CN113082068B - 滇桂艾纳香活性提取物的提取方法及其在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用 - Google Patents

滇桂艾纳香活性提取物的提取方法及其在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113082068B
CN113082068B CN202110522992.4A CN202110522992A CN113082068B CN 113082068 B CN113082068 B CN 113082068B CN 202110522992 A CN202110522992 A CN 202110522992A CN 113082068 B CN113082068 B CN 113082068B
Authority
CN
China
Prior art keywords
blumea riparia
extracting
active extract
butanol
blumea
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110522992.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113082068A (zh
Inventor
吴超权
夏星
李宇清
韦玥吟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Institute For Food And Drug Control
Original Assignee
Guangxi Institute For Food And Drug Control
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Institute For Food And Drug Control filed Critical Guangxi Institute For Food And Drug Control
Priority to CN202110522992.4A priority Critical patent/CN113082068B/zh
Publication of CN113082068A publication Critical patent/CN113082068A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113082068B publication Critical patent/CN113082068B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/35—Extraction with lipophilic solvents, e.g. Hexane or petrol ether
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种滇桂艾纳香活性提取物的提取方法及其在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用。该提取方法是将滇桂艾纳香药材用乙醇浸泡提取得到的滤液进行浓缩，浓缩后的滤液经石油醚萃取，去除石油醚部分；再经乙酸乙酯萃取，去除乙酸乙酯部分；再以正丁醇萃取，合并正丁醇滤液，真空浓缩得正丁醇提取部位；用水溶解正丁醇提取部位，大孔树脂拌样上柱，用10%‑60%乙醇洗脱，收集洗脱液，真空浓缩得到滇桂艾纳香活性提取物。本发明提取得到的滇桂艾纳香活性提取物可通过促进平滑肌收缩而促进止血，从而对功能失调性子宫出血（DUB）发挥治疗作用，能用于制备治疗功能失调性子宫出血的药物，具有广阔的应用前景。

Description

滇桂艾纳香活性提取物的提取方法及其在制备治疗功能失调 性子宫出血的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种滇桂艾纳香活性提取物的提取方法及其在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用。
背景技术
滇桂艾纳香又名白花九里明、华艾纳香，是菊科植物假东风草Blumea riparia(BL.)DC的干燥全草，常见生于林边、山坡灌丛或密林中，为广西民间常用药材，收载于《广西中药材标准》1996年版。《中华药海》中记载，滇桂艾纳香性味归经：淡、甘平，入肝、肾、膀胱三经；功效主治：活血止血-本品甘淡入肝，养肝活血、质涩，收敛止血，具有活血不伤血、止血不留瘀之功，可用于各种出血症；《新华本草纲要》中也提到其活血、止血功能，可用于经期提前，产后血崩等妇科出血症状。滇桂艾纳香作为广西民间用药已有较长的历史，广西民间用于治疗妇女月经过多，经期延长和产后恶露不绝等病症，使用历史悠久，疗效确切,是一个极具开发利用价值的民间中草药。
目前在市面上流通的以滇桂艾纳香为主药制成的中成药有滇桂艾纳香颗粒(原名“妇血康”颗粒)，收载于《国家中成药标准汇编外科妇科分册》第一册第590页，主要功能为：活血化瘀、止血调经；用于瘀血阻滞所致的月经量多，经期延长。在滇桂艾纳香的研究和开发利用方面，检索到相关的文献如：1、申请号为200910114640.4的中国专利公开了一种滇桂艾纳香水溶性多糖的制备方法，该方法之一包括：提取、膜分离、脱蛋白、除盐、脱色、精制和精制；该方法之二包括：提取、膜分离、脱蛋白、硅胶柱色谱分离、脱色、透析和精制；该发明具有工艺流程简单、节约能耗、产物纯度较高，质量稳定等优点；特别是该发明产品在凝血复钙实验和小白鼠离体子宫实验中具备显著的止血活性作用。2、申请号为201210255364.5的中国专利公开了滇桂艾纳香药材用于治疗妇科疾病的新用途；该发明是由滇桂艾纳香药材原生药粉或滇桂艾纳香药材提取物制成的产品，该产品用于治疗妇科***症；由滇桂艾纳香药材原生药粉或滇桂艾纳香药材提取物加上适当的辅料或辅助性成分可制备成药品、功能食品等；该产品可明显的促进子宫***，对妇科***症具有较好的疗效。3、申请号为201310623562.7的中国专利公开了一种滇桂艾纳香提取物的新用途，通过对中药滇桂艾纳香的深入研究，发现滇桂艾纳香水提物具有促进卵泡成熟、促进***的作用，该发明提取工艺简单、成熟；毒理学实验未发现有毒性反应。
滇桂艾纳香作为壮族民间草药，临床上其治疗妇女产后出血、经期提前、产后血崩、产后浮肿、***症、阴疮等症有独特的疗效。但在现有对滇桂艾纳香的的研究当中，多停留在化学成分及含量的研究，对于滇桂艾纳香的有效部位和活性成分方面的研究较少，且尚未有统一的质量控制标准，药效物质尚未明确，目前国内外仍少见有关滇桂艾纳香具体化学成分在药理活性方面的研究报告。对于药理学方面，现有对妇血康颗粒的临床研究居多，而对滇桂艾纳香、妇血康颗粒的实验研究偏少。由于缺乏药理研究基础，导致滇桂艾纳香虽然有较好的疗效，但可信度不足，难以评价治疗方案的优劣，无法进一步在临床使用上得到推广和利用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种滇桂艾纳香活性提取物的提取方法及其在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种滇桂艾纳香活性提取物的提取方法，包括如下步骤：
（1）取干燥的滇桂艾纳香药材，切碎后以5倍体积的50%-95%乙醇浸泡提取一周，重复2-5次；
（2）合并滤液，在60℃下真空浓缩至相对密度为1.10-1.20的浓缩液，浓缩后的滤液经3倍体积的石油醚萃取3-4次，分离去除石油醚部分；将下层滤液以3倍体积的乙酸乙酯再萃取3-4次，分离去除上层乙酸乙酯部分；下层滤液再以3倍体积的正丁醇在40-90℃下萃取3-4次，合并上层正丁醇滤液，真空浓缩得正丁醇提取部位；
（3）以40-90℃温水溶解正丁醇提取部位，D101大孔树脂拌样上柱，以40-90℃、体积浓度为10%-60%的乙醇为洗脱液进行洗脱，流速速度2BV/h，收集洗脱液，60℃下真空浓缩至无溶剂残留，得到滇桂艾纳香活性提取物。
上述的滇桂艾纳香活性提取物的提取方法，步骤（3）中拌样上柱时，按正丁醇提取部位:D101大孔树脂m/V（g/mL）为1:18的比例拌样上柱。
上述的滇桂艾纳香活性提取物的提取方法提取得到的滇桂艾纳香活性提取物在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种滇桂艾纳香活性提取物的提取方法，采用该方法提取得到的滇桂艾纳香活性提取物具有加速止血的作用，通过药效试验证明，该滇桂艾纳香活性提取物可通过促进平滑肌收缩而促进止血，从而对功能失调性子宫出血（DUB）发挥治疗作用。
本发明提取得到的滇桂艾纳香活性提取物对功能失调性子宫出血具有独特的治疗效果，能用于制备治疗功能失调性子宫出血的药物，具有广阔的应用前景，本发明可为滇桂艾纳香进一步在临床使用上的推广和开发利用提供参考依据。
附图说明
图1为本发明滇桂艾纳香活性提取物提取方法的提取工艺流程图；
图2 为空白组中大鼠离体子宫的收缩曲线图；
图3为正常妊娠组中大鼠离体子宫的收缩曲线图；
图4为DUB模型组中大鼠离体子宫的收缩曲线图；
图5为益母草组中大鼠离体子宫的收缩曲线图；
图6为滇桂艾纳香活性提取物高剂量组对DUB大鼠离体子宫的收缩影响图；
图7为滇桂艾纳香活性提取物低剂量组对DUB大鼠离体子宫的收缩影响图；
图2～图7中的横坐标是时间，秒（s），纵坐标是还厚张力，单位，g。
具体实施方式
实施例1
一种滇桂艾纳香活性提取物的提取方法，包括如下步骤：
（1）取干燥的滇桂艾纳香药材，切碎后以5倍体积的50%乙醇浸泡提取一周，重复5次；
（2）合并滤液，在60℃下真空浓缩至相对密度为1.10-1.20的浓缩液，浓缩后的滤液经3倍体积的石油醚萃取3次，分离去除石油醚部分；将下层滤液以3倍体积的乙酸乙酯再萃取3次，分离去除上层乙酸乙酯部分；下层滤液再以3倍体积的正丁醇在40℃下萃取4次，合并上层正丁醇滤液，真空浓缩得正丁醇提取部位；
（3）以40℃温水溶解正丁醇提取部位，D101大孔树脂拌样上柱，拌样上柱时，按正丁醇提取部位:D101大孔树脂m/V（g/mL）为1:18的比例拌样上柱；以40℃、体积浓度为60%的乙醇为洗脱液进行洗脱，流速速度2BV/h，收集洗脱液，60℃下真空浓缩至无溶剂残留，得到滇桂艾纳香活性提取物。
实施例2
一种滇桂艾纳香活性提取物的提取方法，包括如下步骤：
（1）取干燥的滇桂艾纳香药材，切碎后以5倍体积的95%乙醇浸泡提取一周，重复2次；
（2）合并滤液，在60℃下真空浓缩至相对密度为1.10-1.20的浓缩液，浓缩后的滤液经3倍体积的石油醚萃取4次，分离去除石油醚部分；将下层滤液以3倍体积的乙酸乙酯再萃取4次，分离去除上层乙酸乙酯部分；下层滤液再以3倍体积的正丁醇在90℃下萃取3次，合并上层正丁醇滤液，真空浓缩得正丁醇提取部位；
（3）以90℃温水溶解正丁醇提取部位，D101大孔树脂拌样上柱，拌样上柱时，按正丁醇提取部位:D101大孔树脂m/V（g/mL）为1:18的比例拌样上柱；以90℃、体积浓度为10%的乙醇为洗脱液进行洗脱，流速速度2BV/h，收集洗脱液，60℃下真空浓缩至无溶剂残留，得到滇桂艾纳香活性提取物。
实施例3
一种滇桂艾纳香活性提取物的提取方法，包括如下步骤：
（1）取干燥的滇桂艾纳香药材，切碎后以5倍体积的80%乙醇浸泡提取一周，重复4次；
（2）合并滤液，在60℃下真空浓缩至相对密度为1.10-1.20的浓缩液，浓缩后的滤液经3倍体积的石油醚萃取3次，分离去除石油醚部分；将下层滤液以3倍体积的乙酸乙酯再萃取3次，分离去除上层乙酸乙酯部分；下层滤液再以3倍体积的正丁醇在70℃下萃取3次，合并上层正丁醇滤液，真空浓缩得正丁醇提取部位；
（3）以70℃温水溶解正丁醇提取部位，D101大孔树脂拌样上柱，拌样上柱时，按正丁醇提取部位:D101大孔树脂m/V（g/mL）为1:18的比例拌样上柱；以55℃、体积浓度为50%的乙醇为洗脱液进行洗脱，流速速度2BV/h，收集洗脱液，60℃下真空浓缩至无溶剂残留，得到滇桂艾纳香活性提取物。
实施例4
滇桂艾纳香活性提取物对功能失调性子宫出血大鼠的治疗作用试验
在本部分实验中，采用米非司酮联合米索前列醇建立功能失调性子宫出血（DUB）大鼠模型，重点观察滇桂艾纳香活性提取物部位对DUB大鼠子宫平滑肌收缩效应的影响，同时检测大鼠的子宫出血量及血浆中凝血四项（FIB、APTT、PT、TT）、血清血栓素B2（TXB2）、6-酮-***素F1α（6-keto-PGF1α）的含量，以探究滇桂艾纳香活性提取物对DUB的治疗作用。
1 实验材料
1.1 实验动物
8周龄SD大鼠，雌鼠220-250g，雄鼠220-250g，SPF级，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。
1.2 实验药品
滇桂艾纳香总提取物浸膏，万圣堂药业，批号：170701；
滇桂艾纳香活性提取物，取滇桂艾纳香生药材29400g，按实施例3所述滇桂艾纳香活性提取物的提取方法进行提取分离，得到滇桂艾纳香活性提取物，所得滇桂艾纳香活性提取物中的有机酸含量如表1所示。
Figure 387909DEST_PATH_IMAGE001
益母草颗粒，昆明中药厂有限公司，批号：571138；
米非司酮片，湖北葛店人福药业有限责任公司，批号：170507；
米索前列醇，湖北葛店人福药业有限责任公司，批号：170501。
1.3 实验试剂
氯化钠，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司，批号：2017120171；
无水氯化钙，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司，批号：2017120162；氯化钾，分析纯，天津博迪化工股份有限公司，批号：20171225；碳酸氢钠，分析纯，天津博迪化工股份有限公司，批号：20170325；葡萄糖，分析纯，天津市大茂化学试剂厂，批号：20161011；氯化钠注射液，辰欣药业股份有限公司，批号：1706060726；水合氯醛，Aladdin IndustrialCorporation，批号：B1826028；氢氧化钠，分析纯，成都金山化学试剂有限公司，批号：20171028。
全蛋白提取试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20191106；BCA蛋白浓度测定试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司，批号：14F19B46。纤维蛋白原（FIB）测定试剂盒（冻干型）（凝固法），上海太阳生物技术有限公司，批号：132155；凝血酶原时间（PT）测定试剂盒（冻干型）（凝固法），上海太阳生物技术有限公司，批号：105396；活化部分凝血活酶时间（APTT）测定试剂盒（鞣花酸）（凝固法），上海太阳生物技术有限公司，批号：112216；凝血酶时间（TT）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20190419；Rat 6-keto-PGF1αELISA KIT，上海江莱实业股份有限公司，批号：Apr2019；Rat TXB2 ELISA KIT, 上海江莱实业股份有限公司，批号：Apr2019。
1.4 实验仪器
电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号：BSA224S；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司，型号：HWS-26；数字称，东莞市明衡电子科技有限公司，型号：MH-666；超纯水制造***，成都越纯科技有限公司，型号：CD-UPT-Ⅱ；生物机能实验***，成都泰盟软件有限公司，型号：BL-420F；恒温平滑肌槽，成都泰盟软件有限公司，型号：HW-400E。Infinite® 200 Pro多功能微孔板检测仪，帝肯（上海）贸易有限公司, 型号200PRO。Centrifuge 5430R超低温离心机，德国Eppendorf公司，型号5430R；高压灭菌锅，日本平山制作所株式会社，型号：HVA-110；恒温孵育箱，韶关市科力实验仪器有限公司，型号：PYX-190H-B；电热恒温干燥箱，绍兴市上虞区泸越仪器设备厂，型号：101-1SB。
2 实验方法
2.1 分组、造模及给药
取性成熟未受孕的雌性SD大鼠，与性成熟雄性SD大鼠1:1合笼，于次日早上八点对看到***栓的雌性SD大鼠实行***涂片检查，以发现***及角化上皮细胞为妊娠第1 d，如果未成功受孕，则继续合笼，直至发现***栓。
将成功受孕的雌性大鼠随机分5组，每组8只，分别为正常妊娠组，早孕流产不全致子宫出血模型组（DUB模型组），阳性对照组（益母草颗粒，3.125 g/kg），滇桂艾纳香活性提取物高（0.4 g/kg）、低（0.2 g/kg）剂量组，另取8只未合笼、未受孕性成熟雌性SD大鼠作空白对照组。各动物在造模后第二天按剂量灌胃给予相应药物，空白对照组、正常妊娠组及DUB模型组动物灌胃给予等量纯水，各组动物每天灌胃1次，连续灌胃至妊娠第14天。
除空白对照组和正常妊娠组外，剩余各组实验动物于妊娠第7天上午8: 00灌胃米非司酮（8.3 mg/kg），18: 00灌胃米索前列醇（0.1 mg/kg）引起不完全流产模型，并向大鼠***内放置约60 mg医用棉球一枚，次日起分别于8: 00、18: 00将棉球取出，并置换一新棉球于***内，将取出的棉球置于15 ml离心管中冷藏保存，连续取塞棉球直至妊娠第14天。
2.2 DUB大鼠离体子宫收缩的检测
2.2.1 生理溶液（洛氏液）的制备
离体子宫收缩实验中，为了能较长时间维离体子宫的正常生命活动，选用洛氏液来模拟大鼠体内环境，洛氏液配置如下：取180ml 10%氯化钠溶液、8.4ml 10%氯化钾溶液、20ml 5%碳酸氢钠溶液、9.6ml 5%氯化钙溶液，定容至2000ml，临用前加入2g葡萄糖，混匀待用。
2.2.2 大鼠离体子宫收缩力检测
各组实验动物于末次灌胃给药后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.35 g/kg），暴露腹腔找到子宫，剪取大鼠左侧子宫中段1 cm，将子宫颈端链接至恒温浴槽固定器底端L型弯钩上，卵巢端链接于BL- 420F生物机能实验***分析仪，设置温度为37 ℃，通入空气，控制通气速度为1~2个气泡/ s。调节螺旋母给离体子宫加大约0.5 g的前负荷，等待子宫收缩平稳后，更替洛氏液，软件记录子宫平滑肌8 min的收缩曲线，记录子宫平滑肌最大收缩力及收缩频率。
2.3 DUB大鼠子宫出血量的检测
将收集的各鼠子宫血棉球置于烧杯中，分四次加入NaOH（50 g/L），浸润按压、反复搓揉直至棉球泛白无血色，记录所用NaOH溶液体积。合并4次搓洗棉球所得的浸提液并过滤，分别量取4 mL滤液及大鼠腹主动脉血NaOH溶液（50 g/L），在546 nm波长下测定并记录吸光度（OD）值，计算子宫出血量（mL）。
Figure 123653DEST_PATH_IMAGE002
2.4 DUB大鼠凝血相关因子的检测
2.4.1 DUB大鼠凝血四项的检测
各组实验动物于末次灌胃给药后1 h，腹腔注射10 %水合氯醛麻醉（0.35 g/kg），腹主动脉取血，动脉血注入含3.2 %枸橼酸钠的抗凝管中摇匀，静置后3500 r/min离心10分钟，取上清血浆用于检测凝血四项指标。
（1）纤维蛋白原（Fibrinogen，FIB）的测定
标准曲线制备：将复溶后的定值血浆用凝血分析用稀释液分别以1:5、1:10、1:15、1:20、1:30的比例进行稀释，取不同稀释度定值血浆各200μl，在37℃水浴锅中预热3分钟后，分别加入凝血酶溶液100μl，开始计时，用洁净注射器针头挑动血浆，挑出纤维丝时停止计时，即为凝固时间（s）。
样本检测：待测血浆用凝血分析用稀释液作1: 10稀释，取待测稀释血浆200μl，37℃预热3分钟后，加入凝血酶溶液100μl，混匀，测定血浆凝固时间（s）。
样本FIB含量计算：以不同浓度纤维蛋白原定值血浆含量（mg/dL）为横坐标，以相应的凝固时间（s）为纵坐标，在双对数坐标系上作标准曲线，待测样本FIB含量可从标准曲线上直接读出。
（2）凝血酶时间（Thrombin Time，TT）的检测
取待测血浆样本100μl，37℃下预热3分钟，向待测血浆中加入100μl TT试剂，混匀，测定待测血浆凝固时间。
（3）凝血酶原时间（Prothrombin Time，PT）的检测
取待测血浆样本50μl及PT试剂，37℃下预热3分钟，向待测血浆中加入100μl PT试剂，混匀，测定待测血浆凝固时间。
（4）活化部分凝血酶原时间（Activated Partial Thromboplastin Time，APTT）的检测
取CaCl2试剂37℃下预热5分钟，向50μl待测血浆样本中加入50μl APTT试剂，混匀后30℃预热3分钟，之后加入50μl CaCl2溶液，混匀，测定血浆凝固时间（s）。
2.4.2 DUB大鼠血浆TXB2和6-keto-PGF1α的检测
各组实验动物于末次灌胃给药后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.35 g/kg），腹主动脉取血，并采用EDTA抗凝管抗凝，静置后3500 r/min离心10分钟，取上层血浆根据对应的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒说明书，测定血浆中血清血栓素B2（Thromboxanes B2，TXB2）、6-酮-***素F1α（6-Keto-Prostaglandin-F1α，6-keto-PGF1α）的含量。
2.5 统计方法
运用SPSS 16.0进行数据统计分析，数值采用x±s表示，用t检验对两组数据进行比较，P<0.05认为有显著性差异。
3 实验结果
3.1 滇桂艾纳香活性提取物对DUB大鼠子宫收缩的影响
实验结果如表2、图2-图7所示，图2-图7中的横坐标是时间，秒（s），纵坐标是还厚张力，单位，g。与空白对照组相比，正常妊娠组大鼠子宫最大收缩力极显著降低（P<0.01），收缩频率显著升高（P<0.05），DUB模型组大鼠子宫最大收缩力有所下降，收缩频率有所上升，但均无显著性差异（P>0.05），阳性组大鼠子宫收缩频率显著升高（P<0.05），滇桂艾纳香活性提取物高、低剂量组收缩频率极显著升高（P<0.01）。与正常妊娠组相比， DUB模型组大鼠子宫最大收缩力极显著上升（P<0.01）。与DUB模型组相比，提取物高剂量组大鼠子宫最大收缩力及收缩频率均显著提高（P<0.05），阳性组大鼠子宫最大收缩力及收缩频率较DUB模型组大鼠均有所升高，但无显著性差异（P>0.05）。
Figure 211695DEST_PATH_IMAGE003
3.2 滇桂艾纳香活性提取物对DUB大鼠子宫出血量的影响
实验结果如表3所示。DUB模型组大鼠子宫出血量较空白对照组及正常妊娠组极显著升高（P<0.01），模型复制成功。与DUB模型组大鼠相比，阳性组大鼠子宫出血量极显著降低（P<0.01），滇桂艾纳香活性提取物高、低剂量组大鼠子宫出血量极显著降低（P<0.01）。
Figure 416411DEST_PATH_IMAGE004
3.3 滇桂艾纳香活性提取物对DUB大鼠凝血相关因子的影响
3.3.1 滇桂艾纳香活性提取物对DUB大鼠凝血四项的影响
（1）滇桂艾纳香活性提取物对DUB大鼠纤维蛋白原（FIB）的影响
实验结果如表4所示。与正常妊娠组相比，DUB模型组大鼠纤维蛋白原显著增加（P< 0.05）。
Figure 615311DEST_PATH_IMAGE005
（2）滇桂艾纳香活性提取物对DUB大鼠凝血酶时间（TT）的影响
实验结果如表5所示。各个给药组大鼠凝血酶时间（TT）较DUB模型组均无统计学意义（P>0.05）。
Figure 205561DEST_PATH_IMAGE006
（3）滇桂艾纳香活性提取物对DUB大鼠凝血酶原时间（PT）的影响
实验结果如表6所示。与DUB模型组大鼠相比，滇桂艾纳香活性提取物低剂量组大鼠凝血酶原时间（PT）极显著减少（P<0.01），其余给药组PT均呈现下降趋势。
Figure 464504DEST_PATH_IMAGE007
（4）滇桂艾纳香活性提取物对DUB大鼠活化部分凝血活酶时间（APTT）的影响
实验结果如表7所示。与DUB模型组相比，各给药组大鼠活化部分凝血活酶时间（APTT）均无统计学意义（P>0.05）。
Figure 484413DEST_PATH_IMAGE008
3.3.2 滇桂艾纳香活性提取物对DUB大鼠TXB2和6-keto-PGF1α的影响
实验结果如表8所示。与空白对照组相比，滇桂艾纳香活性提取物低剂量组大鼠血浆中TXB2含量显著升高（P<0.05）。与正常妊娠组大鼠相比，DUB模型组大鼠血浆中的TXB2含量显著降低（P<0.05）。与DUB模型组相比较，滇桂艾纳香提取物低剂量组大鼠血浆中TXB2含量显著升高（P<0.05）。
与空白对照组相比，DUB模型组大鼠血浆中6-keto-PGF1α含量有所下降但无显著性差异（P>0.05）。各个给药组大鼠血浆中6-keto-PGF1α含量较DUB模型组均无显著性差异（P>0.05）。
与空白对照组相比，阳性组大鼠TXB2/ 6-keto-PGF1α比值显著上升（P<0.05），正常妊娠组、滇桂艾纳香提取物低剂量组大鼠TXB2/ 6-keto-PGF1α比值极显著上升（P<0.01）。与正常妊娠组相比，DUB模型组大鼠TXB2/ 6-keto-PGF1α比值显著下降（P<0.05）。与DUB模型组相比较，滇桂艾纳香提取物低剂量组大鼠TXB2/ 6-keto-PGF1α比值极显著上升（P<0.01）。
Figure 221425DEST_PATH_IMAGE009
4 讨论
本部分实验通过建立早孕流产不全至子宫出血模型，给药一周后检测大鼠子宫收缩效应发现，正常妊娠组大鼠子宫呈现高频率、低收缩力的收缩状态，最大收缩力较空白对照组极显著下降（P<0.01），收缩频率显著增加，这可能与子宫维持妊娠稳态环境有关。早孕大鼠灌胃给予米非司酮及米索前列醇后，由于要将胚胎排出体外，子宫收缩力较正常妊娠组极显著升高。对给药组而言，滇桂艾纳香提取物高剂量组大鼠子宫最大收缩力及收缩频率均显著升高（P<0.05），这表明滇桂艾纳香的活性成分可以促进早孕流产不全大鼠子宫收缩效应，从而促使胚胎排出体外并缓解出血情况。提取物对大鼠子宫收缩效应的促进作用并结合DUB大鼠子宫出血量的结果，可认为滇桂艾纳香活性提取物可通过促进平滑肌收缩而促进止血，从而对功血症发挥治疗作用。
滇桂艾纳香活性提取物部位能显著抑制DUB大鼠子宫出血情况，给药过程中，给药组大鼠的出血情况较DUB模型组轻，滇桂艾纳香提取物高、低剂量组大鼠在流产第3天可见出血量减少，棉球浸湿状况减轻且棉球颜色变浅，在流产第5天时几乎不再出血，棉球虽浸湿但多为无色内分泌物。
功血患者会存在凝血和纤溶平衡失调、局部纤溶亢进等情况，现代研究认为，凝血因子（Coagulation Factor, F）共包括12个经典凝血因子，分别为FⅠ~ FXⅢ以及激肽***两个因子，即激肽释放酶原（Kallikrein，PK）和高分子量激肽原（High Molecular WeightKininogen, HMWK）,这些因子分别通过内源性凝血途径、外源性凝血途径及凝血共同途径来发挥止血作用。其中，内源性凝血途径是指从F Ⅻ激活生成F Ⅻα，参与凝血过程的凝血因子全部来自于血液，临床上常以活化部分凝血活酶时间（APTT）来反应内源性凝血途径的状况，可以间接体现凝血因子Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ的活性及含量；外源性凝血途径是指从F Ⅶ被激活到形成F X或Ⅶ- Ca2+- TF复合物从而激活F X的过程，参与凝血过程的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血过程，凝血酶原时间（PT）是指凝血酶原活化为凝血酶最终促进血浆凝固的时间，用来反应外源性凝血途径的状况，可以间接体现凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的活性及含量；凝血共同途径是指从F X被激活至纤维蛋白形成，是内、外源凝血的共同凝血途径，临床上常以凝血酶时间（TT）来反应凝血共同途径的状况。
纤维蛋白原（FIB）又称为凝血因子Ⅰ，是一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，是参与凝血过程、血栓形成过程中的重要物质。在所有凝血因子中，FIB含量最高，FIB能阻塞血管，增加血液黏度，使机体处于高凝状态从而阻止过度出血，同时，FIB还能介导血小板和内皮细胞扩散，毛细管形成、血管生成，加强血管收缩，促进平滑肌的生长，从而促进组织血运重建，发挥促进伤口愈合和组织修复的作用，临床上常以纤维蛋白原（FIB）来反应活化纤维蛋白***的激活情况。凝血四项实验结果显示，滇桂艾纳香提取物对DUB大鼠TT、APTT的测定结果无显著性影响，而滇桂艾纳香提取物能降低DUB大鼠PT测定值，表明滇桂艾纳香提取物可能是通过影响外源性凝血途径发挥止血作用，此外，滇桂艾纳香提取物能增加DUB大鼠的FIB含量，表明滇桂艾纳香还可以通过诱导生成FIB发挥凝血作用。
现代研究发现，***素、血栓素与功血的发病有着关系密切，其作为凝血功能的重要调节因子，可以通过影响子宫血流量、小动脉和肌肉功能、凝血纤溶酶活性及溶酶体功能等对子宫内膜出血症发挥止血作用。血栓素B2（TXB2）是血栓素A2（Thromboxane A2, TXA2）的代谢产物，TXA2有较强的促凝血作用，是花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA）的重要代谢产物，TXA2的产生和分解的平衡对控制血管壁和血小板之间的相互反应和维持循环***的通畅起着非常重要的作用，但其生物半衰期仅为30s左右，随后迅速代谢为TXB2，TXB2较为稳定，不受体外活化影响，因此本实验通过测定TXB2来了解大鼠体内TXA2的生成情况。6-酮***素F1α（6-keto-PGF1α）是由前列环素（PGI2）代谢而来，PGI2是强效血小板聚集抑制剂、扩血管剂，是由血管内皮细胞合成的舒张血管活性物质，可刺激腺苷酸环化酶（AdenylateCyclase，AC），使血小板中的环磷酸腺苷（Cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP）增加从而发挥抑制血小板聚集及血管壁平滑肌收缩作用，但由于PGI2生物半衰期仅为3min左右，随后迅速代谢为无活性的6-keto-PGF1α，因此本实验通过测定6-keto-PGF1α来了解大鼠体内PGI2的生成情况。在正常生理条件下，机体内的TXA2/PGI2维持动态平衡，从而使机体凝血与抗凝***保持稳态。
实验结果显示，正常妊娠大鼠TXB2含量较空白对照组大鼠有所升高，6-keto-PGF1α含量有所下降，但均无显著性差异，DUB模型建立后，模型大鼠TXB2含量较正常妊娠组显著下降（P<0.05），6-keto-PGF1α含量有下降趋势，但两者比例显著低于正常妊娠组大鼠，表明动物在造模之后，机体内的TXA2、PGI2含量失衡，凝血***发生障碍，机体处于低凝状态。与DUB模型组相比，滇桂艾纳香提取物低剂量组大鼠TXB2/6-keto-PGF1α比值较DUB模型组显著提升（P<0.05），表明滇桂艾纳香活性提取物在该剂量下，能调节凝血***障碍，使机体凝血***恢复正常。

Claims (3)

1.一种滇桂艾纳香活性提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取干燥的滇桂艾纳香药材，切碎后以5倍体积的80%乙醇浸泡提取一周，重复2-5次；
（2）合并滤液，在60℃下真空浓缩至相对密度为1.10-1.20的浓缩液，浓缩后的滤液经3倍体积的石油醚萃取3-4次，分离去除石油醚部分；将下层滤液以3倍体积的乙酸乙酯再萃取3-4次，分离去除上层乙酸乙酯部分；下层滤液再以3倍体积的正丁醇在40-90℃下萃取3-4次，合并上层正丁醇滤液，真空浓缩得正丁醇提取部位；
（3）以40-90℃温水溶解正丁醇提取部位，D101大孔树脂拌样上柱，以40-90℃、体积浓度为50%的乙醇为洗脱液进行洗脱，流速速度2BV/h，收集洗脱液，60℃下真空浓缩至无溶剂残留，得到滇桂艾纳香活性提取物。
2.根据权利要求1所述的滇桂艾纳香活性提取物的提取方法，其特征在于，步骤（3）中拌样上柱时，按正丁醇提取部位:D101大孔树脂m/V，g/mL，为1:18的比例拌样上柱。
3.如权利要求1所述的滇桂艾纳香活性提取物的提取方法提取得到的滇桂艾纳香活性提取物在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用。
CN202110522992.4A 2021-05-13 2021-05-13 滇桂艾纳香活性提取物的提取方法及其在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用 Active CN113082068B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110522992.4A CN113082068B (zh) 2021-05-13 2021-05-13 滇桂艾纳香活性提取物的提取方法及其在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110522992.4A CN113082068B (zh) 2021-05-13 2021-05-13 滇桂艾纳香活性提取物的提取方法及其在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113082068A CN113082068A (zh) 2021-07-09
CN113082068B true CN113082068B (zh) 2022-10-21

Family

ID=76665365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110522992.4A Active CN113082068B (zh) 2021-05-13 2021-05-13 滇桂艾纳香活性提取物的提取方法及其在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113082068B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115364081B (zh) * 2021-11-29 2024-02-20 贵州黄果树立爽药业有限公司 2,4-二羟基-6-甲氧基苯乙酮在制备调节凝血功能的药物中的用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102772465A (zh) * 2012-07-23 2012-11-14 广西桂西制药有限公司 滇桂艾纳香药材用于治疗妇科疾病的新用途
CN103565874A (zh) * 2013-11-30 2014-02-12 蒋伟哲 滇桂艾纳香提取物及其用途
CN105998120A (zh) * 2016-04-21 2016-10-12 广西桂西制药有限公司 滇桂艾纳香提取物及用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101181329A (zh) * 2007-11-28 2008-05-21 广西万寿堂药业有限公司 滇桂艾纳香总黄酮提取物及其药物组合物与制备方法
CN101709093B (zh) * 2009-12-17 2012-05-23 广西大学 一种滇桂艾纳香水溶性多糖的制备方法
CN104644711B (zh) * 2014-11-21 2018-05-22 暨南大学 一种艾纳香属植物提取物及其制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102772465A (zh) * 2012-07-23 2012-11-14 广西桂西制药有限公司 滇桂艾纳香药材用于治疗妇科疾病的新用途
CN103565874A (zh) * 2013-11-30 2014-02-12 蒋伟哲 滇桂艾纳香提取物及其用途
CN105998120A (zh) * 2016-04-21 2016-10-12 广西桂西制药有限公司 滇桂艾纳香提取物及用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN113082068A (zh) 2021-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US3862002A (en) Production of physiologically active placental substances
CN113082068B (zh) 滇桂艾纳香活性提取物的提取方法及其在制备治疗功能失调性子宫出血的药物中的应用
CN105168152B (zh) 一种帕瑞昔布钠冻干粉及其制备方法
CN109846896B (zh) 常春藤皂苷在制备抗血管内皮细胞炎性损伤药物中的应用
JP2019509332A (ja) バイカリンマグネシウム化合物、その製造方法及び使用
Markarian et al. Fibrinolytic activity in premature infants: relationship of the enzyme system to the respiratory distress syndrome
CN103372041B (zh) 一种具有抗凝血作用的组分及其制备方法
CN1256940C (zh) 一种中药复方三七滴丸及其制备方法
CN114404374B (zh) 一种***微片及其制备方法和制剂
CN103330721B (zh) 用于治疗女性卵巢早衰的海参花提取物及其制备方法
CN101011534B (zh) 一种治疗溃疡性直肠炎的中药制剂及其制备方法
CN103169739B (zh) 小春花提取物的用途及其制备方法
RU2653468C2 (ru) Фармацевтическая композиция из травы горошка обрубленного, применяемая в качестве эндотелиопротекторного средства
CN110664826A (zh) 一种麦冬皂苷d’制剂及其降血糖药物新用途
CN1414019A (zh) 一种生产高纯度的绝经后尿促性腺素的方法
CN114748490B (zh) 一种用于治疗卵巢早衰的药物组合物、应用及其制备方法
CN113304193B (zh) 一种治疗和或预防***的岩黄连栓及其制备方法
CN111635352B (zh) 一种中药血盆草中的吲哚类生物碱及其提取纯化方法和应用
CN108299348B (zh) 一种牡丹皮炭天然产物在制备抗凝血药物中的用途
Wartenberg et al. Lung tissue concentrations of cefoperazone
CN112294882B (zh) 一种金桔提取物及其制备方法和应用
CN112159439B (zh) 紫杉氰糖苷类化合物及其制备方法和应用
CN114028378B (zh) 迁移型松香烷二萜类化合物在制备肾脏保护方面的药物的用途
Gong et al. Application of Lycium Barbarum Polysaccharide Liposome Nanoparticles to Improve the Slow Healing of Refractory Wounds in Diabetic Foot
Xie et al. Effect of Qingnao tablet on blood viscosity of rat model of blood stasis induced by epinephrine

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant