CN113072639B

CN113072639B - 一种高纯度重组水蛭素的纯化方法

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Publication number: CN113072639B
Application number: CN202110279339.XA
Authority: CN
Inventors: 朱文瑾; 李浛君; 陈平; 李浛民
Original assignee: Ningbo Borui Handa Biotechnology Co ltd
Current assignee: Ningbo Borui Handa Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-03-16
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2041-03-16
Also published as: CN113072639A

Abstract

本发明涉及生物医药的分离技术领域，具体涉及一种高纯度重组水蛭素的纯化方法，取重组水蛭素发酵液，经过预处理后，先采用疏水色谱分离，收集重组水蛭素洗脱液I，再采用阴离子交换色谱进行分离，收集重组水蛭素洗脱液II，干燥，得到高纯度重组水蛭素，其中，疏水色谱以苯基键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相。本发明结合疏水层析和阴离子交换层析两种液相色谱，通过梯度洗脱实现重组水蛭素与杂质组分的分离，有效去除重组水蛭素发酵液中的内毒素和宿主蛋白，制得高纯度高比活的重组水蛭素，本发明的方法选择性好、分辨率高、分离速度快，避免了有机溶剂对人体和环境的危害，降低了成本，稳定性和安全性好，适用于大规模工业化生产。

Description

一种高纯度重组水蛭素的纯化方法

技术领域

本发明涉及生物医药的分离技术领域，具体涉及一种高纯度重组水蛭素的纯化方法。

背景技术

水蛭是我国传统中药，始载于《神农本草经》，具有破血、逐瘀、痛经之功效。从水蛭唾液腺里提取的水蛭素是一种抗凝血蛋白质，其对凝血酶具有极强的抑制作用，可用于抑制纤维蛋白原和血小板在损伤血管内的积累、预防血栓形成、治疗弥散性血管内凝血等疾病。相比肝素、阿司匹林等传统的抗凝药物，水蛭素具有用量小、疗效高、不良反应少、安全性高等优点，具有很好的临床应用价值。

天然水蛭素是由65-66个氨基酸残基组成的单链环肽化合物，分子量约为7000Da，其中N末端有3对二硫键，可绕叠成密集的环肽结构，其疏水结构域与凝血酶催化中心附近的非极性结合点互补，对蛋白质起稳定作用，而C末端有6个酸性氨酸，能与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键。由于水蛭素在水蛭中的含量有限，从水蛭中难以提取大量水蛭素，不能满足临床的使用要求，因而通过基因工程重组水蛭素成为国内外医药界的研究重点。重组水蛭素在第63位氨基酸Tyr残基上脱SO^3-，其余结构与性质跟天然水蛭素基本相同。

最早的重组水蛭素cDNA已于20世纪80年被成功克隆出来，至今重组水蛭素已在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌及真核细胞等成功表达。如专利CN1420176A中合成的水蛭素基因在酵母工程菌中中获得了高水平表达，且发酵液中蛋白纯度较高。公开号为CN110684101A的专利申请提供的重组水蛭素的制备方法，可以得到大量分泌菌体，提高活性产物的表达。

然而，目前的研究重点主要在重组水蛭素的制备和表达方面，而对进一步的分离和纯化研究则相对较少。传统将发酵液加热后放入发酵罐中的处理方式不适于工业化生产，并且采用低温离心去除杂质的可操作性差，且蛋白纯度低、色素含量高。公开号为CN106834395A的专利申请利用发酵液上清液通过pH调节和上罐加热的处理方式，提高了重组水蛭素的蛋白纯度，并采用低温静置过滤去除杂蛋白和脂类物质，但该方法分离流程复杂，且静置分离的效率太低，总活性回收率也较低。公开号为CN104761635A的专利申请采用了膜过滤结合色谱分离技术对天然水蛭素进行分离纯化，但分别采用陶瓷滤膜、有机滤膜和纳滤膜过滤不仅导致水蛭素活性回收率偏低，而且其中纳滤膜起到浓缩作用，但纯度并未提高，并降低了水蛭素的疏水性，在纳滤后再经过反相色谱洗脱，大大降低了水蛭素在反相色谱柱上的吸附作用力，严重影响分离效果。此外，目前反相色谱分离大多采用乙腈、甲醇等有机溶剂，不仅会破坏蛋白质分子结构，导致活性损失，还可能存在溶剂残留，对人体和环境都造成危害。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种简单高效、节能环保且适用于大规模工业化生产的重组水蛭素的纯化方法，可制得具有高纯度、高比活、高回收率的重组水蛭素。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实施：一种高纯度重组水蛭素的纯化方法，取重组水蛭素发酵液，经过预处理后，先采用疏水色谱分离，收集重组水蛭素洗脱液I，再采用阴离子交换色谱进行分离，收集重组水蛭素洗脱液II，干燥，得到高纯度重组水蛭素，其中，疏水色谱以苯基键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相；阴离子交换色谱以二乙基氨基乙基(DEAE)键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相。

本发明先以温和的疏水层析作用，在保持水蛭素蛋白分子结构完整和活性稳定的同时去除部分杂质，再通过阴离子交换色谱去除残留的宿主杂蛋白，分别以盐溶液为流动相进行线性梯度洗脱，得到高纯度的重组水蛭素。

蛋白质在分离纯化过程中极易受到温度、搅拌、酸碱度、有机溶剂等物理化学因素的影响发生变性，导致回收率低甚至失活。而疏水层析是一种相对温和的纯化方法，重组水蛭素经过疏水色谱分离可保持蛋白分子的结构和活性稳定，其活性回收率可达80％以上。本发明以键合苯基基团的硅胶基质作为疏水色谱固定相，重组水蛭素发酵液中的各组分与固定相疏水基团之间的作用力不同而实现分离。目前普遍采用的碳十八烷基硅胶填料，其表面的烷基链长度对蛋白质、多肽类物质的吸附保留和活性回收有很大影响，烷基链越长，固定相疏水性越强，蛋白质和多肽与固定相的结合力越强，为使水蛭素蛋白顺利洗脱需增加流动相有机溶剂的洗脱浓度，而有机溶剂会引起多肽链聚集，导致蛋白分子不可逆吸附和生物活性丧失并。而本发明使用的苯基键合硅胶的疏水性相对C18硅胶柱较弱，重组水蛭素和杂质成分在疏水分离时的选择差异性更大，分辨率更好，提纯比活性和回收率更高。

作为优选，本发明的预处理包括：先将重组水蛭素发酵液的pH值调节至2.5～3.5进行酸沉，再取上清液加热至76～83℃恒温保存5～10min，再用冰水浴降温，得到粗提重组水蛭素。

进一步优选，将酸沉后的上清液加热至80℃恒温保存8～10min。

重组水蛭素的等电点为3.9，将pH值调节至2.5～3.5可使多肽释放质子而带负电，此时可除去部分杂质，再经过热处理除去热不稳定蛋白质。重组水蛭素蛋白分子在80℃条件下的活性可维持10min左右，因而热处理时间不得超过10min，再在热处理后需立即用冰水浴降温。

作为优选，疏水色谱以流动相A-流动相B作为流动相，其中，流动相A为pH值为4.5～5.5的氯化钠-磷酸盐缓冲液，流动相B为pH值为4.5～5.5的磷酸盐缓冲液。

进一步优选，疏水色谱的洗脱程序为：0-120min：100％→0％流动相A，0％→100％流动相B。

本发明以不同浓度的盐溶液作为混合流动相进行梯度洗脱，其中流动相A含有氯化钠，因而开始洗脱时盐浓度较高，在洗脱过程中流动相中氯化钠浓度逐渐降低。通过增加盐浓度，可增强重组水蛭素与固定相介质表面产生较强的相互作用力而被吸附，随着梯度洗脱程序降低盐浓度，从而实现重组水蛭素的解吸附。发酵培养基成分、色素、宿主蛋白等疏水性低的杂质在高盐浓度洗脱下优先流出，随后重组水蛭素蛋白在低盐浓度流动相作用下被洗脱，部分疏水性更强的杂质仍然保留需通过再生液洗脱。

进一步优选，疏水色谱的流动相A中，氯化钠的浓度为0.08～1.5mol/L。

进一步优选，疏水色谱的流动相A和流动相B中，磷酸盐的浓度均为30～60mmol/L。

作为优选，粗提重组水蛭素进行疏水色谱分离时的进样流速为70～100mL/min。

进一步优选，进样后先用流动相A进行柱平衡，再根据洗脱程序进行洗脱。

作为优选，疏水色谱分离时，流动相的洗脱速度为70～100mL/min。

作为优选，在洗脱程序完成后，用再生液I进行洗脱，完成疏水色谱的柱再生。

进一步优选，再生液I为70％～90％乙醇。

在完成重组水蛭素洗脱液I的收集之后，用再生液进行柱再生，可以洗去结合于分离介质表面吸附力强的组分，避免杂质残留污染色谱柱，有助于延长色谱柱使用寿命。并且柱再生用的乙醇易于回收利用，污染小，节能环保，可进一步降低生产成本。

作为优选，阴离子交换色谱以流动相A-流动相B作为流动相，其中，流动相A为pH值为6.5～7.5的Tris-HCl缓冲液，流动相B为pH值为6.5～7.5的NaCl-Tris-HCl缓冲液。

进一步优选，阴离子交换色谱的洗脱程序为：0-120min：100％→0％流动相A，0％→100％流动相B。

阴离子交换色谱以离子交换剂为固定相，同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合，如蛋白质之间或蛋白质与其他分子之间，带相同电荷类型的离子会竞争性地结合与其电荷相反的固定相介质。本发明中，低于等电点pH值的重组水蛭素带负电荷，其大体积的阴离子可以和带负电荷的氯离子相交换而与色谱柱填料表面结合，再通过流动相中氯离子使该过程逆转。由于不同组分的电荷特性不同，在交换离子色谱的梯度洗脱过程中，随着流动相中氯离子浓度增加，结合力弱的重组水蛭素蛋白优先流出，而结合力强的杂质蛋白随后被洗脱，从而达到分离的目的。在疏水色谱分离之后结合阴离子交换色谱，可以去除残留的宿主杂蛋白和内毒素成分，进一步提高重组水蛭素的比活，得到高纯度的重组水蛭素。

进一步优选，阴离子交换色谱的流动相A和流动相B中，Tris-HCl的浓度均为8～20mmol/L。

进一步优选，阴离子交换色谱的流动相B中，NaCl的浓度为150～350mmol/L。

作为优选，重组水蛭素洗脱液I进行阴离子交换色谱分离时的进样流速为70～100mL/min。

作为优选，阴离子交换色谱分离时，流动相的洗脱速度为70～100mL/min。

作为优选，在完成洗脱程序后，用再生液II进行洗脱，完成阴离子交换色谱的柱再生。

进一步优选，再生液II为pH值为6.5～7.5的NaCl-Tris-HCl缓冲液。

再进一步优选，再生液II中NaCl的浓度为0.6～1.2mol/L，Tris-HCl的浓度均为8～20mmol/L。

本发明的疏水色谱和阴离子交换色谱均采用盐溶液作为流动相，对蛋白活性影响较小，且相比于常用的有机溶剂流动相成本更低，对环境污染小，也避免了溶剂残留对人体的危害，提高产品稳定性和安全性。

本发明相比于现有技术，具有如下有益效果：

(1)本发明结合疏水层析和阴离子交换层析两种液相色谱，通过梯度洗脱实现重组水蛭素与杂质组分的分离，有效去除重组水蛭素发酵液中的内毒素和宿主蛋白，制得高纯度高比活的重组水蛭素；

(2)本发明在疏水色谱分离时采用盐溶液为流动相进行梯度洗脱，开始时较高的盐浓度可以增强重组水蛭素与分离介质表面的吸附作用，随着盐浓度降低，疏水性不同的成分先后流出，实现重组水蛭素与杂质的初步分离；

(3)本发明的粗提水蛭素在低于等电点时表面带负电荷，可与流动相中的氯离子交换而固定于填料表面，而在梯度洗脱过程中氯离子浓度增加，竞争性地与离子交换剂结合，结合力弱的重组水蛭素蛋白优先被洗脱，进一步提高其纯度和比活，去除残留的宿主杂蛋白和内毒素；

(4)本发明选择合理的固定相和流动相依次进行洗脱分离，选择性好、分辨率高、分离速度快，减少了有机溶剂的使用，避免环境污染和溶剂残留带来的健康隐患，且分离所用的色谱柱无需通过强酸强碱再生，使用寿命长，该方法绿色、安全、环保、成本低，适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1为实施例1中重组水蛭素洗脱液II的HPLC分析图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法均为本领域的常规方法。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于帮助理解本发明，不用于本发明的具体限制。

本发明提供一种高纯度重组水蛭素的纯化方法，包括如下步骤：

(1)预处理：先将重组水蛭素发酵液的pH值调节至2.5～3.5进行酸沉，再取上清液加热至76～83℃恒温保存5～10min，得到粗提水蛭素，再立即用冰水降温，得到粗提重组水蛭素；

(2)疏水色谱分离：以苯基键合硅胶为固定相，取粗提重组水蛭素以70～100mL/min的流速进样，先用3～6倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相A-流动相B以70～100mL/min的流速进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-120min：100％→0％流动相A，0％→100％流动相B；其中，流动相A为pH值为4.5～5.5的氯化钠-磷酸盐缓冲液，氯化钠浓度为0.08～1.5mol/L，磷酸盐的浓度为30～60mmol/L，流动相B为pH值为4.5～5.5、浓度为30～60mmol/L的磷酸盐缓冲液；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV 254nm，当基线第二次上升时开始收集主要洗脱峰部分直至吸收峰下降回到基线，得到重组水蛭素洗脱液I；洗脱结束后用3～6倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再生液I为70％～90％乙醇；再用2～3倍柱体积的流动相B清洗，除去多余的有机溶剂乙醇，最后用3～6倍柱体积的流动相A清洗，完成苯基键合硅胶色谱柱的再生；

(3)阴离子交换色谱分离：以DEAE键合硅胶为固定相，取重组水蛭素洗脱液I以70～100mL/min的流速进样，先用3～6倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相A-流动相B以70～100mL/min的流速进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-120min：100％→0％流动相A，0％→100％流动相B；其中，流动相A为pH值为6.5～7.5、浓度为8～20mmol/L的Tris-HCl缓冲液，流动相B为pH值为6.5～7.5的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl浓度为150～350mmol/L，Tris-HCl的浓度为8～20mmol/L；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV 254nm，当基线上升时收集主要的洗脱峰部分，得到重组水蛭素洗脱液II，最后进行冷冻干燥，即得高纯度重组水蛭素；洗脱结束后用3～6倍柱体积的再生液II洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再用3～6倍柱体积的流动相A清洗，完成色谱柱的再生；其中，再生液II为pH值为6.5～7.5的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl的浓度为0.6～1.2mol/L，Tris-HCl的浓度均为8～20mmol/L。

本发明所用的重组水蛭素发酵液为大肠杆菌或酵母菌发酵分泌表达的发酵液。

本发明制得的高纯度重组水蛭素原液，蛋白质含量≥2mg/mL，生物效价≥36000ATU/ml，比活性≥18000ATU/mg，总活性回收率70％，经SDS-PAGE电泳检测和HPLC-C18检测的纯度≥98％。

实施例1

(1)预处理：先将酵母菌分泌表达的重组水蛭素发酵液的pH值调节至2.5～3.5进行酸沉，再取上清液加热至80℃恒温保存10min，得到粗提水蛭素，再立即用冰水降温，得到粗提重组水蛭素；

(2)疏水色谱分离：以苯基键合硅胶为色谱柱(粒径5μm，孔径300埃，直径40mm×长度500mm)填料，取粗提重组水蛭素以80mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相A-流动相B以80mL/min的流速进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-120min：100％→0％流动相A，0％→100％流动相B；其中，流动相A为pH值为5.0的氯化钠-磷酸盐缓冲液，氯化钠浓度为1mol/L，磷酸盐的浓度为50mmol/L，流动相B为pH值为5.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV254nm，当基线第二次上升时开始收集主要洗脱峰部分直至吸收峰下降回到基线，得到重组水蛭素洗脱液I；洗脱结束后用5倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再生液I为80％乙醇；再用2倍柱体积的流动相B清洗，除去多余的有机溶剂乙醇，最后用5倍柱体积的流动相A清洗，完成苯基键合硅胶色谱柱的再生；

(3)阴离子交换色谱分离：以DEAE键合硅胶为色谱柱(粒径5μm，孔径300埃，直径40mm×长度500mm)填料，取重组水蛭素洗脱液I以80mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相A-流动相B以80mL/min的流速进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-120min：100％→0％流动相A，0％→100％流动相B；其中，流动相A为pH值为7.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，流动相B为pH值为7.0的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl的浓度为300mmol/L，Tris-HCl的浓度为10mmol/L；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV254nm，当基线上升时收集主要的洗脱峰部分，得到重组水蛭素洗脱液II，最后进行冷冻干燥，即得高纯度重组水蛭素；洗脱结束后用5倍柱体积的再生液II洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再用5倍柱体积的流动相A清洗，完成色谱柱的再生；其中，再生液II为pH值为7.0的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl的浓度为1mol/L，Tris-HCl的浓度均为10mmol/L。

本实施例所用色谱柱的介质填料均为宁波博睿瀚达生物科技有限公司自行生产。分别采用TH底物生色法对重组水蛭素洗脱液I和重组水蛭素洗脱液II进行生物活性测定，具体操作方法参考专利CN101248998B中水蛭素的抗凝比活性测定方法，结果如表1所示，最终得到的高纯度重组水蛭素的HPLC纯度为98.9％，HPLC分析的吸收图谱如图1所示。

表1实施例1中重组水蛭素样品的生物活性测定结果

实施例2

(1)预处理：先将实施例1中的重组水蛭素发酵液的pH值调节至2.5～3.5进行酸沉，再取上清液加热至80℃恒温保存10min，得到粗提水蛭素，再立即用冰水降温，得到粗提重组水蛭素；

(2)疏水色谱分离：以苯基键合硅胶为色谱柱(粒径5μm，孔径300埃，直径40mm×长度500mm)填料，取粗提重组水蛭素以80mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的流动相A-流动相B(50:50，v/v)进行柱平衡，再以80mL/min的流速进行梯度洗脱，洗脱程序为：0-120min：50％→0％流动相A，50％→100％流动相B；其中，流动相A为pH值为5.0的氯化钠-磷酸盐缓冲液，氯化钠浓度为1mol/L，磷酸盐的浓度为50mmol/L，流动相B为pH值为5.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV 254nm，当基线第二次上升时开始收集主要洗脱峰部分直至吸收峰下降回到基线，得到重组水蛭素洗脱液I；洗脱结束后用5倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再生液I为80％乙醇，再用5倍柱体积的流动相A-流动相B(50:50，v/v)清洗，完成苯基键合硅胶色谱柱的再生；

(3)阴离子交换色谱分离：以DEAE键合硅胶色谱柱(粒径5μm，孔径300埃，直径40mm×长度500mm)填料，取重组水蛭素洗脱液I以80mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相A-流动相B以80mL/min的流速进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-120min：100％→0％流动相A，0％→100％流动相B；其中，流动相A为pH值为7.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，流动相B为pH值为7.0的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl的浓度为300mmol/L，Tris-HCl的浓度为10mmol/L；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV 254nm，当基线上升时收集主要的洗脱峰部分，得到重组水蛭素洗脱液II，最后进行冷冻干燥，即得高纯度重组水蛭素；洗脱结束后用5倍柱体积的再生液II洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再用5倍柱体积的流动相A清洗，完成色谱柱的再生；其中，再生液II为pH值为7.0的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl的浓度为1mol/L，Tris-HCl的浓度均为10mmol/L。

本实施例所用色谱柱的介质填料均为自行生产。分别采用TH底物生色法对重组水蛭素洗脱液I和重组水蛭素洗脱液II进行生物活性测定，最终得到的高纯度重组水蛭素的HPLC纯度为98.3％，各步骤活性测定结果如表2所示。

表2实施例2中重组水蛭素样品的生物活性测定结果

实施例3

(2)疏水色谱分离：以苯基键合硅胶为色谱柱(粒径5μm，孔径300埃，直径40mm×长度500mm)填料，取粗提重组水蛭素以80mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相B以80mL/min的流速进行等度洗脱；其中，流动相A为pH值为5.0的氯化钠-磷酸盐缓冲液，氯化钠浓度为1mol/L，磷酸盐的浓度为50mmol/L；流动相B为pH值为5.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液。用紫外检测器采集信号，检测波长为UV 254nm，当基线第二次上升时开始收集主要洗脱峰部分直至吸收峰下降回到基线，得到重组水蛭素洗脱液I；洗脱结束后用5倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再生液I为80％乙醇，再用5倍柱体积的流动相A清洗，完成苯基键合硅胶色谱柱的再生；

本实施例所用色谱柱的介质填料均为自行生产。分别采用TH底物生色法对重组水蛭素洗脱液I和重组水蛭素洗脱液II进行生物活性测定，最终得到的高纯度重组水蛭素的HPLC纯度为96.6％，各步骤活性测定结果如表3所示。

表3实施例3中重组水蛭素样品的生物活性测定结果

对比例1

本对比例与实施例1的区别仅在于反相色谱分离的色谱柱为C18柱(直径40mm×长度500mm，粒径5μm，孔径300埃)，所用分离介质为自行生产的十八烷基键合硅胶，其他操作方法与条件均与实施例1相同。

分别采用TH底物生色法对重组水蛭素洗脱液I和重组水蛭素洗脱液II进行生物活性测定，最终得到的高纯度重组水蛭素的HPLC纯度为94.8％，样品活性测定结果如表4所示。

表4对比例1中重组水蛭素样品的生物活性测定结果

检测项目	蛋白含量	生物效价	比活性	活性回收率
					重组水蛭素洗脱液I	1.23mg/ml	16984IU/ml	13808IU/mg	53％
重组水蛭素洗脱液II	1.71mg/ml	30562IU/ml	17873IU/mg	85％

对比例2

(2)阴离子交换色谱分离：以DEAE键合硅胶键合色谱柱(粒径5μm，孔径300埃，直径40mm×长度500mm)填料，取重组水蛭素洗脱液I以80mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相A-流动相B以80mL/min的流速进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-120min：100％→0％流动相A，0％→100％流动相B；其中，流动相A为pH值为7.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，流动相B为pH值为7.0的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl的浓度为300mmol/L，Tris-HCl的浓度为10mmol/L；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV254nm，当基线上升时收集主要的洗脱峰部分，得到重组水蛭素洗脱液I，最后进行冷冻干燥，即得高纯度重组水蛭素；洗脱结束后用5倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再用5倍柱体积的流动相A清洗，完成色谱柱的再生；其中，再生液I为pH值为7.0的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl的浓度为1mol/L，Tris-HCl的浓度均为10mmol/L；

(3)疏水色谱分离：以苯基键合硅胶为色谱柱(粒径5μm，孔径300埃，直径40mm×长度500mm)填料，取粗提重组水蛭素以80mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相A-流动相B以80mL/min的流速进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-120min：100％→0％流动相A，0％→100％流动相B；其中，流动相A为pH值为5.0的氯化钠-磷酸盐缓冲液，氯化钠浓度为1mol/L，磷酸盐的浓度为50mmol/L，流动相B为pH值为5.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV254nm，当基线第二次上升时开始收集主要洗脱峰部分直至吸收峰下降回到基线，得到重组水蛭素洗脱液II；洗脱结束后用5倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再生液II为80％乙醇；再用2倍柱体积的流动相B清洗，除去多余的有机溶剂乙醇，最后用5倍柱体积的流动相A清洗，完成苯基键合硅胶色谱柱的再生。

本对比例所用色谱柱的介质填料均为自行生产。分别采用TH底物生色法对重组水蛭素洗脱液I和重组水蛭素洗脱液II进行生物活性测定，最终得到的高纯度重组水蛭素的HPLC纯度为95.6％，样品活性测定结果如表5所示。

表5对比例2中重组水蛭素样品的生物活性测定结果

检测项目	蛋白含量	生物效价	比活性	活性回收率
					重组水蛭素洗脱液I	1.45mg/ml	13812IU/ml	9526IU/mg	92％
重组水蛭素洗脱液II	2.1mg/ml	33671IU/ml	16034IU/mg	79％

实施例1和2采用本发明的方法，得到的重组水蛭素具有较高的纯度和比活性；而实施例3在疏水色谱分离时未采用梯度洗脱，导致产品比活性下降。对比例1采用C18柱进行疏水色谱分离，洗脱过程中蛋白容易失活，活性回收率低；而对比例2在疏水分离前先进行阴离子交换分离，活性回收率虽未明显下降，但色素分子会和水蛭素会被一起洗脱下来，从而降低比活性。

以上实施例对本发明要求保护的技术方案参数范围内点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换形成的新的技术方案，同样都在本发明要求的保护范围内，并且本发明方案所有涉及的参数间如无特别说明，则相互之间不存在不可替换的唯一组合。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明，并不用于限定本发明的保护范围。本发明所属技术领域的技术人员可以采用等同替换或等效变换的方式获得与本发明相似或相近的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种高纯度重组水蛭素的纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1预处理：先将酵母菌分泌表达的重组水蛭素发酵液的pH值调节至2.5~3.5进行酸沉，再取上清液加热至80℃ 恒温保存10min，得到粗提水蛭素，再立即用冰水降温，得到粗提重组水蛭素；

S2疏水色谱分离：以苯基键合硅胶为色谱柱（粒径5μm，孔径300埃，直径40mm×长度500mm）填料，取粗提重组水蛭素以80 mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相A-流动相B以80 mL/min的流速进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-120min：100%→0%流动相A，0%→100%流动相B；其中，流动相A为pH值为5.0的氯化钠-磷酸盐缓冲液，氯化钠浓度为1 mol/L，磷酸盐的浓度为50 mmol/L，流动相B为pH值为5.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV 254nm，当基线第二次上升时开始收集主要洗脱峰部分直至吸收峰下降回到基线，得到重组水蛭素洗脱液I；洗脱结束后用5倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再生液I为80%乙醇；再用2倍柱体积的流动相B清洗，除去多余的有机溶剂乙醇，最后用5倍柱体积的流动相A清洗，完成苯基键合硅胶色谱柱的再生；

S3阴离子交换色谱分离：以DEAE键合硅胶为色谱柱（粒径5μm，孔径300埃，直径40mm×长度500mm）填料，取重组水蛭素洗脱液I以80 mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相A-流动相B以80 mL/min的流速进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-120 min：100%→0%流动相A，0%→100%流动相B；其中，流动相A为pH值为7.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，流动相B为pH值为7.0的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl的浓度为300 mmol/L，Tris-HCl的浓度为10 mmol/L；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV 254nm，当基线上升时收集主要的洗脱峰部分，得到重组水蛭素洗脱液II，最后进行冷冻干燥，即得高纯度重组水蛭素；洗脱结束后用5倍柱体积的再生液II洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再用5倍柱体积的流动相A清洗，完成色谱柱的再生；其中，再生液II为pH值为7.0的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl的浓度为1 mol/L，Tris-HCl的浓度均为10 mmol/L。