CN113080961B - 一种无内毒素的水蛭素抗凝血真空采血管及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗器械技术领域,具体涉及一种无内毒素水蛭素抗凝真空采血管及其制备方法,在真空采血管的内壁上涂有重组水蛭素,每100μg重组水蛭素中内毒素含量<0.25EU/ml,其中,重组水蛭素为采用阴离子交换色谱法对重组水蛭素蛋白液进行分离得到,包括如下步骤:进样:取重组水蛭素蛋白溶液进样,进样量为色谱柱最大载样量的25~40%,用平衡液冲洗进行柱平衡;洗脱:用洗脱液进行等度洗脱,并收集流出部分,得到重组水蛭素洗脱液;柱再生:用再生液进行等度洗脱,并收集流出部分,得到内毒素洗脱液。本发明真空采血管内壁喷涂去除内毒素的水蛭素,可提高血液检测的准确性,特别适用于血液样品中含致热源的特殊项目检测要求,安全可靠。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域,具体涉及一种无内毒素水蛭素抗凝真空采血管及其制备方法。
背景技术
真空采血管是临床上普遍使用的用于血液检测采集的医疗器械产品,利用复压自动定量采集静脉血样,根据检测目的不同可分为普通采血管、含促凝剂采血管、含抗凝剂采血管等。其中,用于快速血浆生化血流变试验的采血管内通常添加有肝素、枸橼酸钠、EDTA等抗凝剂,然而传统的抗凝采血管的抗凝血时间有限,对血液有较大干扰,容易引起溶血反应,且化学抗凝剂含较多杂质、重金属。水蛭素也是常见的抗凝剂,如公开号为CN101779959A的中国专利就提供了一种水蛭素真空采血管,可适合多项检查使用。
自然界中,天然水蛭素在水蛭中的含量有限,从水蛭中难以提取大量水蛭素,不能满足临床的使用要求,因而通过基因工程重组水蛭素成为国内外医药界的研究重点。重组水蛭素在第63位氨基酸Tyr残基上脱SO3-,其余结构与性质跟天然水蛭素基本相同。最早的重组水蛭素cDNA已于20世纪80年被成功克隆出来,至今重组水蛭素已在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌及真核细胞等成功表达。
然而,目前的研究重点主要在重组水蛭素的制备和表达方面,而对进一步的分离和纯化研究则相对较少。借助于细菌或真菌等微生物表达发酵制得的重组水蛭素中,不仅存在宿主蛋白、色素、培养基等杂质组分,还有菌体裂解产生的内毒素,这类物质积累作用于人体会产生一系列毒性反应,如发热、炎症甚至休克等问题,而用于制备抗凝真空采血管还会污染血液样品,影响检测结果和效率,尤其是当血液中含有致热源时,无法满足检测准确性要求。因此,通过发酵培养制备的重组水蛭素必须通过合理的纯化工艺去除蛋白溶液的内毒素,才可用于抗凝血真空采血管的制备,而目前针对去除重组水蛭素中内毒素的研究仍然较少。
发明内容
针对上述技术问题,本发明提供一种制备方法简单、适用于大规模工业化生产的无内毒素水蛭素抗凝真空采血管。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实施:
一种无内毒素的水蛭素抗凝血真空采血管,在真空采血管的内壁上涂有重组水蛭素,100μg重组水蛭素中内毒素含量<0.25EU/ml。
重组水蛭素可与血液中凝血酶专一、特异性结合,具有显著的抗凝血作用,作为采血管内壁抗凝剂涂层对检测结果干扰极小。并且,本发明的真空采血管所用的水蛭素抗凝剂中几乎不含内毒素,纯度较高,抗凝血成分单一,无菌、无毒,安全性好,适用于血液中致热源等特殊项目的检测,提高血液检测的准确性。
作为优选,本发明的重组水蛭素为采用高效液相阴离子交换色谱法对重组水蛭素蛋白液进行分离得到。
阴离子交换色谱以离子交换剂作为分离固定相,同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合,如蛋白质之间或蛋白质与其他分子之间,带相同电荷类型的离子会竞争性地结合与其电荷相反的固定相介质。本发明中,重组水蛭素与离子交换剂表面的吸附作用力较弱,洗脱时优先流出色谱柱,而与固定相吸附作用力强的内毒素成分需通过洗脱能力更强的再生液冲洗下来,该方法简单快捷,可有效除去重组水蛭素蛋白溶液中的内毒素杂质。
本发明的另一目的在于提供一种无内毒素水蛭素抗凝真空采血管的制备方法,包括如下步骤:
S1、用超声波对采血管进行清洗、干燥;
S2、在采血管内壁表面涂覆硅化剂,高温固化硅化剂;
S3、用环氧乙烷对采血管进行灭菌,并去除残留环氧乙烷;
S4、采用高效液相阴离子交换色谱法去除重组水蛭素中的内毒素,并用无热源的注射用水稀释后除菌过滤,得到无菌、无内毒素的水蛭素抗凝剂;
S5、在无菌环境下,在采血管内壁自上而下2cm处喷雾涂水蛭素抗凝剂,干燥后,对采血管抽真空并密封。
作为优选,步骤S2中的硅化剂为二甲基二氯硅烷或二甲基二硅胺。
作为优选,步骤S2中固化硅化剂的温度为130~180℃。
作为优选,步骤S4中高效液相阴离子交换色谱法具体包括如下步骤:
进样:取重组水蛭素蛋白溶液进样,进样量为色谱柱最大载样量的25~40%,用平衡液冲洗进行柱平衡;
洗脱:用洗脱液进行等度洗脱,并收集流出部分,得到重组水蛭素洗脱液;
柱再生:用再生液进行等度洗脱内毒素,弃去流出部分。
阴离子交换色谱分离时的进样量对分离效果也有显著影响。由于色谱柱的最大载样量受到填料颗粒大小、填料表面键合密度、色谱柱尺寸等因素影响,进样量往往需要根据不同色谱柱的饱和吸附量来确定。但发明人在实践中发现,即使按照最大载样量进样,重组水蛭素蛋白的纯化回收和除杂的总效率并不高。而本发明的进样量远远小于色谱柱的最大载样量,这是由于进样量继续增大,虽然不会引起重组水蛭素蛋白回收率的下降,但内毒素的去除效果下降的非常大。而若进样量小于最大载样量的25%,则重组水蛭素蛋白的回收率会明显降低,但内毒素的去除效果却明显提升。因此本发明通过进样量的合理调控来实现重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的去除效果和最佳的水蛭素回收率。
进一步优选,本发明中阴离子交换色谱的进样量为色谱柱最大载样量的 30%。
作为优选,本发明的平衡液为浓度为8~20mmol/L、pH值为6.5~7.5的 Tris-HCl缓冲液。
作为优选,本发明中洗脱液和再生液均为pH值为6.5~7.5的缓冲液。
作为优选,本发明的洗脱液和再生液均为含NaCl的Tris-HCl缓冲液,且洗脱液中氯离子浓度小于再生液中氯离子浓度。
内毒素是带负电荷的脂多糖类物质,在pH>2时与阴离子交换剂有较强的结合力。在本发明接近中性的分离条件下,内毒素在离子交换色谱填料上的吸附强度远大于重组水蛭素。所以,重组水蛭素在盐浓度较低的洗脱液作用下优先流出色谱柱,而后再用高盐浓度的再生液洗脱进行解吸附,使色谱柱中残留的内毒素组分随再生液流出,实现重组水蛭素与内毒素杂质的有效分离。
进一步优选,本发明的洗脱液中,NaCl的浓度为100~150mmol/L,Tris-HCl 的浓度为8~20mmol/L。
进一步优选,本发明的再生液中,NaCl的浓度为1.0~2.0mol/L,Tris-HCl 的浓度为8~20mmol/L。
作为优选,本发明所用的重组水蛭素蛋白溶液为对重组水蛭素发酵液进行纯化制得,纯度≥95%。
作为优选,本发明的进样流速为70~100ml/min。
作为优选,本发明用再生液洗脱后,还需用平衡液清洗,即可再次上样分离。
本发明以二乙基氨基乙基(DEAE)键合硅胶作为阴离子交换色谱填料进行分离,分步增加流动相的盐浓度进行等度洗脱,结合力弱的重组水蛭素优先流出,再以高盐浓度解离内毒素,实现有效分离的同时完成了色谱柱的再生。本发明方法制得的重组水蛭素蛋白回收率可达95%以上,100μg重组水蛭素中内毒素含量<0.25EU/ml。
作为优选,步骤S5中水蛭素抗凝剂的喷涂量为每ml采血管内喷涂20~50μg 水蛭素。
作为优选,步骤S5中抽真空的真空度为≤-100pa。
本发明相比于现有技术,具有如下有益效果:
(1)本发明在真空采血管内壁喷涂去除内毒素的水蛭素抗凝剂,可提高血液检测的准确性,特别适用于血液样品中含致热源的特殊项目检测要求,且所用重组水蛭素纯度高、安全性好,对检测结果干扰小;
(2)本发明采用阴离子交换色谱法去除重组水蛭素蛋白溶液中的内毒素,通过进样量的调控来实现良好的去除效果,同时保证较高的蛋白回收率;
(3)本发明根据重组水蛭素和内毒素在中性条件下与阴离子交换剂吸附作用的强弱,通过增加流动相中的盐浓度进行等度洗脱,吸附力弱的重组蛋白素优先流出,而作用力强的内毒素成分在高盐浓度的再生液作用下被解离;
(4)本发明通过简单、快捷的方法有效去除重组水蛭素中的内毒素,同时使制得的抗凝真空采血管的检测范围广、使用时间长、污染小、安全可靠,适用于工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例,对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明,本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料,实施例中所采用的方法均为本领域的常规方法。应当理解的是,此处所描述的具体实施例仅用于帮助理解本发明,不用于本发明的具体限制。
本发明提供一种无内毒素水蛭素抗凝真空采血管,真空采血管通过如下步骤制得:
S1、用超声波对采血管进行清洗、干燥;
S2、在采血管内壁表面涂覆硅化剂,再130~180℃温度下固化硅化剂;
S3、用环氧乙烷对采血管进行灭菌,并去除残留环氧乙烷;
S4、采用阴离子交换色谱法去除重组水蛭素中的内毒素,并用无热源的注射用水稀释,并除菌过滤,得到无菌、无内素的水蛭素抗凝剂;
S5、在无菌环境下,在采血管内壁自上而下2cm处喷涂水蛭素抗凝剂,每 ml采血管内喷涂20~50μg水蛭素,干燥后,对采血管抽真空至≤-100pa,密封即得;
其中,高效液相阴离子交换色谱法具体包括如下步骤:
进样:取纯度≥95%的重组水蛭素蛋白溶液,以70~100ml/min的流速进样,进样量为色谱柱最大载样量的25~40%,并用浓度为8~20mmol/L、pH值为 6.5~7.5的Tris-HCl缓冲液平衡液冲洗进行柱平衡,冲洗体积为3~6倍柱体积;
洗脱:以pH值为6.5~7.5、含NaCl的Tris-HCl缓冲液为流动相进行洗脱,其中,NaCl的浓度为100~150mmol/L,Tris-HCl的浓度为8~20mmol/L,收集流出部分的洗脱液,即得到重组水蛭素;
再生:用3~6倍柱体积的再生液进行洗脱,其中,再生液为pH值为6.5~7.5、含NaCl的Tris-HCl缓冲液,NaCl的浓度为1.0~2.0mol/L,Tris-HCl的浓度为 8~20mmol/L,除去色谱柱中残留的内毒素;最后用3~6倍柱体积的平衡液进行冲洗,即可用于再次上样分离。
本发明的重组水蛭素蛋白溶液为大肠杆菌或酵母菌发酵分泌表达的重组水蛭素发酵液经过纯化处理得到,纯化工艺为常规色谱分离方法,此处不再赘述。
通过本发明去除内毒素后,重组水蛭素的蛋白回收率≥95%,经鲎试剂凝胶法检测,100μg重组水蛭素中内毒素含量<0.25EU/ml。
实施例1
(1)先采用高效液相阴离子交换色谱法去除重组水蛭素蛋白溶液中的内毒素,以DEAE键合硅胶色谱柱(粒径5μm,孔径300埃,直径40mm×长度500mm) 填料,具体步骤如下:
进样:取纯度95%的重组水蛭素蛋白溶液,以80ml/min的流速进样,进样量为色谱柱最大载样量的30%,并用浓度为10mmol/L、pH值为7.0的Tris-HCl 缓冲液平衡液冲洗进行柱平衡,冲洗体积为5倍柱体积;
洗脱:以pH值为7.0、含NaCl的Tris-HCl缓冲液为流动相进行洗脱,其中, NaCl的浓度为120mmol/L,Tris-HCl的浓度为10mmol/L,收集流出部分的洗脱液,即得到重组水蛭素,备用;
再生:用5倍柱体积的再生液进行洗脱,其中,再生液为pH值为7.0、含 NaCl的Tris-HCl缓冲液,NaCl的浓度为1.5mol/L,Tris-HCl的浓度为10mmol/L,除去色谱柱中残留的内毒素;最后用5倍柱体积的平衡液进行冲洗,即可用于再次上样分离;
(2)再用重组水蛭素按如下方法制备真空采血管:
S1、用超声波对采血管进行清洗、干燥;
S2、在采血管内壁表面涂覆二甲基二氯硅烷,再150℃温度下固化硅化剂;
S3、用环氧乙烷对采血管进行灭菌,并去除残留环氧乙烷;
S4、采用阴离子交换色谱法去除重组水蛭素中的内毒素,并用无热源的注射用水稀释,并除菌过滤,得到无菌、无内毒素的水蛭素抗凝剂;
S5、在无菌环境下,在采血管内壁自上而下喷涂水蛭素抗凝剂,每ml采血管内喷涂20~50μg水蛭素,进行冷冻干燥,再对采血管抽真空至-200pa,密封,即得无内毒水蛭素抗凝真空采血管。
本实施例所用色谱柱的介质填料及重组水蛭素蛋白溶液均为宁波博睿瀚达生物科技有限公司自行生产。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于进样量为色谱柱最大载样量的25%,其余操作方法和工艺条件均与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅在于进样量为色谱柱最大载样量的40%,其余操作方法和工艺条件均与实施例1相同。
对比例1
(1)先采用阴离子交换色谱法去除重组水蛭素蛋白溶液中的内毒素,以 DEAE键合硅胶色谱柱(粒径5μm,孔径300埃,直径40mm×长度500mm)填料,具体步骤如下:
进样:取纯度95%的重组水蛭素蛋白溶液,以80ml/min的流速进样,进样量为色谱柱最大载样量的30%,并用浓度为10mmol/L、pH值为7.0的Tris-HCl 缓冲液平衡液冲洗进行柱平衡,冲洗体积为5倍柱体积;
洗脱:以流动相A-流动相B进行梯度洗脱,其中,流动相A为pH值为7.0、含NaCl的Tris-HCl缓冲液,NaCl的浓度为120mmol/L,Tris-HCl的浓度为10 mmol/L;流动相B为pH值为7.0、含NaCl的Tris-HCl缓冲液,NaCl的浓度为 1.5mol/L,Tris-HCl的浓度为10mmol/L;洗脱程序为:0-60min:100%→0%流动相A,0%→100%流动相B;用紫外检测器采集信号,检测波长为UV 254nm,当基线上升时收集主要的洗脱峰部分,得到重组水蛭素,备用;剩余流出部分为含内毒素组分的洗脱液;
再生:用2倍柱体积的流动相B进行洗脱,再用5倍柱体积的平衡液进行冲洗,即可用于再次上样分离;
(2)再用重组水蛭素制备真空采血管,具体操作步骤与实施例1相同,此处不再赘述。
对比例2
对比例2与实施例1的区别仅在于进样量为色谱柱最大载样量的50%,其余操作方法和工艺条件均与实施例1相同。
对比例3
对比例3与实施例1的区别仅在于直接用重组水蛭素蛋白溶液喷涂采血管内壁,未采用阴离子交换色谱法去除内毒素,其余操作方法和工艺条件均与实施例 1相同。
对比例4
对比例4为普通市购肝素抗凝真空采血管(生产厂家为美国BD公司)。
参考《中国药典》2010年版第1部规定的凝血酶滴定法,分别测定测定实施例1-3和对比例1-4中水蛭素抗凝剂中的内毒素含量,并分别采用G试验和GM试验检测1,3-D葡聚糖和半乳甘露聚糖抗原,平行测定3次。结果如表1所示。
表1实施例1-3和对比例1-4中采血管内毒素及真菌、霉菌检测结果
实施例 | 100μg重组水蛭素中内毒素含量 | G试验 | GM试验 |
实施例1 | <0.25EU/ml | - | - |
实施例2 | <0.25EU/ml | - | - |
实施例3 | <0.5EU/ml | - | - |
对比例1 | <0.5EU/ml | - | - |
对比例2 | ≥0.75EU/ml | + | + |
对比例3 | >10EU/ml | + | + |
对比例4 | <0.25EU/ml | - | - |
注:表格中“+”表示检测结果为阳性,“-”表示检测结果为阴性。
以上实施例对本发明要求保护的技术方案参数范围内点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换形成的新的技术方案,同样都在本发明要求的保护范围内,并且本发明方案所有涉及的参数间如无特别说明,则相互之间不存在不可替换的唯一组合。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明,并不用于限定本发明的保护范围。本发明所属技术领域的技术人员可以采用等同替换或等效变换的方式获得与本发明相似或相近的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种无内毒素水蛭素抗凝真空采血管,其特征在于,在真空采血管的内壁上涂有重组水蛭素,100μg重组水蛭素中内毒素含量<0.25EU/ml;
所述真空采血管制备方法包括如下步骤:
S1、用超声波对采血管进行清洗、干燥;
S2、在采血管内壁表面涂覆硅化剂,高温固化硅化剂;
S3、用环氧乙烷对采血管进行灭菌,并去除残留环氧乙烷;
S4、采用阴离子交换色谱法去除重组水蛭素中的内毒素,并用无热源的注射用水稀释,并除菌过滤,得到无菌、无内毒素的水蛭素抗凝剂;
S5、在无菌环境下,在采血管内壁喷涂水蛭素抗凝剂,干燥后,对采血管抽真空并密封;
其中步骤S2中固化硅化剂的温度为130~180℃;
阴离子交换色谱法具体包括如下步骤:
进样:取重组水蛭素蛋白溶液进样,进样量为色谱柱最大载样量的25~40%,用平衡液冲洗进行柱平衡;
洗脱:用洗脱液进行等度洗脱,并收集流出部分,得到重组水蛭素洗脱液;
柱再生:用再生液进行等度洗脱内毒素,弃去流出部分;
洗脱液和再生液均为pH值为6.5~7.5、含NaCl的Tris-HCl缓冲液,且洗脱液中氯离子浓度小于再生液中氯离子浓度;
阴离子交换色谱以二乙基氨基乙基键合硅胶基质为色谱柱,该基质为:粒径5μm,孔径300埃,直径40mm×长度500mm;
洗脱液中,NaCl的浓度为100~150 mmol/L,Tris-HCl的浓度为8~20 mmol/L;
再生液中,NaCl的浓度为1.0~2.0 mol/L,Tris-HCl的浓度为8~20 mmol/L。
2.根据权利要求1所述的无内毒素水蛭素抗凝真空采血管,其特征在于,重组水蛭素为采用阴离子交换色谱法对重组水蛭素蛋白液进行分离得到。
3.根据权利要求1所述的无内毒素水蛭素抗凝真空采血管,其特征在于,平衡液为浓度为8~20 mmol/L 、pH值为6.5~7.5的Tris-HCl缓冲液。
4.根据权利要求1所述的无内毒素水蛭素抗凝真空采血管,其特征在于,重组水蛭素蛋白溶液为对重组水蛭素发酵液进行纯化制得,纯度≥90%。
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