CN114748490B - 一种用于治疗卵巢早衰的药物组合物、应用及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于治疗卵巢早衰的药物组合物、应用及其制备方法。其中，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物充分利用黄芪作为中草药的补气固表、托毒排脓、敛疮生肌、生津养血、利水消肿等功效，将其中的黄芪总皂苷提取物、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ中的一种或多种组合作为药物组合物的组分，能够有效缓解并治疗卵巢损伤进而引发的卵巢早衰症状，避免了现有治疗方法中所存在的毒副作用和致癌风险、大大降低了治疗成本。

Description

一种用于治疗卵巢早衰的药物组合物、应用及其制备方法
技术领域
本发明属于药物技术领域，尤其涉及一种用于治疗卵巢早衰的药物组合物、应用及其制备方法。
背景技术
卵巢早衰(POF)是指卵巢功能衰竭所导致的女性40岁之前即闭经的现象。其特点是原发或继发闭经伴随血***水平升高和***水平降低，并伴有不同程度的一系列低***症状如：潮热多汗、面部潮红、***低下等。
卵巢早衰是一种有多种病因的综合征，在大部分的病例中病因还不明确。主要分为以下几个方面，包括：遗传因素、免疫因素、手术、化疗、放疗和环境毒素、酶缺陷、心理因素、特发性卵巢早衰等。妇女的平均自然绝经年龄为50～52岁，Coulam等总结1858例妇女的自然闭经情况，小于40岁的POF发生率为1％，小于30岁的POF发生率为1‰。原发闭经中POF占10％～28％，继发闭经中POF占4％～18％。徐苓等发现北京地区妇女POF发生率为1.8％。由此可见，POF在临床上并不少见。
现有的治疗卵巢早衰的临床上的方法中有如下几种方法：1、补充性激素治疗：包括雌、孕激素。但使用该类药物并不能解决生育问题，还可能增加卵巢癌、乳腺癌等激素敏感性肿瘤复发危险；2、使用***释放激素类似物：包括GnRH激动剂或GnRH拮抗剂，系类药物依然不能满足患者的生育需求；3、受精卵和胚胎冻存技术：虽然妊娠率达18％，但不适用于未婚女性，也极有可能耽误治疗时间；4、***冷冻保存技术及卵巢皮质的冻存与移植技术：此手术妊娠率低于3％，技术尚不成熟，费用高昂。
总之，现有的治疗方法并不能从根本上治疗卵巢早衰，急需开辟一条新的途径，并解决患者生育问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种用于治疗卵巢早衰的药物组合物，包括：黄芪总皂苷提取物、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ中的一种或多种组合。
优选地，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物为黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ。
优选地，在所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物中，黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ的质量分数均为1-3；
优选地，黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ的质量分数的比为1：1。
优选地，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物被配置成单位剂量。
优选地，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物被配置成为口服制剂或注射剂。
优选地，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物的给药的应用浓度为10μg/mL-200μg/mL。
优选地，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物的给药的配制应用浓度为10μg/mL。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种如上述所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物在制备治疗化疗药物引起的卵巢损伤的药物的应用。
优选地，所述化疗药物为阿霉素。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种用于治疗卵巢早衰的药物组合物的制备方法，包括：
取中药黄芪，根据天然产物提取方法分别提取出如上述所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物中的黄芪总皂苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ；取其中一种或多种组合即得到所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物；
所述天然产物提取方法为煎煮法、回流提取法、超声提取法、微波提取法、酶提取法、超临界萃取法、闪式提取法、高速逆流色谱法和高效液相色谱法中的一种或多种组合。
本发明提供了一种用于治疗卵巢早衰的药物组合物、应用及其制备方法。其中，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物包括：黄芪总皂苷提取物、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ中的一种或多种组合。本发明所提供的药物组合物，充分利用黄芪作为中草药的补气固表、托毒排脓、敛疮生肌、生津养血、利水消肿等功效，将其中的黄芪总皂苷提取物、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ中的一种或多种组合作为药物组合物的组分，能够有效缓解并治疗卵巢损伤进而引发的卵巢早衰症状，避免了现有治疗方法中所存在的毒副作用和致癌风险、大大降低了治疗成本。
附图说明
图1为本发明实施例黄芪总皂苷提取物的质谱测试图；
图2为本发明实施例黄芪皂苷Ⅰ的质谱测试图；
图3为本发明实施例黄芪皂苷Ⅱ的质谱测试图；
图4为本发明实施例黄芪皂苷Ⅲ的质谱测试图；
图5为本发明实施例黄芪皂苷Ⅳ的质谱测试图；
图6为本发明实施例不同分组在浓度10μg/mL下对体外分离培养的小鼠卵巢颗粒细胞的增殖影响(与正常组比较：*P<0.05mean±S.E.M，n＝6)；
图7为本发明实施例不同比例Ⅲ+Ⅳ在浓度10μg/mL下对体外分离培养的小鼠卵巢颗粒细胞的增殖影响(与正常组比较：*P<0.05mean±S.E.M，n＝6)；
图8为本发明实施例黄芪总皂苷提取物对阿霉素致卵巢损伤后颗粒细胞的影响(与正常组比较：*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001；与阿霉素模型组比较：##P<0.01,###P<0.001mean±S.E.M，n＝6)；
图9为本发明实施例黄芪总皂苷提取物对阿霉素致卵巢损伤后的卵巢大小和卵巢湿重的影响(Ovarian weitht/g；与正常组比较：*P<0.05,mean±S.E.M，n＝6)；
图10为本发明实施例黄芪总皂苷提取物对阿霉素致卵巢损伤后的卵巢大小和卵巢湿重的影响(Ovarian weitht/body weitht％；与正常组比较：*P<0.05,mean±S.E.M，n＝6)；
图11为本发明实施例黄芪总皂苷提取物对阿霉素致卵巢损伤后的卵泡释放的影响1(Number of primordial primary follicles；图10-13中，与正常组比较：*P<0.05,***P<0.01；与阿霉素模型组比较：###P<0.01mean±S.E.M，n＝6)；
图12为本发明实施例黄芪总皂苷提取物对阿霉素致卵巢损伤后的卵泡释放的影响2(Number of secondary follicles；图10-13中，与正常组比较：*P<0.05,***P<0.01；与阿霉素模型组比较：###P<0.01mean±S.E.M，n＝6)；
图13为本发明实施例黄芪总皂苷提取物对阿霉素致卵巢损伤后的卵泡释放的影响3(Number of mature follicles；图10-13中，与正常组比较：*P<0.05,***P<0.01；与阿霉素模型组比较：###P<0.01mean±S.E.M，n＝6)；
图14为本发明实施例黄芪总皂苷提取物对阿霉素致卵巢损伤后的卵泡释放的影响4(Number of total follicles；图10-13中，与正常组比较：*P<0.05,***P<0.01；与阿霉素模型组比较：###P<0.01mean±S.E.M，n＝6)；
图15为本发明实施例黄芪总皂苷提取物降低FSH激素的释放及促进E2激素的合成结果图1(FSH IU/L；与正常组比较：*P<0.05,**P<0.01；与阿霉素模型组比较：#P<0.05mean±S.E.M，n＝6)；
图16为本发明实施例黄芪总皂苷提取物降低FSH激素的释放及促进E2激素的合成结果图2(E2 ng/mL；与正常组比较：*P<0.05,**P<0.01；与阿霉素模型组比较：#P<0.05mean±S.E.M，n＝6)。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合具体实施例的方式对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
本发明要解决的技术问题是避免现有针对卵巢早衰治疗方法中所存在的毒副作用和致癌风险、降低治疗成本，进而提供一种用于治疗卵巢早衰的药物组合物，包括：黄芪总皂苷提取物、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ中的一种或多种组合。
上述，黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ四种化合物均具有如下母核结构式：
其中，黄芪皂苷Ⅰ中R1＝Glc、R2＝H、R3＝Ac、R4＝H和R5＝Ac；
黄芪皂苷Ⅱ中R1＝Glc、R2＝H、R3＝H、R4＝H和R5＝Ac；
黄芪皂苷Ⅲ中R1＝H、R2＝H、R3＝H、R4＝H和R5＝Glc；
黄芪皂苷Ⅳ中R1＝Glc、R2＝H、R3＝H、R4＝H和R5＝Glc；
其中，Xyl为木糖，Glc为葡萄糖基。
上述，黄芪总皂苷提取物，即黄芪总皂苷，也为黄芪总苷，为豆科植物蒙古黄芪的根提取而得，是黄其中多种皂苷类化合物及其他类化合物的混合物。黄芪总皂苷为多组分具有皂苷成分的混合物，其成分可以包括：含黄酮类成分毛蕊异黄酮(calycosin)、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷，还含黄芪皂甙Ⅰ、Ⅴ、Ⅲ(astragalosideⅠ、Ⅴ、Ⅲ)，一般通过高分辨质谱可检测到的有效成分主要包括黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ。目前，已有的报道主要针对于黄芪总皂苷用于调节体内血糖，增强肌体免疫力，促进生长，提高机体抗氧化能力，此外还有利水消肿，托疮生肌，用于慢性肾炎蛋白尿，糖尿病等。
上述，黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ均为皂苷类化合物。
上述，用于治疗卵巢早衰的药物组合物，可以为其中一个单体化合物、一个，或者黄芪总皂苷提取物，或者多个单体化合物的组合，甚至于黄芪总皂苷与一个或多个单体化合物之间的组合。
需要说明的是，黄芪，中药材名。本品为豆科植物蒙古黄芪的根。春、秋季采挖，除去泥土、须根及根头，晒至六七成干，理直扎捆后晒干。功能主治为：补气固表，托毒排脓，利尿，生肌。用于气虚乏力、久泻脱肛、自汗、水肿、子宫脱垂、慢性肾炎蛋白尿、糖尿病、疮口久不愈合。其主要活性成分为黄芪皂苷类化合物。
目前含黄芪的产品大多为传统中药复方，虽然临床证实有一定治疗效果，但因组分较复杂，有效治疗成分尚不清楚。因此有必要对黄芪进行深入研究，以开发出有效成分明确，作用机理清晰，质量易于控制的现代中药制剂。近年来，黄芪皂苷类成分因其良好的天然生物活性引起了人们的广泛关注。黄芪总皂苷具有较高的抗氧化剂潜力，如提取物减少活性氧释放减少游离脂肪酸损伤。虽然文献报道其具有多方面的药理活性，然而，黄芪总皂苷对卵巢早衰的防治效果如何，国内尚无报道。
目前已知的黄芪的药理活性主要包括对肾功能的影响，主要在于三个方面：第一方面为改善肾功能，使血肌酐下降的影响较单用一种药物作用明显(P＜0.01)，对肾实质细胞代谢有明显改善作用。第二方面为对机体免疫功能的调节，现有的文献报道证明黄芪可以调节血浆环核苷酸含量，纠正环核苷酸***的失衡，提示黄芪有抗衰老作用。黄芪中硒的含量较高，可以参与多种酶的合成和活化，保护细胞免受生物氧化过程中的损害。第三方面为对造血***的影响，主要为黄芪有促进骨髓造血机能，使骨髓生长旺盛的作用，此外还有强心降压、降血糖、利尿、抗衰老、抗疲劳等作用。但是目前，黄芪及其主要成分针对于卵巢早衰的治疗或预防的药理活性并无相关报道。
本实施例中提供的一种用于治疗卵巢早衰的药物组合物，充分利用黄芪作为中草药的补气固表、托毒排脓、敛疮生肌、生津养血、利水消肿等功效，将黄芪中最主要的活性成分：黄芪总皂苷提取物、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ中的一种或多种组合作为药物组合物的组分，能够有效缓解并治疗卵巢损伤进而引发的卵巢早衰症状，避免了现有治疗方法中所存在的毒副作用和致癌风险、大大降低了治疗成本。
进一步的，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物为黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ。
上述，用于治疗卵巢早衰的药物组合物为单体黄芪皂苷Ⅲ和单体黄芪皂苷Ⅳ的混合物。
上述，黄芪皂苷Ⅲ即为组合物中的黄芪皂苷Ⅲ，其分子式为C41H68O14，分子量为784.97，其纯品为无色针状结晶。
上述，黄芪皂苷Ⅳ即为组合物中的黄芪皂苷Ⅳ，又名黄芪甲苷，是一种羊毛酯醇形的四环三萜皂苷，其分子式为C41H68O14，分子量为784.97。
上述，黄芪皂苷Ⅳ，已经报道的药理作用主要包括如下：
1、增强机体免疫力和提高机体抗病能力；2、抗病毒活性；3、抗应激功效；4、促生长剂；5、改善心肺功能，加强心脏收缩力，保护心肌，抗心力衰竭。但是目前黄芪甲苷在针对于卵巢早衰的治疗或预防的药理活性并无相关报道。
进一步的，在所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物中，黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ的质量分数均为1-3。
上述，在用于治疗卵巢早衰的药物组合物中，其中两个组分黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ的质量比可以为不同组合，例如两个化合物在质量分数均为1-3的前提下，可以分别任意以如下质量分数进行组合，构成5种不同比例的药物组合物：
表1、黄芪皂苷Ⅲ和Ⅳ在组合物中不同比例的举例
上述质量比，针对的是两种单体化合物之间的纯品之比，并不包括辅料和添加剂。
进一步的，黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ的质量分数的比为1：1。通过多组不同质量分数黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ组成的用于治疗卵巢早衰的药物组合物进行实验，两组分1：1在体外实验中相对于表1中其他比例能够得出更好的针对于卵巢早衰的治疗作用。
进一步的，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物被配置成单位剂量。
进一步的，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物被配置成为口服制剂或注射剂。
上述，本申请中所提到的组合物所配置的注射剂包括但不限于液体注射剂和粉针剂。
上述，口服制剂包括但不限于固体制剂、液体制剂。
上述，用于治疗卵巢早衰的药物组合物还可以配置为其他能够起到治疗卵巢早衰作用和目的的剂型，例如可以包括但不限于：吸入气雾剂、皮肤给药型外用制剂、粘膜给药型制剂等等，在此不作限定。
进一步的，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物的给药的应用浓度为10μg/mL-200μg/mL。
进一步的，所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物的给药的配制应用浓度为10μg/mL。
此外，本申请还提供一种如上述所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物在制备治疗化疗药物引起的卵巢损伤的药物的应用。
进一步的，所述化疗药物为阿霉素。
随着肿瘤患者的年轻化以及术后生存率的提高，化疗药物所致医源性损害逐渐得到重视，尤其是乳腺癌、淋巴癌的年轻患者不再把生存当作肿瘤治疗的唯一指标。术后患者的生活质量及生育要求也成为他们需求的关注，化疗后患者卵巢功能的状况成为评价年轻女性肿瘤患者生存质量的关键指标。目前，根据文献报道可知，化疗药物是引起卵巢早衰的原因之一。
目前，通过临床治疗病例统计及文献报道可得知，常规的卵巢早衰(例如由于遗传因素、烟草等环境毒素、酶缺陷等长期问题引起的卵巢早衰症状)引起的功能出现了损坏，一般情况下是不可逆的，并且伴随其他症状，这是由于长期性的生活行为和遗传导致的针对于卵巢处于低水平激素环境下所引起的卵巢损伤，例如***长期处于很低的状态，导致子宫萎缩。而化疗药物引起的卵巢早衰与其他类型的卵巢早衰相比，区别点在于，短期化疗药物给药，造成急性***减少，造成卵巢损伤，以至于卵巢早衰甚至发展成为卵巢癌，这种原因引起的卵巢早衰症状轻，治疗及时情况下能够及时减轻患者症状，治愈概率高，甚至可以保留、解决患者生育问题，因此化疗药物引起的卵巢早衰是目前卵巢早衰治疗的重要课题。
为预防或减轻化疗所致卵巢损伤，临床上主要有几种方法：1、补充性激素治疗：包括雌、孕激素。但使用该类药物并不能解决生育问题，还可能增加卵巢癌、乳腺癌等激素敏感性肿瘤复发危险。2、使用***释放激素类似物：包括GnRH激动剂，GnRH拮抗剂。系类药物依然不能满足患者的生育需求。3、受精卵和胚胎冻存技术：虽然妊娠率达18％，但不适用于未婚女性，也极有可能耽误治疗时间。4、***冷冻保存技术及卵巢皮质的冻存与移植技术：此手术妊娠率低于3％，技术尚不成熟。因此，现有的治疗方法并不能从根本上减轻化疗药物所致卵巢损伤，急需开辟一条新的途径，并解决患者生育问题。
而针对于黄芪，其中黄芪总皂苷及相关皂苷类化合物对化疗药物所致卵巢损伤的防治效果如何，国内尚无报道。
通过实验能够证明，黄芪总皂苷及相关皂苷类化合物能够降低FSH激素的释放及促进E2激素的合成，且可以保护阿霉素(DOXO)诱导的卵巢早衰小鼠模型的各级卵泡的释放及颗粒细胞。
此外，本申请还提供一种用于治疗卵巢早衰的药物组合物的制备方法，包括：
取中药黄芪，根据天然产物提取方法分别提取出如前述任一项所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物中的黄芪总皂苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ；取其中一种或多种组合即得到所述用于治疗卵巢早衰的药物组合物；
其中，天然产物提取方法可以为煎煮法、回流提取法、超声提取法、微波提取法、酶提取法、超临界萃取法、闪式提取法、高速逆流色谱法和高效液相色谱法中的一种或多种组合。
上述，中药黄芪可以为豆科植物蒙古黄芪的根。
上述，天然产物提取方法包括多种，其中包括但不限于采用煎煮法、回流提取法、超声提取法、微波提取法、酶提取法、超临界萃取法、闪式提取法、高速逆流色谱法和高效液相色谱法中的一种或多种组合。
上述，煎煮法可以为，取用16倍水，对黄芪进行4次时长60min的煎煮，可以获得含量为16.88mg/g的浸膏。其中，浸膏即为黄芪总皂苷浸膏。
上述，回流提取法，是指用乙醇、水、或其混合溶剂等能挥发的溶剂提取原料成分，将浸出液加热蒸馏，其中溶剂馏出后又被冷却，重复流回浸出容器中浸提原料，这样周而复始，直至有效成分回流提取完全的方法。本申请中，可以采用常压下针对于黄芪总皂苷的水作为溶剂的回流提取，因为黄芪总皂苷的水溶性要高于乙醇溶性。
上述，超声提取法，即超声波提取法，是采用超声波辅助溶剂进行提取，声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏植物药材的细胞，使溶剂渗透到药材细胞中，缩短提取时间，提高提取率。本申请中，可以通过15倍70％乙醇作为溶剂进行超声提取40分钟，可以获得黄芪总皂苷的提取物浸膏。
上述，微波提取法，即为微波辅助提取法，是利用微波能进行物质萃取的一种新发展起来的技术，是使用适合的溶剂在微波反应器中从天然植物、矿物或动物组织中提取各种化学成分的技术和方法。可对于黄芪利用微波辅助提取方法进行针对于黄芪总皂苷的提取。
上述，酶提取法，纤维素酶对于提高黄芪总皂苷提取率具有一定的催化作用，其提取的催化条件可以为pH＝4.38，酶解时长为132分钟，温度在51℃，使用纤维素酶的量为8.8mg，在此条件下对黄芩进行提取。
上述，超临界萃取法，可以使用超临界CO2萃取黄芪总皂苷的方法进行实验。针对于粒度为60目的中药黄芪粉碎粗颗粒，温度在45℃时，压力在35MPa，以含量为95％的乙醇溶液作为夹带剂，提取时长控制在2.5小时，CO2流量为3.7L/h。
上述，闪式提取法，也成为组织破碎提取法，依靠高速机械剪切力，可使物料在几秒内破碎至微小颗粒，同时通过高速搅拌和振动，使植物组织内化学成分迅速达到内外平衡，从而提高有效成分的提取效率。
上述，高速逆流色谱法，简称HSCCC，是一种液-液色谱分离技术，它的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点。可采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:10:2:10),乙酸乙酯-乙醇-正丁醇-水(30:10:6:50)两相溶剂***进行HSCCC分离纯化,下相为流动相,流速分别为2.5m L/min,2.0mL/min,转速900r/min,检测波长254nm。
上述，高效液相色谱法，简称HPLC，是以液体为流动相，采用高压输液***，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。在针对于黄芪总皂苷、黄芪皂苷类化合物的分离中，主要采用制备型高效液相和分析性高效液相相结合的方式进行分离纯化，例如可以使用正向柱进行粗分，再进一步利用反向柱进行细分。
例如，黄芪中主要活性成分的提取方法可以为如下方法：
步骤1、将蒙古黄芪利用粉碎机粉碎后，溶解于5-15倍的乙醇水溶液中，乙醇水溶液可以为50％-100％(纯乙醇)的溶液，进行加热回流提取，并进行减压干燥浓缩，得到粗提物浸膏；
步骤2、将粗提物浸膏溶解在10倍水中，得到水溶粗提物；
步骤3、将水溶粗提物依次于石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分别进行萃取，得到水层、石油醚层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层和正丁醇层；
步骤4、取正丁醇层，利用大孔吸附树脂(可以为D101)，然后用二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱(梯度洗脱溶液可以为乙醇水溶液，例如可以为由50％乙醇洗脱至100％乙醇)，得其中50％以上段，通过TLC跟踪可得到目标混合物，目标混合物再经过葡聚糖凝胶LH-20分离进一步纯化；并可利用正相硅胶进行分离纯化，并通过TLC跟踪，可得到黄芪总皂苷提取物；
步骤5、通过制备液相(反向硅胶柱)进行分离纯化，并通过TLC跟踪，可分别得到黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1：单体及提取物的成分确认
黄芪总皂苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ在分离纯化后，对上述成分进行确认。
具体方法及结果：
本实施例中，通过高分辨液质联用仪对黄芪总皂苷提取物，以及黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ进行分别测试，以便于确认其成分。
测试条件：
黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黄芪总皂苷分别溶于50％乙腈，终浓度为5ppm。采用UPLCBEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，以0.1％甲酸水溶液和乙腈分别作为流动相A和流动相B，梯度洗脱(0-2.5min，95％A→70％A；2.5-4.5min，70％A→65％A；4.5-6min，65％A；6-7min，65％A→60％A；7-9min，60％A→40％A；9-14min，40％A→3％A；14-15min，3％A→95％A)，流速350μL/min，柱温35℃，进样量5μL。质谱检测采用ESI源，选用正离子模式进行选择反应监测扫描(SRM)。喷雾电压(Spray Voltage)3600V，鞘气流速(Sheath Gas)40arb，辅气流速(Aux gas)10arb，喷雾器温度(Vaporizer Temp)325℃，离子传输管温度(iontransfer tube temp)350℃。
测试结果：
1、黄芪总皂苷：参见图1，其中可见已检测出组分中包含有的主要成分黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ的分子量，确认该混合物为黄芪总皂苷提取物；
2、(1)黄芪皂苷Ⅰ参见图2，检测结果见下表；
(2)黄芪皂苷Ⅱ参见图3，检测结果见下表；
(3)黄芪皂苷Ⅲ参见图4，检测结果见下表；
(4)黄芪皂苷Ⅳ参见图5，检测结果见下表。
总结：
经过高分辨液质联用仪的测试，确认黄芪总皂苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ成分。
表2黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的质谱参数
名称 相对分子质量 离子化方式 母离子m/z 子离子m/z 碰撞能量eV
黄芪皂苷Ⅰ 869.04 ESI+ 869.76 437.32 18
黄芪皂苷Ⅱ 827.01 ESI+ 827.72 437.37 18
黄芪皂苷Ⅲ 784.97 ESI+ 785.56 437.32 20
黄芪皂苷Ⅳ 784.97 ESI+ 785.56 143.15 20
体内及体外的药理活性试验(实施例2-4)
实验材料：
1、待测样品：黄芪总皂苷，黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ。
2、试剂和试样：孕马血清***PMSG，prospec hot-272；DMEM-F12无酚红培养基，Thermo；胎牛血清，Gibco；AccumaxTMsolution，Sigma；Hanks缓冲液，Thermo；CellTiter-Glo发光细胞活力分析，Promega；阿霉素，Sigma；小鼠促卵泡激素(FSH)ELISA试剂盒，bio-swamp；小鼠***(E2)ELISA试剂盒，bio-swamp；4％多聚甲醛组织固定液，bio-swamp；苏木素-伊红染液，Baso；1％盐酸酒精，Baso。
3、仪器设备：细胞培养箱，Thermo；倒置显微镜，ZEISS；倒置解剖显微镜，ZEISS；小型低温离心机，Eppendorf；细胞计数仪，Countess II；多功能微孔板检测仪，BioTek。
实施例2：待测样品对体外分离培养的小鼠卵巢颗粒细胞的增殖影响
1、实验方法：
(1)取5-6周龄SPF雌性小鼠，腹腔注射孕马血清***PMSG(8-10U)和人绒毛膜***(HCG)；48小时后，颈椎脱臼法处死小鼠，分离小鼠卵巢，PBS清洗，体视显微镜下去除其周围脂肪和被膜；
(2)在混合基础培养基中用25号针头刺破卵泡使颗粒细胞和***释放出来，加入酶消化，消化后40目筛网过滤，滤液离心弃上清；混合完全培养基重悬细胞沉淀接种于培养皿内，CO2培养箱培养48小时候换液，待5-7天后颗粒细胞贴壁生长，更换培养基，同步24小时后加药处理。
实验分组：
待测样品不同浓度组：黄芪总皂苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ(10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)；
第一步实验中的组合物组：浓度：10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL；固定比例：1：1；化合物组合：Ⅰ+Ⅱ、Ⅰ+Ⅲ、Ⅰ+Ⅳ、Ⅱ+Ⅲ、Ⅱ+Ⅳ、Ⅲ+Ⅳ；
第二步实验中的组合物组：固定浓度：10μg/mL；组分为Ⅲ+Ⅳ，其中Ⅲ：Ⅳ的比例为：1:1、1:2、1:3、2:1、2:3、3:1和3:2；
在分离的颗粒细胞5-7天后颗粒细胞贴壁生长，更换培养基，同步加药物处理后24小时更换新培养基；
(3)使用CellTiter-Glo发光细胞活力分析***(Promega)测量细胞活力。
具体的，分成两步实验：
(1)首先进行针对于待测样品不同浓度组、第一步实验中组合物组进行实验，分别得出结果。
(2)进一步根据实验结果筛选出优选的浓度，以及优选的待测样品组成组合再进行实验，找出在特定浓度下的特定比例的特定化合物或提取物的组合。
结果如下。
2、实验结果：
表3、不同分组在浓度10-200μg/mL下对体外分离培养的小鼠卵巢颗粒细胞的增殖影响
表4、不同比例Ⅲ+Ⅳ在浓度10μg/mL下对体外分离培养的小鼠卵巢颗粒细胞的增殖影响
由表3的结果可见，在第一步实验中，通过设置4个浓度给药剂量(10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)，作用24小时后的卵巢颗粒细胞活性，与对照组比较，低浓度给药组(10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)的黄芪总皂苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ均有不同程度的促进颗粒细胞的增殖的效果；并且，其中在10μg/mL浓度下，黄芪总皂苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ均能够显著促进颗粒细胞的增殖，有显著性差异，均有统计学意义(P<0.05)，这一点参考附图6中可以直观得出上述结论，在附图中作为对比的同时测试的黄芪总皂苷在μg/mL浓度下与空白组相比同样具有显著性差异，即具有能够显著促进颗粒细胞的增殖的效果。
此外，在第一步实验中的组合物组中，在1：1的比例下，Ⅰ+Ⅱ、Ⅰ+Ⅲ、Ⅰ+Ⅳ和Ⅲ+Ⅳ在10μg/mL浓度下，均能够促进颗粒细胞的增殖的效果，其中Ⅲ+Ⅳ的组合效果显著。
在第二步实验中，针对于Ⅲ+Ⅳ的药物组合进行了进一步实验。具体的，在第一步实验中筛选出的浓度10μg/mL下，针对于Ⅲ+Ⅳ组合，进行组分不同比例的检测，分别为：1:1、1:2、1:3、2:1、2:3、3:1和3:2，通过实验结果可见，1:1和1:2两组比例下，Ⅲ+Ⅳ的药物组合能够明显促进颗粒细胞的增殖，并且其中1：1促进颗粒细胞的效果最为明显，与空白组相比具有显著性差异。
通过本实施例中的第一步和第二步实验能够证明Ⅲ+Ⅳ的组合具有较好的对体外分离培养的小鼠卵巢颗粒细胞的增殖效果，而黄芪总皂苷提取物通过液质联用仪能够检出主要成分为Ⅲ+Ⅳ，因此进一步的可以认定黄芪总皂苷基于其主要皂苷成分同样具有一定的对体外分离培养的小鼠卵巢颗粒细胞的增殖效果。综上，根据上述实验结果进一步进行以下针对于黄芪总皂苷的实验。
实施例3：黄芪总皂苷对阿霉素致卵巢损伤后颗粒细胞的影响
1、实验方法：
(1)在分离的颗粒细胞5-7天后颗粒细胞贴壁生长，更换培养基，同步加黄芪总皂苷提取物，处理后24小时更换新培养基，并加入1μMol阿霉素溶液孵育12小时。
(2)使用CellTiter-Glo发光细胞活力分析***(Promega)测量细胞活力。
2、实验结果：
由图8可见，使用上述有效给药浓度(50μg/mL和100μg/mL)的黄芪总皂苷在阿霉素作用下的卵巢颗粒细胞中，细胞活力明显高于同组空白对照，其中AST-100最为显著且相对稳定，证明黄芪总皂苷提取物对阿霉素致卵巢损伤后颗粒细胞具有保护作用。
实施例4：黄芪总皂苷在阿霉素诱导的卵巢早衰小鼠模型上的应用
1、实验方法：
(1)取5-6周龄SPF雌性小鼠，随机分配4组，每组6只，其中：
对照组小鼠(n＝6)每天生理盐水(20ml/Kg)灌胃，持续4周。
阿霉素模型组(n＝6)每天生理盐水(20ml/Kg)灌胃，持续4周，第五周接受一次腹膜内注射阿霉素(8mg/kg)。
黄芪总皂苷组(n＝6)的小鼠每天黄芪总皂苷提取物(10mg/kg)灌胃，持续4周。
黄芪总皂苷+阿霉素组(n＝6)的小鼠每天黄芪总皂苷提取物(10mg/kg)灌胃，四周后，接受一次腹膜内注射阿霉素(8mg/kg)。
(2)实验期间持续记录各组小鼠体重、毛发、行为学等变化。在接受阿霉素注射7天后，处死小鼠，收集血清，测定血清激素FSH、E2水平；收获小鼠卵巢，称湿重，制备石蜡切片作常规H&E染色，观察卵巢组织形态观察及卵泡计数。
2、实验结果：
结果见表5及图9和图10。在阿霉素造模模型小鼠中，卵巢大小，卵巢湿重均明显减少；使用本发明的黄芪总皂苷提取物可明显对抗模型鼠的上述病理变化。
由图11-14的结果显示，模型小鼠中，原始卵泡，初级卵泡及成熟卵泡的数量相对于空白对照组来说显著性减少，黄芪总皂苷组小鼠各级卵泡数明显增加，其中原始卵泡数量最为突出。使用黄芪总皂苷可明显恢复模型组的原始卵泡及成熟卵泡数量减少的病理变化。
用FSH和E2的ELISA试剂盒检测各组小鼠血清，结果如图15-16所示，阿霉素处理的模型组小鼠血清的FSH显著上升，E2显著降低，符合卵巢早衰小鼠模型生化指标。使用黄芪总皂苷能够降低FSH激素的释放及促进E2激素的合成。
表5、待测样品对阿霉素致卵巢损伤后的卵巢大小和卵巢湿重的影响
上表中，AST为黄芪总皂苷提取物；DOXO为阿霉素。
以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量的调整，这些都属于本发明的保护范围之内。以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量的调整，这些都属于本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.药物组合物在制备治疗阿霉素引起的卵巢损伤的药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物为质量比为1:1的黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ；所述药物组合物的给药的应用浓度为10μg/mL。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物被配置成单位剂量。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物被配置成为口服制剂或注射剂。
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