CN108318692A - 基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素 - Google Patents

基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素 Download PDF

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Abstract

基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素，属于分析化学技术领域；其特征在于利用核酸适配体的特异性识别和荧光共振能量转移技术的优势来检测卡那霉素的残留量。包括以下步骤：核酸适配体结构开关的组装；利用温度变化验证结构开关原理的形成；通过测定荧光光谱图观察卡那霉素和核酸适配体结构开团体系的反应；建立基于核酸适配体的结构开关检测卡那霉素；通过测定荧光光谱图测定所建立的核酸适配体结构开关对卡那霉素的选择性；运用所建立的核酸适配体的结构开关测定实际样品中的卡那霉素。本方法提供了一种对卡那霉素有高选择性，同时又简单、快速、灵敏的检测方法，具有良好的实用价值，便于推广。

Description

基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素
技术领域
基于核酸适配体的特异性识别和荧光共振能量转移(FRET)检测卡那霉素的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
卡那霉素是一种提取于链霉菌、小单胞菌培养液或以天然品为原料半合成提取而得到的碱性氨基糖苷类抗生素。卡那霉素溶于水，对革兰氏阴性杆菌具有较强作用，同时价格便宜、可在临床上作为一种重要的抗感染药物。在目前，卡那霉素也是我国农业、畜牧业以及水产业中常用的兽药之一。由于动物源性食品中的卡那霉素可在人体内蓄积，对人体造成一定程度的伤害，因此我国对卡那霉素的残留问题也越来越关注。其中卡那霉素最重要的不良反应是会影响耳蜗神经，从而诱发耳毒症，造成听力损伤。此外，卡那霉素也对肾脏有着一定损伤，导致肾功能衰竭。为保障人类健康，世界各国对牛奶中的卡那霉素残留的最大允许残留量(MRL)作出了规定要要求，其中我国规定牛奶中卡那霉素的MRL值为200μg/kg。
目前，国内外关于卡那霉素的检测方法主要有：理化检测法、微生物检测法、免疫检测法等。其中理化检测法主要包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等，该方法虽灵敏度较高，但检测程序复杂且仪器昂贵，不易推广。微生物检测法操作上简单，经济实用，但专一性差并且只能对有生物活性的物质进行检测，也具有一定的局限性。因此十分有必要进一步研究一种灵敏简便、易于操作、选择性高且适用于实际样品快速检测的方法。
发明内容
本发明的目的是利用核酸适配体的特异性识别和荧光共振能量转移技术的优势从而提供一种检测卡那霉素的方法，达到快速、简单、灵敏的检测卡那霉素的残留量。
技术问题：基于核酸适体的特异性识别和荧光共振能量转移，构建核酸适配体结构开关检测卡那霉素的残留方法基于以下原理：
5’端标记了荧光基团(FAM)的核酸适配体和3’端标记了猝灭基团(Dabcyl)的互补链，在自然的状态下通过碱基互补配对原则进行互补配对，形成了双链的结构开关体系。此时，荧光基团和猝灭基团相互靠近，发生了荧光共振能量转移致使荧光信号降低。当向该体系中加入卡那霉素后，卡那霉素和适配体发生特异性结合，促使结构开关打开，互补链被释放出来，此时荧光强度升高。本研究所建立的基于核酸适配体结构开关的方法，根据这种荧光强度的变化，来实现对卡那霉素残留的灵敏检测。
本发明的技术方案：
包括以下步骤：核酸适配体结构开关的组装；利用温度变化验证结构开关原理的形成；通过测定荧光光谱图观察卡那霉素和核酸适配体结构开团体系的反应；建立基于核酸适配体的结构开关检测卡那霉素；通过测定荧光光谱图测定所建立的核酸适配体结构开关对卡那霉素的选择性；运用所建立的核酸适配体的结构开关测定实际样品中的卡那霉素。
(1)核酸适配体结构开关的组装
将合成好的标记荧光基团的核酸适配体和标记猝灭基团的互补链分别用纯净水稀释至0.5μM和1μM。在95℃水浴锅中水浴加热10min后取出，置于室温下冷却一段时间，待用。取2个1.5mL离心管，编号为a,b，分别依次加入，a管(0.5μM核酸适配体50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液450μL)，b管(0.5μM核酸适配体50μL，1μM互补链50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液400μL)，在490nm的激发波长条件下测定荧光吸收光谱。利用RF-5301荧光分光光度仪测定信号强度，信号值分别为F0和F1。
(2)利用温度变化验证结构开关原理的形成
取4个1.5mL的离心管，编号a～d，每管都加入0.5μM核酸适配体50μL，1μM互补链50μL，PH8.0Tris-HCl 缓冲溶液400μL，置于恒温混匀仪中孵育一段时间，温度分别设定为37℃、45℃、50℃、55℃。在490nm 的激发波长下测定荧光信号值。
(3)通过测定荧光光谱图观察卡那霉素和核酸适配体结构开关体系的反应
取3个1.5mL的离心管，编号为a,b,c，分别依次加入，a管(0.5μM核酸适配体50μL，PH8.0Tris-HCl 缓冲溶液450μL)，b管(0.5μM核酸适配体50μL，1μM互补链50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液400μL)， c管(0.5μM核酸适配体50μL，1μM互补链50μL，5μM卡那霉素50mL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液350μL)，在490nm的激发波长条件下测定荧光吸收光谱。
(4)建立基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素
向含有0.5μM核酸适配体50μL，1μM互补链50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液350μL的混合体系中，分别加入不同浓度的卡那霉素标准溶液(终浓度分别为100,200,300,400,500,600,700nM)，室温条件下反应 20min后，测定该体系的荧光强度，其荧光信号值将随着卡那霉素浓度的不同而发生变化，根据F2-F1与卡那霉素的浓度建立标准曲线(F2和F1分别为加入卡那霉素之后和之前的荧光信号强度)。本发明中，卡那霉素的检出限为12.01nM，线性范围为100-700nM。
(5)选择性实验的测定
取6个1.5mL的离心管，编号为a～f，分别依次加入，a～f管(0.5μM核酸适配体50μL，1μM互补链 50μL，5μM待测物质50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液350μL，待测物质分别为链霉素、氯霉素、环丙沙星、四环素、土霉素和卡那霉素)，在490nm的激发波长条件下测定荧光吸收光谱。
(6)实际样品的检测：取牛奶进行实际样品的检测
吸取4mL的牛奶加入到15mL的离心管中，加入6mL的三重蒸馏水进行稀释后加入2mL 10％的三氯乙酸和2mL氯仿，涡旋混合1min后，在温度为20℃的条件下超声15min；然后，将上述溶液以13000转 /分钟的转速离心10min，吸取上清液转移至另一个15mL的离心管中，再以10000r/min的转速离心10min，吸取上清液备用。分析中，将提取的上清液稀释20倍，进行实验。如权利要求4所述的方法，加入不同浓度的卡那霉素溶液进行测定。
本发明的有益效果：
本发明组装了核酸适配体结构开关，并建立了一个简单、快速、灵敏的基于荧光共振能量转移原理的方法，能够快速检测卡那霉素，为今后的监管提供了方便。
附图说明
图1不同体系的荧光光谱图：a,标记荧光基团的核酸适配体；b,核酸适配体-互补链形成的结构开关体系； c,结构开关体系-卡那霉素；核酸适配体0.5μM；互补链1μM；卡那霉素5μM
图2利用温度变化验证结构开关原理的形成的荧光图：反应温度分别为37℃,45℃,50℃,55℃；核酸适配体 0.5μM 5；互补链1μM
图3递增浓度的卡那霉素存在时体系中的荧光发射图谱，插图为相应的线性标准曲线：卡那霉素浓度为 100nM,200nM,300nM,400nM,500nM,600nM,700nM；核酸适配体0.5μM；互补链1μM
图4核酸适配体结构开关体系中荧光强度值对不同抗生素的信号响应：a,链霉素；b,氯霉素；c,环丙沙星；d, 四环素；e,土霉素；f,卡那霉素；被测抗生素,5μM；核酸适配体,0.5μM；互补链,1μM
图5核酸适配体结构开关体系中在含有卡那霉素牛奶基质中的荧光发射图谱，插图为相应的线性工作曲线：卡那霉素浓度为100nM,200nM,300nM,400nM,600nM；核酸适配体0.5μM；互补链1μM
具体实施方式
核酸适配体结构开关的组装
材料/试剂：卡那霉素适配体和互补链由生工生物(上海)试剂公司合成；Tris、HCl均购买于生工生物(上海)试剂公司
方法：将合成好的标记荧光基团的核酸适配体和标记猝灭基团的互补链分别用纯净水稀释至0.5μM和 1μM。在95℃水浴锅中水浴加热10min后取出，置于室温下冷却一段时间，待用。取2个1.5mL离心管，编号为a,b，分别依次加入，a管(0.5μM核酸适配体50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液450μL)，b管(0.5μM 核酸适配体50μL，1μM互补链50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液400μL)，在490nm的激发波长条件下测定荧光信号值。
结果：单独的标记了荧光基团的适配体具有较强的荧光，当该适配体与标记了猝灭基团的互补链结合形成结构开关时，荧光信号有明显的降低。
由于实验所用的体系受到卡那霉素适配体与互补链浓度比例的影响，所以需要研究浓度比对反应体系的影响。
材料/试剂：卡那霉素核酸适配体和互补链均由生工生物(上海)试剂公司合成
方法：用纯净水稀释卡那霉素适配体的浓度固定为0.5μM，按照适配体与互补链比例为1:1、1:2、1:3、1:4 的要求，将互补链浓度分别稀释到0.5μM、1μM、1.5μM、2μM。放置95℃水浴锅中加热10min后拿出，冷却至室温备用。取4个1.5mL的离心管，编号为a～d，分别依次加入a管(0.5μM核酸适配体50μL，0.5μM 互补链50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液400μL)，b管(0.5μM核酸适配体50μL，1μM互补链50μL，PH8.0 Tris-HCl缓冲溶液400μL)，c管(0.5μM核酸适配体50μL，1.5μM互补链50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液 400μL)，d管(0.5μM核酸适配体50μL，2μM互补链50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液400μL)，反应一段时间后，测定4个管的荧光信号强度。
结果：实验发现，核酸适配体和互补链浓度比例为1:2时为最优浓度比。
除浓度比例外，卡那霉素和结构开关的反应时间同样会对实验体系产生一定的影响，因此需要研究二者反应时间的作用效果。
材料/试剂：核酸适配体和互补链均由生工生物(上海)试剂公司合成；卡那霉素购买于生工生物(上海) 试剂公司
方法：取6个1.5mL的离心管，编号a～f，每管都加入0.5μM核酸适配体50μL，1μM互补链50μL，5μM 卡那霉素50μM，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液350μL，分别依次涡旋反应5min、10min、15min、20min、25min、 30min，并记录其荧光曲线。
结果：当卡那霉素和结构开关反应时间为20min时，荧光强度恢复最高，确定为最佳反应时间。
建立基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素
材料/试剂：适配体和卡那霉素均购于生工生物试剂公司
方法：向含有0.5μM核酸适配体50μL，1μM互补链50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液350μL的混合体系中，分别加入不同浓度的卡那霉素标准溶液(终浓度分别为100,200,300,400,500,600,700nM)，室温条件下反应 20min后，测定该体系的荧光强度。
结果：根据F2-F1与卡那霉素的浓度建立标准曲线(F2和F1分别为加入卡那霉素之后和之前的荧光信号强度)。本发明中，卡那霉素的检出限为12.01nM，线性范围为100-700nM。
方法的选择性测定
试剂：核酸适配体和互补链均由生工生物有限公司合成；卡那霉素，氯霉素，链霉素，四环素，土霉素均购于生工生物有限公司；环丙沙星购于美国西格玛奥德里奇公司(美国圣路易斯)。
方法：选择实际样品中易出现残留的与卡那霉素相似的抗生素进行了选择性实验，分别为链霉素、氯霉素、四环素、土霉素、环丙沙星。首先，分别将卡那霉素、链霉素、氯霉素、四环素、土霉素、环丙沙星的标准溶液稀释到5μM；其次，将上述5μM抗生素溶液各吸取50μL分别加入到含有0.5μM核酸适配体50μL， 1μM互补链50μL，PH8.0Tris-HCl缓冲溶液350μL的体系中，涡旋混合20min后测定荧光值。
结果：只有加入卡那霉素的体系荧光值恢复较高，说明基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素的体系具有良好的选择性。
实际样品的检测：取牛奶进行实际样品的检测
试剂：适配体和卡那霉素均购买于生工生物试剂公司，牛奶购买于超市。
方法：吸取4mL的牛奶加入到15mL的离心管中，加入6mL的三重蒸馏水进行稀释后加入2mL 10％的三氯乙酸和2mL氯仿，涡旋混合1min后，在温度为20℃的条件下超声15min；然后，将上述溶液以13000 转/分钟的转速离心10min，吸取上清液转移至另一个15mL的离心管中，再以10000r/min的转速离心10 min，吸取上清液备用。分析中，将提取的上清液稀释20倍，等分为5份，如权利要求5所述的方法，加入不同浓度的卡那霉素标准溶液进行测定(终浓度分别为：100,200,300,400,600,nM)。
结果：根据F2-F1与卡那霉素的浓度建立工作曲线，卡那霉素的检出限为13.07nM，线性范围为100-600nM。本实验方法检测卡那霉素的加标回收试验结果见下表。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素
<141> 2018-01-15
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> n=FAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 1
ntgggggttg aggctaagcc ga 22
<210> 2
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (9)
<223> n=Dabcyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 2
aacccccan 9

Claims (4)

1.基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素，其特征是利用核酸适配体的特异性识别和荧光共振能量转移技术的优势来检测卡那霉素的残留量，包括以下步骤：建立基于核酸适配体的结构开关检测卡那霉素；通过测定荧光光谱图测定所建立的核酸适配体结构开关对卡那霉素的选择性；运用所建立的核酸适配体的结构开关测定实际样品中的卡那霉素。
2.如权利要求1所述的基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素，其中基于核酸适配体的结构开关检测卡那霉素的步骤如下：向含有0.5μM核酸适配体50μL，1μM互补链50μL，PH8.0 Tris-HCl缓冲溶液350μL的混合体系中，分别加入不同浓度的卡那霉素标准溶液，室温条件下反应20min后，测定该体系的荧光强度，其荧光信号值将随着卡那霉素浓度的不同而发生变化，根据F2-F1与卡那霉素的浓度建立标准曲线，卡那霉素的检出限为12.01nM，线性范围为100-700nM。
3.如权利要求1所述的基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素，其中通过测定荧光光谱图测定所建立的核酸适配体结构开关对卡那霉素的选择性的步骤如下：选择实际样品中易出现残留的与卡那霉素相似的抗生素进行了选择性实验，分别为链霉素、氯霉素、四环素、土霉素、环丙沙星；首先，分别将卡那霉素、链霉素、氯霉素、四环素、土霉素、环丙沙星的标准溶液稀释到5μM；其次，将上述5μM抗生素溶液各吸取50μL分别加入到含有0.5μM核酸适配体50μL，1μM互补链50μL，PH8.0 Tris-HCl缓冲溶液350μL的体系中，涡旋混合20min后测定荧光值，结果显示只有加入卡那霉素的体系出现荧光恢复的情况，说明该结构开关体系对于实际样品中卡那霉素的检测具有较好的选择性。
4.如权利要求1所述的基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素，其中运用所建立的核酸适配体的结构开关测定实际样品中的卡那霉素的步骤如下：取4mL的牛奶加入到15mL的离心管中，加入6mL的三重蒸馏水进行稀释后加入2mL10％的三氯乙酸和2mL氯仿，涡旋混合1min后，在温度为20℃的条件下超声15min；然后，将上述溶液以13000转/分钟的转速离心10min，吸取上清液转移至另一个15mL的离心管中，再以10000r/min的转速离心10min，吸取上清液，稀释20倍后备用；然后，加入不同浓度的卡那霉素标准溶液，按照权利要求2所述的方法，进行测定；根据F2-F1与卡那霉素的浓度建立工作曲线，卡那霉素的检出限为13.07nM，线性范围为100-600nM。
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