基异喹啉类生物碱是由两个苄基异喹啉单位通过一个氧桥连接形成，根据生物碱醚键数目、取代情况、连接位置的不同将其分成26个结构类型，常见的双苄基异喹啉类生物碱有：莲心碱(Liensinine)、异莲心碱(Isoliensinine)、甲基莲心碱(Neferine)、蝙蝠葛碱(Dauricine)、；千金藤碱(Cepharanthine)、粉防己碱(Tetrandrine)、防己诺林碱(Fangchinoline)、小檗胺(Berbamine)等。现有药理学研究表明，上述双苄基异喹啉类生物碱具有钙离子拮抗、降血压、抗癌、神经保护、镇静、抗骨质疏松、抗过敏、抗炎、抗氧化等作用。
发明人经过研究发现，上述双苄基异喹啉类生物碱：莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱、千金藤碱、粉防己碱、防己诺林碱、小檗胺可以显著减少 ASFV-p30蛋白的合成及ASFV-B646L的基因复制，显著抑制ASFV在其靶细胞猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中的增殖。并且，所述双苄基异喹啉类生物碱来源于常见中药，来源广泛、成本低廉。同时所述双苄基异喹啉类生物碱对正常细胞的毒性作用较小，选择指数较好，在无细胞毒性浓度下对ASFV具有显著抗病毒活性，安全性高。
因此，本发明要求保护双苄基异喹啉类生物碱在制备抗ASFV药物中的应用，所述双苄基异喹啉类生物碱为莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱、千金藤碱、粉防己碱、防己诺林碱、小檗胺。
具体的，所述双苄基异喹啉类生物碱具有以下式(I)～式(VIII)任一结构：
进一步地，所述双苄基异喹啉类生物碱还包括所述莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱、千金藤碱、粉防己碱、防己诺林碱或小檗胺药学上可接受的盐、溶剂化物、异构体或酯。
本发明中，术语“药学上可接受的盐”通常指当以适当的方式用于治疗时(特别是在人类和/或哺乳动物中应用或使用时)在生理学上可耐受的任何盐(通常来说，这意味着它是无毒的)。这些生理上可接受的盐可以是与阳离子或碱形成的，并且在本发明的上下文中，尤其是在人类和/或哺乳动物中施用时，它们应该被理解为由按照本发明所提供的至少一种化合物，通常为酸(去质子化的)，如阴离子和至少一种生理学上耐受的阳离子(优选无机阳离子)形成的盐。这些生理上可接受的盐也可以是与阴离子或酸形成的，并且在本发明的上下文中，特别是在人类和/或哺乳动物中施用时，它们应该被理解为由按照本发明所提供的至少一种化合物，通常质子化的(例如在氮上)，如阳离子和至少一种生理上可耐受的阴离子形成的盐。在本发明的上下文中，具体地可以包括由生理上可耐受的酸形成的盐，即特定的活性化合物与生理上可耐受的有机或无机酸形成的盐，具体可以包括但不限于与盐酸、氢溴酸、硫酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、扁桃酸、富马酸、乳酸或柠檬酸形成的盐。
本发明中，术语“溶剂化物”通常指任何形式的根据本发明的活性化合物通过非共价键与另一分子(通常为极性溶剂)相结合所获得的物质，具体可以是包括但不限于水化物和醇化物，例如甲醇化物。
更进一步地，所述双苄基异喹啉类生物碱抑制ASFV的复制。
更进一步地，所述双苄基异喹啉类生物碱对ASFV的半数有效浓度(EC50) 为0.31～2.34μM。
进一步地，所述双苄基异喹啉类生物碱的选择指数(SI)为15.58～65.90。
更进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、着色剂、乳化剂或稀释剂。
进一步地，所述药物为注射制剂、口服制剂、雾化吸入制剂或透皮制剂。
另外的，本发明还要求保护所述双苄基异喹啉类生物碱在制备防治ASF药物中的应用，所述双苄基异喹啉类生物碱为莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱、千金藤碱、粉防己碱、防己诺林碱或小檗胺。
进一步地，所述双苄基异喹啉类生物碱还包括所述莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱、千金藤碱、粉防己碱、防己诺林碱或小檗胺药学上可接受的盐、溶剂化物、异构体或酯。
本发明具有以下有益效果：
本发明双苄基异喹啉类生物碱：莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱、千金藤碱、粉防己碱、防己诺林碱、小檗胺可以显著减少ASFV-p30蛋白的合成及ASFV-B646L的基因复制，抑制病毒在PAMs中的增殖，达到显著的抗病毒效果。并且，所述双苄基异喹啉类生物碱对正常细胞的毒性作用较小，选择指数较好，在无细胞毒性的浓度下对ASFV具有显著的抗病毒活性，安全性高；再加上所述双苄基异喹啉类生物碱来源于常见中药，来源广泛、成本低廉，非常适合开发防治ASF的药物。
附图说明
图1为实施例2中用IFA分析不同浓度双苄基异喹啉类生物碱在PAMs中对 ASFV-p30蛋白合成抑制作用试验的结果数据统计图。
图2为实施例3中用实时荧光定量PCR测定不同浓度双苄基异喹啉类生物碱在PAMs中对ASFV-B646L基因复制抑制作用试验的结果数据统计图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：8种双苄基异喹啉类生物碱对PAMs的半数细胞毒浓度(CC50)、抗ASFV活性半数有效浓度(EC50)及选择指数(SI)
1、双苄基异喹啉类生物碱对PAMs的半数细胞毒浓度(CC50)测定
复苏猪肺泡巨噬细胞(PAMs)(杀猪取肺分离得到，并提前保存于液氮罐中待用)，使用RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清，100U/mL青霉素、 100U/mL链霉素)重悬细胞，将2×105个/mL的PAMs接种在96孔板中，每孔100μL，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。培养6h后，用含有2％FBS的 1640维持液倍比稀释待测化合物，设置1.1～90μM共5个浓度梯度的8个双苄基异喹啉类生物碱药物组，含3％DMSO的溶剂对照组和空白对照组，每孔100 μL，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养48h后，弃上清，加入0.5mg/mL的 MTT溶液，每孔100μL，37℃避光孵育。4h后终止孵育，弃上清，每孔加入 DMSO 150μL，低速振荡器振荡10min，使甲瓒结晶充分溶解；用全波长酶标仪于波长570nm下检测其OD值，并计算细胞存活率。使用GraphPadPrism 9.0 软件通过非线性回归函数来计算半数细胞毒性浓度(CC50)。
计算公式如下：
2、双苄基异喹啉类生物碱在PAMs上抗ASFV活性半数有效浓度(EC50) 测定
同上复苏PAMs，使用RPMI-1640培养液重悬细胞，并按5×105个/孔接种于48孔板；设置细胞对照组、病毒组，每孔100μL，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。培养6h后，PBS洗2遍，病毒组以10MOI的ASFV感染48孔板中的PAMs，感染2h后，吸去上清病毒液，分别加入由维持液(含2％胎牛血清的RPMI-1640培养液)稀释配制不同浓度的双苄基异喹啉类生物碱，置于37℃、5％CO2培养箱继续孵育48h后终止培养。用4％多聚甲醛固定进行 IFA检测，并使用荧光倒置显微镜观察并拍照记录。利用Image J软件对各孔的荧光强度(蓝色荧光和绿色荧光))进行量化，将DMSO处理的病毒对照组设为100％，其它各组与DMSO处理组作比较，通过量化的药物处理组细胞保护率来确定半数有效浓度(EC50)值，并使用GraphPad Prism 9.0软件通过非线性回归函数来计算。计算公式如下：
3、双苄基异喹啉类生物碱在细胞上抗ASFV的选择指数(SI)
根据双苄基异喹啉类生物碱对PAMs的半数细胞毒浓度(CC50)和双苄基异喹啉类生物碱在PAMs上抗ASFV活性半数有效浓度(EC50)计算选择指数(SI)，计算公式为：SI＝CC50/EC50。结果参见表1。
表1双苄基异喹啉类生物碱的CC50和EC50及SI
| 化合物 | CC<sub>50</sub>(μM) | EC<sub>50</sub>(μM) | SI |
| 莲心碱 | 36.39 | 1.5 | 24.26 |
| 异莲心碱 | 26.16 | 1.17 | 22.36 |
| 甲基莲心碱 | 36.46 | 2.34 | 15.58 |
| 蝙蝠葛碱 | 18.28 | 0.79 | 23.14 |
| 千金藤碱 | 33.04 | 1.03 | 32.07 |
| 粉防己碱 | 62.83 | 1.38 | 45.52 |
| 防己诺林碱 | 34.6 | 1.4 | 24.71 |
| 小檗胺 | 20.43 | 0.31 | 65.9 |
由表可见，本发明的8种双苄基异喹啉类生物碱在无细胞毒性的浓度下对 ASFV均具有显著的抗病毒活性，SI在15.58～65.90之间；表明双苄基异喹啉类生物碱在无细胞毒性的浓度下对ASFV均具有显著的抗病毒活性。
实施例2：免疫荧光法评价不同浓度双苄基异喹啉类生物碱在PAMs细胞中对ASFV-p30蛋白合成的抑制作用
参考实施例1方法复苏PAMs，使用RPMI-1640培养液重悬细胞，并按 5×105个/孔接种于48孔板；设置细胞对照组(Mock组，不加受试药物，不加 ASFV)、病毒组(ASFV组，加ASFV，不加受试药物)、不同浓度的双苄基异喹啉类生物碱组，每组3个重复；37℃、5％CO2细胞培养箱中培养6h；以 10MOI的ASFV感染48孔板中的PAMs，感染2h后，吸去上清病毒液，加入由维持液(含2％胎牛血清的RPMI-1640培养液)稀释配制的不同浓度的8种双苄基异喹啉类生物碱，置于37℃、5％CO2培养箱继续孵育48h后终止培养。弃去上清液，每孔加入质量浓度为4％的低聚甲醛400μL固定30min；PBS 清洗3次，加入200μL质量浓度为0.25％TritonX-100透膜，室温下处理30 min；加入质量浓度为5％BSA封闭杂蛋白，室温封闭1h；PBS清洗3次，加入鼠源ASFV-p30单抗(1:5000稀释)，4℃孵育过夜；PBS清洗3次，避光加入二抗(Alexa
488标记抗小鼠IgG，1:1000)，37℃避光孵育1h， PBS洗净；荧光显微镜下观察，绿色荧光代表ASFV-p30蛋白。
试验结果如图1所示，由图可见，本发明的8种双苄基异喹啉类生物碱在无细胞毒性的浓度下对ASFV-p30蛋白合成具有明显的抑制作用，而且呈现显著的剂量依赖关系，表明双苄基异喹啉类生物碱在无细胞毒性的浓度下对ASFV蛋白合成具有显著的抑制作用。
实施例3：用荧光定量PCR法评价不同浓度的双苄基异喹啉类生物碱在 PAMs中对ASFV-B646L基因复制抑制作用
参考实施例1方法复苏培养PAMs，孵育ASFV，吸去上清液，PBS洗2遍，分别在攻毒后2h加入由维持液稀释的不同浓度的双苄基异喹啉类生物碱，同时设置Mock组(不加受试药物，不加ASFV)和DMSO组(加ASFV，不加受试药物)，每个受试时间点设置三个平行；并置于37℃、5％CO2培养箱继续孵育至48h后终止培养。反复冻融三次，利用DAN提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)提取DNA，用引物B646L-F和B646L-R进行荧光定量PCR 检测B646L基因的CT值，评价在PAMs中不同浓度的双苄基异喹啉类生物碱对 ASFV复制的影响。
其中，ASFV UPL上下游引物序列：
B646L-F:5’-CCCAGGRGATAAAATGACTG-3’
B646L-R:5’-CACTRGTTCCCTCCACCGATA-3’
试验结果如图2所示，图中，与病毒感染对照组比较，*P<0.05；**P<0.01； ***P<0.001，表示差异显著性；ns表示无差异显著性。由图可见，与DMSO病毒对照组比较，本发明的8种双苄基异喹啉类生物碱在无细胞毒性的浓度下减少 ASFV-B646L基因的拷贝数，而且呈现显著的剂量依赖关系；表明双苄基异喹啉类生物碱在无细胞毒性的浓度下对ASFV DAN的复制具有抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.双苄基异喹啉类生物碱在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用，其特征在于，所述双苄基异喹啉类生物碱为莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱、千金藤碱、粉防己碱、防己诺林碱或小檗胺。
2.双苄基异喹啉类生物碱在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用，其特征在于，所述双苄基异喹啉类生物碱具有以下式(I)～式(VIII)任一结构：
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述双苄基异喹啉类生物碱还包括所述莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱、千金藤碱、粉防己碱、防己诺林碱或小檗胺药学上可接受的盐、溶剂化物、异构体或酯。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐为所述双苄基异喹啉类生物碱与盐酸、氢溴酸、硫酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、扁桃酸、富马酸、乳酸或柠檬酸形成的盐。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述双苄基异喹啉类生物碱抑制非洲猪瘟病毒的复制。
6.根据权利要求1～5任一所述应用，其特征在于，所述双苄基异喹啉类生物碱对非洲猪瘟病毒的半数有效浓度为0.31～2.34μM。
7.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为注射制剂、口服制剂、雾化吸入制剂或透皮制剂。
9.双苄基异喹啉类生物碱在制备防治非洲猪瘟药物中的应用，其特征在于，所述双苄基异喹啉类生物碱为莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱、千金藤碱、粉防己碱、防己诺林碱或小檗胺。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述双苄基异喹啉类生物碱还包括所述莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱、千金藤碱、粉防己碱、防己诺林碱或小檗胺药学上可接受的盐、溶剂化物、异构体或酯。
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