CN113073100B - 奈替米星核酸适配体及筛选和在奈替米星检测上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学物质检测技术领域，涉及一种奈替米星核酸适配体及筛选和在奈替米星检测上的应用；具体公开了奈替米星核酸适配体、奈替米星核酸适配体的筛选方法、奈替米星检测用生物传感器及奈替米星检测方法。与现有技术相比，本发明检测方法具有检测限低、灵敏度高、特异性强、可视化快速定性分析、样品预处理简单、仪器要求低、成本低廉的优点。本发明提供的检测方法可用于检测水样中奈替米星的含量，检测的浓度范围是1.95‑200nmol/L。

Description

奈替米星核酸适配体及筛选和在奈替米星检测上的应用
技术领域
本发明属于化学物质检测技术领域，尤其是涉及一种奈替米星核酸适配体及筛选和在奈替米星检测上的应用。
背景技术
奈替米星为半合成的氨基糖苷类抗生素，化学组成为3-N-乙基西索米星，为白色或类白色的粉末或疏松块状物。抗菌作用与庆大霉素基本相似，其特点是对氨基糖苷乙酰转移酶AAC(3)稳定，对革兰阴性菌和部分革兰阳性菌具良好抗菌作用。因其不良反应较其他同类产品小，国外已应用于临床，国内也试制成功，用来预防、治疗和诊断疾病，同时有目的地调节动物生理机能、促进生长发育。主要用于临床及动物大肠杆菌、克雷白杆菌、变形杆菌等菌所致的呼吸道、消化道疾病的治疗，也用于防止仔猪等多种动物断奶后多***衰竭综合征(PMWS)引起的继发性感。并且此品在体内不代谢，其不规范的使用则可能导致肉类及奶制品中奈替米星残留过量的问题。同时奈替米星与动物组织的亲和力极强，残留时间长，有严重的耳毒性，肾毒性和神经毒性，吸入可有过敏反应、哮喘等***反应。但此类药物治疗浓度和中毒浓度很接近，在临床应用中受到一定的限制`，在人体内及环境中聚集从而危害人体健康。
目前在环境中奈替米星残留分析使用的方法主要有微生物法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、薄层色谱法及衍生化紫外分光光度法等。但其对于设备，专业知识，检测时间的要求较高，且并不适用于现场快速检测等缺点。这些方法多数样品处理复杂，分析仪器昂贵，一些方法检测灵敏度低。因此，目前的传统检测奈替米星的分析方法存在的局限性，难以实现对奈替米星的快速、实时、有效、简便的定性和定量的分析，因此，研发出一项造价便宜、实时快速、简便易行、高效准确、运行稳定的奈替米星检测技术是当今分析工作者迫切需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术中奈替米星检测技术存在的缺陷，本发明提供一种奈替米星核酸适配体及筛选和在奈替米星检测上的应用，具体包括奈替米星酸适配体、奈替米星核酸适配体的筛选方法、奈替米星检测用生物传感器及奈替米星检测方法。
本发明中以核酸适配体为核心所构建的生物传感器，为今后在复杂的环境介质中定性定量分析奈替米星提供了便捷。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种奈替米星核酸适配体，所述适配体的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
SEQ ID NO.1：
5’-CTCCTCTGACTGTAACCACGCCCGTCAGTAGTGAGCTGCGTGCCAACATCACGCGGGCCGGCATAGGTAGTCCAGAAGCC-3’
本发明提供的奈替米星核酸适配体具有以下特性：
(1)高亲和力
所得到的适配体具有高亲和力：194.16nM；
(2)高特异性
在奈替米星相似物存在时，该适配体对奈替米星表现出良好的选择性。
本发明提供的奈替米星核酸适配体是基于磁珠SELEX法筛选得到的与奈替米星高亲和力、高特异性结合的核酸适配体。
本发明还提供了一种奈替米星核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
S1、奈替米星和羧基磁珠的偶联：
通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺，2-(N-吗啉基)乙磺酸溶液体系下催化羧基磁珠的羧基与奈替米星的氨基发生酰胺化反应，形成酰胺键，从而实现奈替米星偶联固定到羧基磁珠上；
S2、采用对称PCR扩增技术，再采用酶解法得到次级文库，并通过磁珠SELEX筛选得到奈替米星核酸适配体：
采用对称PCR扩增技术，通过设置PCR循环程序和前后引物投入的浓度，使目的ssDNA产物得到大量的扩增和富集，再通过λ核酸外切酶以酶解法制备筛选过程所需的次级文库，通过磁珠SELEX筛选，得到与奈替米星高亲和力、高特异性结合的适配体序列。
优选地，步骤S1中，所述奈替米星和羧基磁珠偶联的具体步骤如下：
S11、将称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于2-(N-吗啉基)乙磺酸中得溶液a；称取N-羟基琥珀酰亚胺溶解于2-(N-吗啉基)乙磺酸中得溶液b；
S12、将溶液a和溶液b加入到已清洗的羧基磁珠中，搅拌混匀，得羧基磁珠溶液；
S13、称取硫酸奈替米星溶解于2-(N-吗啉基)乙磺酸中，得到的奈替米星溶液与羧基磁珠溶液混合，混匀后进行反应，得与萘替米星相偶联的羧基磁珠。
在本发明的一个实施方式中，步骤S12中，所述羧基磁珠选自生工生物工程(上海)股份有限公司(货号：D110550-0100)。
在本发明的一个实施方式中，步骤S1中，所述奈替米星、羧基磁珠、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸、N，N-羟基琥珀酰亚胺、2-(N-吗啉基)乙磺酸，用量及操作为，制备50mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸在2-(N-吗啉基)乙磺酸(25mM)体系下的溶液。同时制备50mg/ml的N，N-羟基琥珀酰亚胺在2-(N-吗啉基)乙磺酸(25mM)体系下的溶液，吸打混匀。分别吸取50μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸在2-(N-吗啉基)乙磺酸体系下的溶液，50μL N，N-羟基琥珀酰亚胺在2-(N-吗啉基)乙磺酸体系下的溶液加入到上述已清洗好的羧基磁珠中，混匀，25℃搅拌1-2h。电子分析天平分别称取奈替米星1mg溶解于100μL 2-(N-吗啉基)乙磺酸(25mM)，移液枪吸取100μL上述奈替米星溶液，加入到1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸、N，N-羟基琥珀酰亚胺、2-(N-吗啉基)乙磺酸与羧基磁珠混合的羧基磁珠溶液中，吸打混匀，放置摇床内，设置摇床条件为100-200rpm，25℃，反应12-24h。反应结束后，弃去上清液，再次用2-(N-吗啉基)乙磺酸溶液清洗磁珠3-6次，随后使用结合缓冲液清洗3-6次，最后将偶联好的羧基磁珠悬浮在100μL结合缓冲液，置于4℃冷藏保存待用。
优选地，步骤S2中，所述奈替米星核酸适配体的获得方法具体如下：
S21、称取ssDNA文库，加入结合缓冲液，吸打混匀，放置于95℃条件下变性10-15min，随后转移置冰块上10-15min，最后在室温条件下静置5-10min；
S22、将步骤S21处理后的ssDNA文库与清洗后的与萘替米星相偶联的羧基磁珠混合，进行孵育反应；
S23、孵育反应结束后，吸取出上清液，然后对磁珠溶液进行清洗、洗脱，使ssDNA从磁珠上洗脱下来，并收集洗脱液；
S24、对洗脱液进行浓缩提纯，收集得到ssDNA片段，同时测量回收得到的溶液中ssDNA的浓度，并以回收浓度/投入浓度来计算筛选效率；
S25、以步骤S24得到的ssDNA片段作为模板，进行对称PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳，若出现正确的目的条带，继续进行下一步；并通过对该PCR产物进行浓度测定，计算出作为下一轮文库所需的量，投入到下一轮的筛选循环中；
S26、采用λ核酸外切酶将步骤S25获得的PCR产物的双链转变为单链，并进行浓度测定，计算出作为下一轮文库所需的量，投入到下一轮的筛选循环中；
S27、重复步骤S21-S26进行多轮筛选，即得到奈替米星核酸适配体。
优选地，步骤S21中，所述ss DNA文库：为生工生物工程(上海)股份有限公司所合成的单链DNA，其序列为：5’-CTCCTCTGACTGTAACCACG-N40-GCATAGGTAGTCCAGAAGCC-3’。
优选地，步骤S25中，所述对称PCR扩增采用的PCR反应体系以总体积50μL计，包括以下各组分为：ssDNA模板2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，2×HiFiTaq PCR StarMix withDye 25μL以及超纯水19μL；
所述上游引物和下游引物的浓度各为10μmol/L；
所述上游引物序列为：5'-CTCCTCTGACTGTAACCACG-3'、下游引物序列为：5'PO4-GGCTTCTGGACTACCTATGC-3'；
所述对称PCR扩增时，PCR循环程序为94℃预变性2min，历经30个循环，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，循环结束后72℃延伸5min。
本发明还提供了一种奈替米星核酸适配体的应用，所述应用包括：奈替米星核酸适配体在制备奈替米星检测试剂、奈替米星检测试剂盒或奈替米星检测生物传感器上的应用；或
所述奈替米星核酸适配体在制备奈替米星捕获、分离或纯化试剂上的应用；或
所述奈替米星核酸适配体在开发奈替米星检测方法上的应用。
本发明还提供了一种奈替米星检测用生物传感器，所述生物传感器以奈替米星核酸适配体为生物识别元件，所述奈替米星核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述生物传感器为基于SYBR Green I的荧光法检测奈替米星的生物传感器。
在本发明的一个实施方式中，所述生物传感器为荧光法生物传感器。
本发明还提供了一种奈替米星检测方法，基于前述奈替米星核酸适配体进行，包括以下步骤：
在奈替米星核酸适配体溶液中加入SYBR Green I溶液，混匀后进行第一次孵育，使得所述SYBR Green I荧光探针嵌入奈替米星核酸适配体所形成的双链当中；
在第一次孵育后的混合液中加入待测样品和缓冲液，混合后进行第二次孵育，对第二次孵育后的混合液进行荧光强度测定，并计算得到待测样品中萘替米星的含量。
在本发明的一个实施方式中，步骤(A)中所述奈替米星核酸适配体配置为500nM的母液。
在本发明的一个实施方式中，步骤(B)中所述的SYBR Green I溶液配制成浓度为100X的母液；
在本发明的一个实施方式中，步骤(B)中所述的3-丙磺酸缓冲液可以采用常规实验方法来配置。
在检测体系中对加入SYBR Green I，奈替米星核酸适配体的终浓度及SYBR GreenI与奈替米星核酸适配体作用的时间进行梯度优化后得到最优的检测条件：SYBR Green I最优终浓度为0.8X，核酸适配体最优终浓度为20nM，SYBR Green I与奈替米星核酸适配体最优作用的时间为8min。
优选地，所述SYBR Green I溶液的终浓度为0.8X，奈替米星核酸适配体溶液的终浓度为20nM；
所述缓冲液pH值为7.0，采用MOPS缓冲液；
第一次孵育的温度为25℃、孵育时间为30min；第二次孵育的温度为25℃、孵育时间为8min。
优选地，所述荧光强度测定和计算得到待测样品中萘替米星的含量的具体方法为：在激发波长485nm和发射波长535nm处测定荧光强度F；并以相同操作但不加待测奈替米星的水溶液作为对照组，测定荧光强度F0；依据荧光强度计算△F＝F0-F的大小来判断待测溶液中奈替米星的含量。
本发明的原理是奈替米星核酸适配体溶液中加入SYBR Green I溶液时，使得SYBRGreen I荧光探针嵌入奈替米星核酸适配体所形成的双链当中，在激发波长485nm和发射波长535nm处产生强烈的荧光强度表达，当体系中存在奈替米星时，核酸适配体与奈替米星结合，核酸适配体结构发生改变，双链打开为单链，从而导致SYBR Green I荧光探针无法嵌入核酸适配体，导致低的荧光信号表达，通过测定荧光强度的衰减△F来判断待测溶液中奈替米星的含量。
本发明奈替米星检测方法能够解决现有技术中检测奈替米星的方法存在的机器昂贵、操作复杂、周期较长的缺点以及不稳定性等技术问题。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1)在各种信号表达的方法中荧光法是一种简单、快速、灵敏的检测方法。本发明提供了一种操作简单、灵敏度高、选择性好、成本低且高效的奈替米星的检测方法。
2)本发明提供了一种抗生素奈替米星的核酸适配体及一种快速检测方法。通过建立磁珠SELEX体系，投入初始适配体文库，进行孵育，分离，洗脱，PCR循环过程，经过多轮筛选得到对靶标分子奈替米星具有高亲和力的核酸适配体，并基于该核酸适配体构建SYBRGreen I荧光方法来实现对奈替米星的检测。通过将筛选所得到的奈替米星的适配体与SYBR Green I荧光探针发生作用，在激发波长485nm和发射波长535nm处产生强烈的荧光强度表达，当体系中存在奈替米星时，核酸适配体与奈替米星结合，核酸适配体结构发生改变，双链打开为单链，从而导致SYBR Green I荧光探针无法嵌入核酸适配体，导致低的荧光信号表达，通过测定荧光强度的衰减△F来判断待测溶液中奈替米星的含量并且体系中奈替米线的含量与荧光强度的衰减△F呈正比关系。该检测方法具有检测限低、灵敏度高、特异性强、样品预处理简单、仪器要求低、成本低廉的优点。
3)和已有对奈替米星的检测技术相比，本发明技术进步是显著的。本发明提供的检测方法不需要大型仪器设备，成本低，检测灵敏度高，选择性好，操作简单且高效，可用于检测水样中奈替米星的含量，检测的浓度范围是1.95-200nmol/L，线性拟合直线方程为Y＝23.947X-79.677，最低检测限为1.95nM。线性方程中X代表检测样本中奈替米星的浓度(nM)，Y代表样本荧光强度的衰减△F。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1：磁珠SELEX法筛选奈替米星核酸适配体原理示意图；
图2：基于SYBR Green I荧光法检测奈替米星原理示意图；
图3：对称PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图4：SELEX的筛选ssDNA回收效率；
图5：奈替米星核酸适配体的解离常数Kd值测定；
图6：缓冲溶液优化结果示意图；
图7：SYBR Green I荧光染料与适配体作用时间优化结果示意图；
图8：SYBR Green I荧光染料浓度优化结果示意图；
图9：奈替米星核酸适配体浓度优化优化结果示意图；
图10：奈替米星检测体系的灵敏度结果示意图；
图11：奈替米星检测体系的特异性结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明首先提供磁珠SELEX法筛选奈替米星核酸适配体的方法，原理示意图如图1所示，包括以下步骤：
(1)奈替米星和羧基磁珠的偶联：
通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺，2-(N-吗啉基)乙磺酸溶液体系下催化羧基磁珠的羧基与奈替米星的氨基发生酰胺化反应，形成酰胺键，从而实现奈替米星偶联固定到羧基磁珠上；
(2)采用对称PCR扩增技术，再采用酶解法得到次级文库，并通过磁珠SELEX筛选过程，得到与奈替米星高亲和力、高特异性结合的适配体序列：
采用对称PCR扩增技术，通过设置PCR循环程序和前后引物投入的浓度，使目的ssDNA产物得到大量的扩增和富集，再通过λ核酸外切酶以酶解法制备筛选过程所需的次级文库，通过磁珠SELEX筛选过程，得到与奈替米星高亲和力、高特异性结合的适配体序列。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)的方法包括以下步骤：
(1.1)、取羧基磁珠，使用2-(N-吗啉基)乙磺酸对羧基磁珠进行多次超声清洗；
(1.2)、称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶解于2-(N-吗啉基)乙磺酸中，称取N，N-羟基琥珀酰亚胺溶解于2-(N-吗啉基)乙磺酸中；
分别吸取N，N-羟基琥珀酰亚胺在2-(N-吗啉基)乙磺酸体系下的溶液，N-羟基琥珀酰亚胺在2-(N-吗啉基)乙磺酸体系下的溶液加入到已清洗好的羧基磁珠中，混匀，搅拌，得到1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸、N，N-羟基琥珀酰亚胺、2-(N-吗啉基)乙磺酸与羧基磁珠混合的羧基磁珠溶液；
称取奈替米星溶解于2-(N-吗啉基)乙磺酸，得到奈替米星溶液，吸取奈替米星溶液，加入到1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸、N，N-羟基琥珀酰亚胺、2-(N-吗啉基)乙磺酸与羧基磁珠混合的羧基磁珠溶液中，吸打混匀，进行反应，反应结束后，得到与奈替米星相偶联的羧基磁珠，弃去上清液，再次用2-(N-吗啉基)乙磺酸溶液清洗与奈替米星相偶联的羧基磁珠3-6次，随后使用结合缓冲液清洗3-6次，最后将与奈替米星相偶联的羧基磁珠悬浮在结合缓冲液，冷藏保存待用。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1.2)中，反应的条件为：100-200rpm，25-30℃，反应12-24h。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)采用对称PCR扩增技术，再通过λ核酸外切酶得到次级文库，并通过磁珠SELEX筛选过程，得到与奈替米星高亲和力，高特异性结合的适配体序列包括以下步骤：
(2.1)、称取ssDNA文库，加入结合缓冲液，吸打混匀，放置于95℃条件下变性10-15min，随后迅速转移置冰块上10-15min，最后在室温25℃条件下静置5-10min；
(2.2)、称取与奈替米星相偶联的羧基磁珠，加入结合缓冲液，使用结合缓冲液对与奈替米星相偶联的羧基磁珠溶液进行多次清洗；
(2.3)、将做过步骤(2.2)和(2.3)的预处理的ssDNA文库与预处理好的与奈替米星相偶联的羧基磁珠溶液相混合，进行孵育；
(2.4)、孵育结束后，吸取出上清液，加入结合缓冲液，对所得的磁珠溶液进行清洗；
(2.5)、清洗后的磁珠溶液中加入洗脱缓冲液，进行洗脱，使ssDNA从磁珠上洗脱下来，收集洗脱液；
(2.6)、采用UNIQ-10柱式通用DNA纯化试剂盒，浓缩提纯收集得到的洗脱液中的ssDNA：
在Wash Solution瓶中加入4倍体积的无水乙醇。100μl DNA溶液(即洗脱液)加300μl Binding BufferⅡ,混匀，放置2分钟。全部转移到UNIQ-10柱，柱子放入2.0mlCollection Tube，室温放置2分钟，用台式离心机，10,000rpm室温离心1分钟。取下UNIQ-10柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入500μl Wash Solution,10,000rpm室温离心30秒。重复一次。取下UNIQ-10柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中，10,000rpm室温离心30秒，以除去残留的Wash Solution。将柱子放入新的干净1.5ml或2.0ml离心管中，在柱子中央加入100μl Elution Buffer,室温放置2分钟，提高洗脱液的温度至55～80℃有利于提高DNA的洗脱效率。10,000rpm室温离心1分钟。收集管中的液体即为回收的ssDNA片段。
(2.7)、通过超微量分光光度计测量回收得到的溶液中ssDNA浓度，并计算筛选效率，筛选效率以回收浓度/投入浓度来计算；
(2.8)、以纯化后的ssDNA溶液作为模板，进行对称PCR扩增，随后取PCR反应液进行3％琼脂糖凝胶电泳，并置于凝胶成像分析***下观察，若出现正确的目的条带，继续进行下一步。通过对该PCR产物进行浓度测定，计算出作为下一轮文库所需的量，投入到下一轮的筛选循环中；
(2.9)、λ核酸外切酶将双链转变为单链，并进行浓度测定，计算出作为下一轮文库所需的量，投入到下一轮的筛选循环中；
(2.10)、重复步骤(2.1)-(2.9)，历经多轮，送样测序，得到奈替米星核酸适配体。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.1)所述的ssDNA文库：为生工生物工程(上海)股份有限公司所合成的单链DNA，其序列为：
5’-CTCCTCTGACTGTAACCACG-N40-GCATAGGTA GTCCAGAAGCC-3’
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.1)、(2.2)中所述的结合缓冲液，其配置方法为：准确称取NaCl 1.461g、Tris-HCl 0.788g、MgCl2·6H2O 0.102g、KCl 0.093g、CaCl20.028g于烧杯中，加入100mL超纯水溶解，吸取Tween 20 50μL加入，随后加入超纯水至220mL，使用NaOH溶液调节pH至7.6补充溶液至250mL；或采用等比例配制的溶液。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.5)中所述的洗脱缓冲液，其配置方法为：准确秤取Tris-HCl 0.631g、EDTA·2Na·2H2O 0.372g、Urea 21.02g于烧杯中，加入50mL超纯水溶解，移液枪吸取Tween 20 20μL加入，随后加入超纯水至80mL，使用NaOH调节pH至8.0补充溶液至100mL；或采用等比例配制的溶液。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.8)中PCR反应的反应体系按以下方法配制：
称PCR反应体系为50μL；上游引物与下游引物的浓度为10μmol/L。所设置的PCR的反应体系为ssDNA模板2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，2×HiFiTaq PCR StarMix withDye 25μL以及超纯水19μL；
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.8)中，进行对称PCR扩增时，上游引物序列：5'-CTCCTCTGACTGTAACCACG-3'，序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列：5'PO4-GGCTTCTGGACTACCTATGC-3'，序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.8)中，进行对称PCR扩增时，PCR循环程序为94℃预变性2min，历经30个循环，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，循环结束后72℃延伸5min。
本发明还提供了奈替米星核酸适配体的应用，包括所述奈替米星核酸适配体在制备奈替米星检测试剂、奈替米星检测试剂盒或奈替米星检测生物传感器上的应用。
本发明还提供了奈替米星核酸适配体的应用，包括所述奈替米星核酸适配体在制备苯奈替米星捕获、分离或纯化试剂上的应用。
本发明还提供了奈替米星核酸适配体的应用，包括所述奈替米星核酸适配体在开发苯奈替米星检测方法上的应用。
本发明还提供一种奈替米星检测用生物传感器，所述生物传感器以奈替米星核酸适配体为生物识别元件，所述奈替米星核酸适配体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体为：
5’-CTCCTCTGACTGTAACCACGCCCGTCAGTAGTGAGCTGCGTGCCAACATCACGCGGGCCGGCATAGGTAGTCCAGAAGCC-3’。
在本发明的一个实施方式中，所述生物传感器为荧光法生物传感器。
本发明还提供一种奈替米星检测方法，基于所述奈替米星核酸适配体进行。本发明奈替米星检测方法能够解决现有技术中检测奈替米星的方法存在的机器昂贵、操作复杂、周期较长的缺点以及不稳定性等技术问题。
本发明奈替米星检测方法，包括以下步骤：
A、准备奈替米星核酸适配体，所述奈替米星核酸适配体核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
B、在一定量所述奈替米星核酸适配体溶液中加入SYBR Green I溶液，混匀孵育，使得所述SYBR Green I荧光探针嵌入奈替米星核酸适配体所形成的双链当中，再加入待测奈替米星的水溶液和3-丙磺酸缓冲液，混匀孵育，在激发波长485nm和发射波长535nm处测定荧光强度F并以其他操作同上但不加待测奈替米星的水溶液作为对照组，测定荧光强度F0，依据荧光强度计算△F＝F0-F的大小来判断待测溶液中奈替米星的含量。
基于SYBR Green I荧光法检测奈替米星原理示意图如图2所示。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例提供一种奈替米星核酸适配体的筛选与获得方法，包括以下步骤：
A.移液枪吸取100μL羧基磁珠于1.5mL离心管中，放置在磁性分离架上，静置2min，小心吸取上清液并弃去。随后取出离心管，加入100μL超纯水，吸打混匀，放置在磁性分离架上，静置2min，小心吸取上清液并弃去。离心管加入100μL2-(N-吗啉基)乙磺酸溶液，吸打混匀再重复该步骤，使用2-(N-吗啉基)乙磺酸对羧基磁珠进行清洗，5次清洗后，小心吸取上清液并弃去。
B.称取10mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶于1ml的2-(N-吗啉基)乙磺酸(25mM)。同时称取50mg的N，N-羟基琥珀酰亚胺溶于1ml的2-(N-吗啉基)乙磺酸(25mM)，吸打混匀。分别吸取50μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸在2-(N-吗啉基)乙磺酸体系下的溶液，50μL N，N-羟基琥珀酰亚胺在2-(N-吗啉基)乙磺酸体系下的溶液加入到上述步骤A已清洗好的羧基磁珠中，混匀，25℃搅拌1-2h。电子分析天平分别称取奈替米星1mg溶解于100μL的2-(N-吗啉基)乙磺酸(25mM)，移液枪吸取100μL上述奈替米星在2-(N-吗啉基)乙磺酸体系下的溶液，加入到1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸、N，N-羟基琥珀酰亚胺、2-(N-吗啉基)乙磺酸与羧基磁珠混合的羧基磁珠溶液中，吸打混匀，放置摇床内，设置摇床条件为160rpm，25℃，反应24h。反应结束后，弃去上清液，再次用2-(N-吗啉基)乙磺酸溶液清洗磁珠3-6次，随后使用结合缓冲液清洗3-6次，最后将偶联好的羧基磁珠悬浮在100μL结合缓冲液，置于4℃冷藏保存待用。
C.移液枪吸取600pmol的ssDNA文库于1.5mL离心管中，加入200μL结合缓冲液，吸打混匀。放置于95℃条件下变性10min，随后迅速转移置冰块上10min，最后在室温25℃条件下静置10min。
D.吸取与奈替米星偶联的羧基磁珠(B步骤所制备)100μL于1.5mL离心管中，加入200μL结合缓冲液，吸打混匀，放置在磁性分离架上，静置2min，小心吸取上清。使用结合缓冲液对磁珠溶液进行重复5的清洗，最后一步，弃去上清液。
E.将步骤C中做过预处理的ssDNA文库与步骤D预处理好的靶标物奈替米星包被的磁珠溶液相混合，随后置于摇床上孵育1h，摇床条件为160rpm，25℃。
F.孵育结束后，小心吸取出上清液。随后加入200μL结合缓冲液，通过磁性分离架，对获得的磁珠溶液进行5次的清洗，最后一步，弃去结合缓冲液。
G.步骤F得到的磁珠溶液(即筛选体系)中加入200μL洗脱缓冲液，在80℃的水浴条件下进行洗脱，使ssDNA从磁珠上洗脱下来，将离心管置于磁性分离架上，收集洗脱液。
H.重复步骤G 4次，收集洗脱液，并将所有洗脱液合并。
I.采用UNIQ-10柱式通用DNA纯化试剂盒，浓缩提纯收集得到的洗脱液中的ssDNA：
在Wash Solution瓶中加入4倍体积的无水乙醇。100μl DNA溶液(步骤H获得的洗脱液)加300μl Binding BufferⅡ,混匀，放置2分钟。全部转移到UNIQ-10柱，柱子放入2.0ml Collection Tube，室温放置2分钟，用台式离心机，10,000rpm室温离心1分钟。取下UNIQ-10柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入500μl WashSolution,10,000rpm室温离心30秒。重复一次。取下UNIQ-10柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中，10,000rpm室温离心30秒，以除去残留的Wash Solution。将柱子放入新的干净1.5ml或2.0ml离心管中，在柱子中央加入100μl Elution Buffer,室温放置2分钟，提高洗脱液的温度至55～80℃有利于提高DNA的洗脱效率。10,000rpm室温离心1分钟。收集管中的液体即为回收的ssDNA片段。
J.通过NanoDrop 2000超微量分光光度计测量回收得到的溶液中ssDNA浓度，并计算筛选效率(回收浓度/投入浓度)。
K.以纯化后的ssDNA溶液作为模板，进行对称PCR扩增，随后取5μL PCR反应液进行3％琼脂糖凝胶电泳，并置于凝胶成像分析***下观察，若出现正确的目的条带，则进入后续的制备单链。
L.采用λ核酸外切酶将ssDNA双链转变为单链，并进行浓度测定，计算出作为下一轮文库所需的量，投入到下一轮的筛选循环中；反应体系及程序如下：
总体积50μL：10X Reaction Buffer 5μL，λ核酸外切酶10U(1μL)，PCR产物44μL，37℃反应30min，80℃反应10min终止反应.
重复步骤C-L，直至筛选得到与奈替米星高亲和力结合的核酸适配体。
步骤C所述的ssDNA文库：为生工合成的单链DNA，其序列为：5’-CTCCTCTGACTGTAACCACG-N40-GCATAGGTA GTCCAGAAGCC-3’。
步骤D所述的结合缓冲溶液，其配置方法为：准确称取NaCl 1.461g、Tris-HCl0.788g、MgCl2·6H2O 0.102g、KCl 0.093g、CaCl2 0.028g于烧杯中，加入100mL超纯水溶解，移液枪吸取Tween 20 50μL加入，随后加入超纯水至220mL，使用NaOH溶液调节pH至7.6补充溶液至250mL。
步骤G所述的洗脱缓冲溶液，其配置方法为：准确秤取Tris-HCl 0.631g、EDTA·2Na·2H2O 0.372g、Urea 21.02g于烧杯中，加入50mL超纯水溶解，移液枪吸取Tween 20 20μL加入，随后加入超纯水至80mL，使用NaOH调节pH至8.0补充溶液至100mL。
步骤K所述的对称PCR反应体系为50μL；上游引物与下游引物的浓度为10μmol/L。所设置的PCR的反应体系为：ssDNA模板2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，2×HiFiTaq PCRStarMix with Dye 25μL以及超纯水19μL；上游引物序列：5'-CTCCTCTGACTGTAACCACG-3'、下游引物序列：5'PO4-GGCTTCTGGACTACCTATGC-3'；
进一步的进行不对称PCR扩增时，PCR循环程序为94℃预变性2min，历经30个循环，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，循环结束后72℃延伸5min。
本实施例中，对称PCR产物琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。本实施例中，SELEX的筛选ssDNA回收效率如图4所示，奈替米星核酸适配体的解离常数Kd值测定如图5所示。
用上述磁珠SELEX技术所得到的核酸适配体，其碱基序列为5’-CTCCTCTGACTGTAACCACGCCCGTCAGTAGTGAGCTGCGTGCCAACATCACGCGGGCCGGCATAGGTAGTCCAGAAGCC-3’。
该核酸适配体具有以下特性：
(1)高亲和力
所得到的适配体具有高亲和力：194.16nM；
(2)高特异性
在奈替米星相似物存在时，该适配体对奈替米星表现出良好的选择性。
本实施例中，奈替米星核酸适配体为一段功能核苷酸序列，该序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，将合成的核酸适配体离心之后加入合成报告中所述超纯水，振荡混匀，配制成500nM的母液。
实施例2
本实施例提供奈替米星检测方法，包括以下步骤：
A、利用实施例1所得奈替米星核酸适配体，配置为100nM的母液。
B、在一定量所述奈替米星核酸适配体溶液中加入SYBR Green I溶液，混匀孵育，使得所述SYBR Green I荧光探针嵌入奈替米星核酸适配体所形成的双链当中，再加入待测奈替米星的水溶液和3-丙磺酸缓冲液，混匀孵育，在激发波长485nm和发射波长535nm处测定荧光强度F；并以其他操作同上但不加待测奈替米星的水溶液作为对照组，测定荧光强度F0；依据荧光强度计算△F＝F0-F的大小来判断待测溶液中奈替米星的含量。
本实施例中，步骤(B)中所述的SYBR Green I配制成浓度为100X的母液；
步骤(B)中所述的3-丙磺酸缓冲液配置方法为：准确称取1.0463g 3-吗啉丙磺酸固体于烧杯中，加入400mL超纯水溶解，使用1M NaOH溶液调节缓冲液pH至7.0，随后转移置100mL容量瓶并定容。置于具塞广口瓶中，常温保存。
进一步的，1M NaOH溶液配置方案为：称取4.000g氢氧化钠固体于烧杯中，加入超纯水溶解，转移置100mL容量瓶并定容，即可得到1M氢氧化钠溶液，常温保存。
本实施例中，具体检测奈替米星的方法，还包括以下步骤：
(1)首先移液枪吸取将100μL核酸适配体溶液(100nM)于1.5mL离心管中，加入待检测的含奈替米星溶液100μL，使奈替米星在体系中的终浓度为在200nM以下，吸打混匀，随后加入3-丙磺酸缓冲液(pH＝7)295μL，置于25℃恒温孵育器，反应30min。之后，加入5μL 100X的SYBR Green I溶液，吸打混匀，25℃恒温孵育8min。在激发波长485nm和发射波长535nm处测定荧光强度F；并以其他操作同上但不加待测奈替米星的水溶液作为对照组，测定荧光强度F0；依据荧光强度计算△F＝F0-F的大小来判断待测溶液中奈替米星的含量。
(2)根据计算所得的ΔF值，查标准曲线，可以求得样品中奈替米星含量。
荧光的衰减△F与奈替米星的含量在一定浓度下成正比。
实施例3
基于实施例2的方法，本实施例优化体系缓冲液种类
设置存在1μM奈替米星的试验组(F)和不存在奈替米星的空白组(F0)，在1.5mL离心管中加入20nM的氧氟沙星核酸适配体溶液，分别选择10mM pH 7.0的MOPS缓冲液、10mMpH 7.4的PBS缓冲液、50mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液和超纯水ddH2O作为缓冲体系其体系都为常规制备，补足体系体积并恒温孵育反应30分钟，之后加入浓度级为1x的SYBR GreenI荧光染料，继续孵育10分钟，取样于96孔微量黑色酶标板中用Infinite M200 Pro酶标仪测定荧光强度，获得F和F0并计算得到ΔF，重复三次试验后算得的荧光强度的差值ΔF的平均值为纵坐标，缓冲体系缓冲液名称为横坐标作图，选择最大ΔF值处对应的缓冲液(MOPS)作为本反应体系的缓冲液。如图6所示。
实施例4
基于实施例2的方法，本实施例优化体系SYBR Green I荧光染料与适配体作用时间
在1.5mL离心管中加入终浓度为20nM的核酸适配体溶液，浓度级为1x的SYBRGreen I荧光染料，用3-丙磺酸缓冲液补足体系体积为500μL，恒温25℃孵育，设置孵育时间为2,4,6,8,10,12分钟，立即取样200μL于96孔微量黑色酶标板中用Infinite M200 Pro酶标仪测定荧光强度F，试验重复三次，以得到的荧光强度值F的平均值为纵坐标、反应时间Time 1为横坐标作图，选择使荧光强度值达到稳定最大时的反应时间(8min)为最佳的反应时间Time 1。如图7所示。
实施例5
基于实施例2的方法，本实施例优化体系SYBR Green I荧光染料浓度
对于荧光染料SYBR Green I浓度的优化，首先设置存在1μM奈替米星的试验组(F)和由超纯水代替奈替米星的空白组(F0)，在1.5mL离心管中分别加入20nM的奈替米星核酸适配体溶液，以最优缓冲液(MOPS缓冲液)补足体系体积并恒温孵育30分钟，之后加入1,2,3,4,5,10μL的浓度级为100x的SYBR Green I荧光染料，使其的终浓度级分别为0.2x,0.4x,0.6x,0.8x,1x,2x，并继续孵育8分钟，取样于96孔微量黑色酶标板中用Infinite M200 Pro酶标仪测定荧光强度，获得F和F0并计算得到ΔF，重复三次试验后算得的荧光强度的差值ΔF的平均值为纵坐标，荧光染料SYBR Green I的浓度为横坐标作图，选择最大ΔF值处对应的浓度级(0.8x)作为荧光染料SYBR Green I的最优浓度。如图8所示。
实施例6
基于实施例2的方法，本实施例优化体系奈替米星核酸适配体浓度
对于奈替米星核酸适配体溶液浓度的优化，同样首先设置存在1μM奈替米星的试验组(F)和由超纯水代替奈替米星的空白组(F0)，在1.5mL离心管中分别加入500nM的氧氟沙星核酸适配体溶液0,5,10,15,20,25,30,35,50μL，使其终浓度分别达到0,5,10,15,20,25,30,35,50nM，以最优缓冲液(MOPS缓冲液)补足体系体积并恒温孵育30分钟，之后加入最优浓度级的SYBR Green I荧光染料，并继续孵育8分钟，取样于96孔微量黑色酶标板中用Infinite M200 Pro酶标仪测定荧光强度，获得F和F0并计算得到ΔF，重复三次后算得的荧光强度的差值ΔF的平均值为纵坐标，核酸适配体溶液的浓度为横坐标作图，选择最大ΔF值处对应的浓度值(20nM)作为氧氟沙星核酸适配体溶液的最优浓度。如图9所示。
实施例7
本实施例提供一种利用SYBR Green I荧光法检测奈替米星的方法，具体步骤如下：
(1)首先在1.5mL离心管中，将20nM适配体溶液和浓度分别为0,5,10,20,40,80,120,160,200,400,600,800,1000,2000nM的奈替米星与一定量的pH＝7的MOPS缓冲液混合震荡，25℃反应孵育30分钟。然后，加入0.8X的SYBR Green I荧光染料，并继续孵育8分钟，取样于96孔微量黑色酶标板中用Infinite M200 Pro酶标仪测定荧光强度，获得F和F0并计算得到ΔF。
(2)以不同浓度奈替米星与对应增强的ΔF作图，绘制标准曲线。如图10所示。
(3)制备样品检测体系：取100μL待测样品，加入到步骤(1)方法制备的检测体系离心管中替代步骤(1)中的奈替米星溶液。按上述步骤处理后测定ΔF。
(4)根据计算所得的ΔF值，查标准曲线，可以求得样品中奈替米星含量。
(5)验证：用本发明方法测定含奈替米星浓度分别为5nmol/L、120nmol/L、和200nmol/L的水样(自来水，湖水)各一份，得到的平均回收率范围为97％-111％，从而证明了本方法的可靠性。如表1，表2所示。
采用本发明的方法测定水样中奈替米星的浓度范围为1.95-200nmol/L，线性拟合直线方程为Y＝23.947X-79.677，最低检测限为1.95nM。线性方程中X代表检测样本中奈替米星的浓度(nM)，Y代表样本ΔF比值，最低检测限为1.95nmol/L。
表1超纯水样中的加标回收
Figure GDA0003677772740000161
表2自来水水样中的加标回收
Figure GDA0003677772740000162
Figure GDA0003677772740000171
实施例8
本实施例提供奈替米星的特异性实验
于体系特异性的研究，本试验除了使用各种不同类别的干扰物和一个含奈替米星所组成的混合物来代替奈替米星；设置空白组，用超纯水代替各种物质。在优化的检测***中，将1μM奈替米星或其他不同的干扰物添加到***中，首先与20nM氧氟沙星适配体和适量MOPS缓冲液震荡混匀，孵育30分钟，加入优化浓度级的SYBR Green I荧光染料，反应8分钟，用96孔微量黑色酶标板在Infinite M200 Pro酶标仪中测定荧光强度，获得F和F0并计算得到ΔF。以重复三次后得到的荧光强度差值ΔF的平均值为纵坐标，各种物质名称为横坐标作图，通过对比观察ΔF的大小，判断该检测体系的特异性。如图11所示。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 奈替米星核酸适配体及筛选和在奈替米星检测上的应用
<130> KAG45940
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcctctgac tgtaaccacg cccgtcagta gtgagctgcg tgccaacatc acgcgggccg 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcctctgac tgtaaccacg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcttctgga ctacctatgc 20

Claims (5)

1.一种奈替米星核酸适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种根据权利要求1所述的奈替米星核酸适配体的应用，其特征在于，所述奈替米星核酸适配体在制备奈替米星检测试剂、奈替米星检测试剂盒或奈替米星检测生物传感器上的应用；或
所述奈替米星核酸适配体在制备奈替米星捕获、分离或纯化试剂上的应用；或
所述奈替米星核酸适配体在开发奈替米星检测方法上的应用。
3.一种奈替米星检测用生物传感器，其特征在于，所述生物传感器以奈替米星核酸适配体为生物识别元件，所述奈替米星核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述生物传感器为基于SYBR Green I的荧光法检测奈替米星的生物传感器。
4.一种奈替米星检测方法，其特征在于，基于权利要求1所述奈替米星核酸适配体进行，包括以下步骤：
在奈替米星核酸适配体溶液中加入SYBR Green I溶液，混匀后进行第一次孵育，使得所述SYBR Green I荧光探针嵌入奈替米星核酸适配体所形成的双链当中；
在第一次孵育后的混合液中加入待测样品和缓冲液，混合后进行第二次孵育，对第二次孵育后的混合液进行荧光强度测定，并计算得到待测样品中萘替米星的含量。
5.根据权利要求4所述的奈替米星检测方法，其特征在于，所述SYBR Green I溶液的终浓度为0.8X，奈替米星核酸适配体溶液的终浓度为20 nM；
所述缓冲液pH值为7.0，采用MOPS 缓冲液；
第一次孵育的温度为25℃、孵育时间为30min；第二次孵育的温度为25℃、孵育时间为8min。
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