CN113072605B - 具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷b及制备方法 - Google Patents

具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷b及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B及制备方法，属于生物制品的提取制备技术领域。所述玫烟色苷B为浅黄棕色粉末，是一个新型化合物，尚无文献报道。本发明化合物可通过培养玫烟色虫草菌，然后提取分离得到。玫烟色苷B纯品为浅黄棕色粉末，在200 mg/mL的浓度时，对大肠杆菌的抑菌圈为17.3 mm，对白色链珠菌的抑菌圈为19.8 mm。对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC50）为：345μg/mL。对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：106μg/m。该化合物具有制备抗细菌和抗真菌药物潜力，以及具有制备抗氧化、美白和抗衰老保健品的潜力。

Description

具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B及制 备方法
技术领域
本发明属于生物制品的提取制备技术领域，涉及具有抗氧化、抗菌和酪氨酸酶抑制活性的玫烟色苷B（fumosoroseanosideB）的提取、纯化、结构鉴定和活性测定。
背景技术
玫烟色苷B是从一株玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）培养物中分离制备得到的新型糖苷类物质，具有抗细菌、抗真菌、清除自由基和酪氨酸酶抑制等活性。
玫烟色虫草的无性型存在于土壤中和寄生在昆虫上，以前被称为玫烟色棒束孢（Isariafumosorosea）或玫烟色拟青霉（Paecilomycesfumosorosea）。该菌寄主广泛，易感染蚜虫、粉虱、甲虫、白蚁、黄蜂以及各种鳞翅目害虫，因此玫烟色虫草菌是一种重要的生物防治真菌。该类真菌由于长期与昆虫协同进化，能产生大量新型生物活性化合物，然而，目前对该类真菌代谢物的研究仍较少，尚未见有关其玫烟色苷类化合物的制备鉴定和生物活性研究报道。
近年来，由于抗生素的滥用，导致抗药细菌越来越多，亟需研发新型抗细菌物质；同时，由于环境污染以及世界人口老龄化等因素，目前免疫低下人群逐年增多，一些条件致病菌，特别是真菌感染病例也呈逐年上升趋势，因此亟需开发开发新型抗细菌和抗真菌活性物质。
最新的研究表明，人类的衰老及许多疾病都与自由基损伤有关。具有清除自由基活性的物质能与自由基反应并使之还原成非自由基化合物，可清除机体代谢过程中产生的过多的自由基，是一种可增进人体健康的重要活性物质。自由基清除剂在非生命体系中有抗氧化作用，能够有效地阻止物质的氧化败坏，对于延长物品的保质期有着重要作用，被广泛用于食品、药品、日用化学品等中，因此有必要研究开发具有清除自由基活性的天然产物。
发明内容
本发明的目的是提供具有抗细菌、抗真菌、清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B及制备方法。
具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B为浅黄棕色粉末，结构式如下：
Figure 640086DEST_PATH_IMAGE001
生物活性测定显示，将玫烟色苷B配制成浓度200 mg/mL的水溶液时，对大肠杆菌的抑菌圈为11.5 mm，对白色链珠菌的抑菌圈为13.9 mm；对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC50）为：982 μg/mL。对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：436 μg/mL。
具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B的制备操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
将玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）经过斜面菌种培养、二级固体种子培养和三级固体扩大培养，得到固体培养物；
（2）制备玫烟色苷B
用提取剂提取固体培养物中的有效成分，采用硅胶柱色谱和反相色谱方法纯化，得到浅黄棕色粉末状的玫烟色苷B。
所述制备方法的具体操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
（1.1）斜面种子培养
将玫烟色虫草菌的水液菌种接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，每个斜面接种10～30μL，于温度20～30℃、培养5～10d，收集孢子得到一级菌种；
（1.2）二级液体种子培养
将一级菌种用水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每平皿200～400μL接种至PDA平板上（PDA板的规格为9×100mm），在20～30℃、恒温培养6～12天，收集孢子得二级菌种；
（1.3）三级固体扩大培养
将二级菌种用水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每平方厘米平板表面涂布1.5～5 μL孢悬液接种至PDA平板上，在20～30℃、恒温培养6～15天，收集培养物，得到固体培养物；
（2）制备玫烟色苷B
（2.1）固体培养物中有效成分的提取
将固体培养物在−50～130℃干燥，按重量体积比1g：0.5～5 mL在固体培养物中加入提取剂，40KHz超声提取20～200分钟；经0.20～2.5μm滤膜过滤或4000-15000转/分钟条件下离心，得滤液或离心上清；滤液或离心上清在真空度-0.1～-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物；
（2.2）硅胶柱色谱初步分离纯化
按重量比1：1～10，将有效成分提取物与规格为100-200目的硅胶进行拌样；用规格为200-300目的硅胶填充柱子，利用湿法装柱，干法上样；用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，当乙酸乙酯浓度由0逐渐升到100%，总洗脱体积为3～8个柱体积；接着用乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，当甲醇浓度由0逐渐升到50%，总洗脱体积为3～8个柱体积；收集乙酸乙酯：甲醇为50～30：5～25的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，得到初步纯化的有效成分；
（2.3）精制
采用反相高效液相色谱进行精制；色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为甲醇；洗脱条件：0到30 min用10～95% 流动相B洗脱；进样体积30～300μL；柱温10～40℃、流速2～50 mL/min、检测波长为250～270 nm、色谱柱为反相C-18柱；收集第二个主峰对应的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，在低于170℃条件下干燥，得到浅黄棕色粉末状的玫烟色苷B。
进一步地，步骤（1）中，PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，其配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
进一步地，步骤（2）中，提取剂为按体积比由甲醇：乙酸乙酯为0～5：5～0配制成。
本发明的分析研究说明如下：
1、筛选研究发现玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）提取物具有较强的抗细菌、抗真菌、清除自由基和抑制酪氨酸酶活性，在200 mg/mL的浓度时，对大肠杆菌的抑菌圈为11.5 mm，对白色链珠菌的抑菌圈为13.9 mm。对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC50）为：982 μg/mL。对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：436 μg/mL。
由于提取物中有效成分含量较低，因此需要进行有效成分的进一步提取和分离纯化。
2、用硅胶柱色谱和反相高效液相色谱的方法对提取物进行了进一步分离纯化，得到玫烟色苷B纯品，其生物活性如下：在200 mg/mL的浓度时，对大肠杆菌的抑菌圈为17.3mm，对白色链珠菌的抑菌圈为19.8 mm。对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC50）为：345 μg/mL。对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：106 μg/mL。
3、玫烟色苷B的化学结构鉴定
高分辨液质联用分析显示玫烟色苷B的离子质荷比为509.1445[M＋H]＋，对应的分子式为C24H28O12。
核磁共振分析数据见下表：
Figure 307827DEST_PATH_IMAGE002
综合液质联用分析和核磁共振分析得出分离纯化出的活性化合物是一新化合物，申请者将其命名为玫烟色苷B（fumosoroseanosideB），
Figure 958731DEST_PATH_IMAGE003
其结构式见上式。
本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：
1、本发明方法制备的玫烟色苷B具有较强的抗细菌、抗真菌、清除自由基和抑制酪氨酸酶活性，可作为药物先导化合物进行衍生化改造，创造出活性更多更强的化合物。
2、本发明首次发现玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）具有代谢上述活性物质的功能。在此发明基础上可望进一步克隆出相关基因，构建高产量菌株。
3、本发明的玫烟色苷B可用于制备抗细菌和抗真菌的抗菌剂、自由基清除剂和酪氨酸酶抑制剂。自由基清除剂往往有抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用，酪氨酸酶抑制剂有美白作用，细菌和真菌抗菌剂可治疗细菌和真菌感染。
4、本发明由于采取微生物发酵生产，不受自然环境和资源影响，易实现工业化、自动化、连续化生产，不破坏自然环境和自然资源。
5、按本发明工艺方法生产的产品成本低，工艺简便、工艺稳定、易调控、成功率高。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
实施例1
具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B的制备操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
1.1培养一级菌种
将保存的玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）水液菌种接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，每个斜面接种10μL，于温度20℃、培养5d，收集孢子得到一级菌种；
PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，其配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
1.2培养二级菌种
将一级菌种用水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每平皿200μL接种至事先配好的PDA平板上（PDA板的规格为9×100mm），于20℃、恒温培养6天，收集孢子，得二级菌种。PDA培养基组成同步骤（1）。
1.3三级固体扩大培养
将二级菌种用水配成浓度105个孢子/mL的孢悬液，按每平方厘米平板表面涂布1.5 μL孢悬液接种至事先配好的PDA平板上，于20℃、恒温培养6天，收集培养物，得到固体培养物。PDA培养基组成同步骤（1）。
（2）制备玫烟色苷B
2.1固体培养物中有效成分的提取
将固体培养物在−50℃干燥，按重量体积比1g：0.5mL在固体培养物中加入提取剂乙酸乙酯，40KHz超声提取20分钟；经0.20μm滤膜过滤，得滤液；滤液在真空度-0.1MP、温度10℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
2.2硅胶柱色谱初步分离纯化
按重量比1：1，将有效成分提取物与规格为100-200目的硅胶进行拌样；用规格为200-300目的硅胶填充柱子，利用湿法装柱，干法上样，然后用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，使乙酸乙酯浓度由0逐渐升到100%，总洗脱体积为3个柱体积；接着用乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，使甲醇浓度由0逐渐升到50%，总洗脱体积为3个柱体积；收集乙酸乙酯：甲醇为50：5（体积比）的洗脱液，在真空度-0.1MP、温度10℃条件下减压蒸去提取剂，得到初步纯化的有效成分。
2.3精制
采用反相高效液相色谱进行精制。色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为色谱甲醇；洗脱条件：0到30 min用10% 流动相B洗脱；进样体积30μL、柱温10℃、流速2mL/min、检测波长为250 nm、色谱柱为反相C-18柱。收集第二个主峰对应的洗脱液，在真空度-0.1 MP、温度10℃条件下减压蒸去提取剂，在低于170℃条件下干燥，得到浅黄棕色粉末状的玫烟色苷B，其结构式如下：
Figure 624199DEST_PATH_IMAGE003
活性测定结果显示：玫烟色苷B在200 mg/mL的浓度时，对大肠杆菌的抑菌圈为17.3 mm，对白色链珠菌的抑菌圈为19.8 mm。对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC50）为：345 μg/mL。对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：106 μg/mL。
实施例2
具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B的制备操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
1.1一级菌种培养
将保存的玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）水液菌种接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，每个斜面接种30μL，于温度30℃、培养10d，收集孢子得到一级菌种；
PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，其配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
1.2二级菌种培养
将一级菌种用水配成浓度107个孢子/mL的孢悬液，按每平皿400μL接种至事先配好的PDA平板上（PDA板的规格为9×100mm），在30℃、恒温培养12天，收集孢子，得到二级菌种。PDA培养基组成同步骤（1.1）。
1.3三级固体扩大培养
将二级菌种用水配成浓度107个孢子/mL的孢悬液，按每平方厘米平板表面涂布5μL孢悬液接种至事先配好的PDA平板上，在30℃、恒温培养15天，收集培养物，得到固体培养物。PDA培养基组成同步骤（1.1）。
（2）制备玫烟色苷B
2.1固体培养物中有效成分的提取
将固体培养物在130℃干燥，按重量体积比1g：5 mL在固体培养物中加入提取剂甲醇，40KHz超声提取200分钟，然后经15000转/分钟条件下离心，得离心上清；离心上清在真空度-0.08 MP、温度80℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
2.2硅胶柱色谱初步分离纯化
按重量比1：10，将有效成分提取物与规格为100-200目的硅胶进行拌样；然后用规格为200-300目的硅胶填充柱子，利用湿法装柱，干法上样；然后用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，使乙酸乙酯浓度由0逐渐升到100%，总洗脱体积为8个柱体积；接着用乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，使甲醇浓度由0逐渐升到50%，总洗脱体积为8个柱体积；收集乙酸乙酯：甲醇为30：25的洗脱液，在真空度-0.08 MP、温度80℃条件下减压蒸去提取剂，得到初步纯化的有效成分。
2.3精制
采用反相高效液相色谱进行精制。色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为色谱甲醇；洗脱条件：0到30 min用95%流动相 B洗脱；进样体积300μL、柱温40℃、流速50 mL/min、检测波长为260 nm、色谱柱为反相C-18柱。收集第二个主峰对应的洗脱液，在真空度-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，在低于170℃条件下干燥，得到浅黄棕色粉末状的玫烟色苷B，其结构式如下：
Figure 644108DEST_PATH_IMAGE004
活性测定结果显示：玫烟色苷B在200 mg/mL的浓度时，对大肠杆菌的抑菌圈为17.3 mm，对白色链珠菌的抑菌圈为19.8 mm。对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC50）为：345 μg/mL。对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：106 μg/m。
实施例3
具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B的制备操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
1.1一级菌种培养
将保存的玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）水液菌种接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，每个斜面接种20μL，于温度25℃、培养8d，收集孢子得到一级菌种；
PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，其配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
1.2二级菌种培养
将一级菌种用水配成浓度106个孢子/mL的孢悬液，按每平皿300μL接种至事先配好的PDA平板上（PDA板的规格为9×100mm），在25℃、恒温培养10天，收集孢子得二级菌种。PDA培养基组成同步骤（1.1）。
1.3三级固体扩大培养
将二级菌种用水配成浓度106个孢子/mL的孢悬液，按每平方厘米平板表面涂布3μL孢悬液接种至事先配好的PDA平板上，在25℃、恒温培养10天，收集培养物得到固体培养物。PDA培养基组成同步骤（1.1）。
（2）制备玫烟色苷B
2.1固体培养物中有效成分的提取
将固体培养物在30℃干燥，按重量体积比1g：3 mL在固体培养物中加入提取剂，提取剂按体积比甲醇：乙酸乙酯为1：1混合制成，40KHz超声提取110分钟；然后经10000转/分钟条件下离心，得到离心上清。离心上清在真空度-0.09MP、温度40℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
2.2硅胶柱色谱初步分离纯化
按重量比1：6，将有效成分提取物与规格为100-200目的硅胶进行拌样；然后用规格为200-300目的硅胶填充柱子，利用湿法装柱，干法上样；然后用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，使乙酸乙酯浓度由0逐渐升到100%，总洗脱体积为5个柱体积；接着用乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，使甲醇浓度由0逐渐升到50%，总洗脱体积为5个柱体积；收集乙酸乙酯：甲醇为40：15的洗脱液，在真空度-0.09MP、温度45℃条件下减压蒸去提取剂，得到初步纯化的有效成分。
2.3精制
采用反相高效液相色谱进行精制。色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为色谱甲醇；洗脱条件：0到30 min用50% 流动相B洗脱；进样体积200μL、柱温30℃、流速25 mL/min、检测波长为260 nm、色谱柱为反相C-18柱。收集第二个主峰对应的洗脱液，在真空度-0.09MP、温度40℃条件下减压蒸去提取剂，在低于170℃条件下干燥，得到浅黄棕色粉末状的玫烟色苷B，其结构式如下：
Figure 849961DEST_PATH_IMAGE004
活性测定结果显示：玫烟色苷B在200 mg/mL的浓度时，对大肠杆菌的抑菌圈为17.3 mm，对白色链珠菌的抑菌圈为19.8 mm。对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC50）为：345 μg/mL。对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：106 μg/m。

Claims (5)

1.具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B，其特征在于：所述玫烟色苷B为浅黄棕色粉末，结构式如下：
Figure QLYQS_1
。
2. 根据权利要求1所述具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B的制备方法，其特征在于操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
将玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）经过斜面菌种培养、二级固体种子培养和三级固体扩大培养，得到固体培养物；
（2）制备玫烟色苷B
用提取剂提取固体培养物中的有效成分，采用硅胶柱色谱和反相色谱方法纯化，得到浅黄棕色粉末状的玫烟色苷B。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于具体操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
（1.1）斜面种子培养
将玫烟色虫草菌的水液菌种接种于土豆琼脂PDA斜面培养基，每个斜面接种10～30μL，于温度20～30℃、培养5～10d，收集孢子得到一级菌种；
（1.2）二级液体种子培养
将一级菌种用水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每个培养皿200～400μL接种至PDA平板上PDA板的规格为9×100mm，在20～30℃、恒温培养6～12天，收集孢子得二级菌种；
（1.3）三级固体扩大培养
将二级菌种用水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每平方厘米平板表面涂布1.5～5 μL孢悬液接种至PDA平板上，在20～30℃、恒温培养6～15天，收集培养物，得到固体培养物；
（2）制备玫烟色苷B
（2.1）固体培养物中有效成分的提取
将固体培养物在−50～130℃干燥，按重量体积比1g：0.5～5 mL在固体培养物中加入提取剂，40KHz超声提取20～200分钟；经0.20～2.5μm滤膜过滤或4000-15000转/分钟条件下离心，得滤液或离心上清；滤液或离心上清在真空度-0.1～-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物；
（2.2）硅胶柱色谱初步分离纯化
按重量比1：1～10，将有效成分提取物与规格为100-200目的硅胶进行拌样；用规格为200-300目的硅胶填充柱子，利用湿法装柱，干法上样；用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，当乙酸乙酯浓度由0逐渐升到100%，总洗脱体积为3～8个柱体积；接着用乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，当甲醇浓度由0逐渐升到50%，总洗脱体积为3～8个柱体积；收集乙酸乙酯：甲醇为50～30：5～25的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，得到初步纯化的有效成分；
（2.3）精制
采用反相高效液相色谱进行精制；色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为甲醇；洗脱条件：0到30 min用10～95% 流动相B洗脱；进样体积30～300μL；柱温10～40℃、流速2～50 mL/min、检测波长为250～270 nm、色谱柱为反相C-18柱；收集第二个主峰对应的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，在低于170℃条件下干燥，得到浅黄棕色粉末状的玫烟色苷B。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，其配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，提取剂为按体积比由甲醇：乙酸乙酯为0～5：5～0配制成。
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一株玫烟色虫草对草地贪夜蛾的致病性研究;雷妍圆等;《环境昆虫学报》;第42卷(第1期);第68-75页 *

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