CN111830263A - 一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法。该方法以对绵羊肺炎支原体黏附素基因P113的C端进行克隆表达得到的重组蛋白作为抗原，利用该重组蛋白抗原致敏健康绵羊红细胞，通过对同一批血清的IHA效价筛选其最佳的致敏浓度，最佳反应条件，建立了特异性强、敏感性以及符合率高并且操作简便的绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法。可应用于兽医领域绵羊肺炎支原体的快速检测，为疾病预防、诊断和防控提供有力工具。

Description

一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品检测技术领域，具体地说，涉及一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法。

背景技术

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)是一种重要的引起呼吸道疾病的病原，可导致山羊及绵羊的非典型性肺炎,绵羊肺炎支原体最早于1963年分离得到，此后在其他多个国家和地区相继发现，目前其在全球范围内分布广泛。由绵羊肺炎支原体引起的绵羊支原体肺炎在全球绵羊产业中造成非常大的经济损失。它能够与气管上皮细胞的纤毛结合并引起纤毛功能障碍，导致纤毛清除受损。此外，羊只感染绵羊肺炎支原体后，对其他如多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌以及流感病毒等病原的易感性明显增加。绵羊支原体肺炎在我国流行同样十分广泛，危害十分严重。

要想有效控制绵羊肺炎支原体的感染，需要采取综合性防治措施。其中，特异的诊断技术是综合防控的关键环节之一，对于发现传染源、开展流行病学调查以及动物检疫等都具有重要的作用。血清学诊断技术，对绵羊肺炎支原体的检测一直缺乏有效的血清学技术，国内赵萍等([1]赵萍,储岳峰,高鹏程,等.绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法的建立及应用.福建农林大学学报(自然科学版),2008,37(5):510-513.[2]赵萍，逯忠新，储岳峰，等.绵羊肺炎支原体间接血凝诊断方法的建立,甘肃农业大学学报,2008,43(1):29-32.)虽然有采用全菌抗原建立ELISA方法及HA技术的报道，但绵羊肺炎支原体全菌抗原与其他感染动物的支原体之间有明显的交叉反应，因此不适用采用全菌作为抗原用于血清学诊断技术的建立。

粘附素不仅是支原体重要的毒力因子，同时也是最为重要的免疫原。Falong Y等(Falong Y,Cheng T,Yong W,Huanrong Z,and Hua Y.Genome sequence of Mycoplasmaovipneumoniae strain SC01.Journal of Bacteriology,2011,193(18):5018.)，首次对绵羊肺炎支原体的全基因组序列测定，并经功能预测后发现了编码粘附素的蛋白P113，并将其作为建立血清学诊断技术的重要研究对象。

间接血凝试验作为一种血清型检测方法，具有较好的灵敏度和特异性，而且操作简单，不需要大型仪器，比较适用于临床中疾病的诊断和血清抗体的检测。近年来，在我国就有研究者利用牛支原体重组蛋白p48建立了检测牛支原体的间接血凝技术。也有基于重组OppA的间接血凝试验检测副猪嗜血杆菌抗体的研究报告。就目前而言，在我国养殖业集约化管理的趋势下，快速诊断的方式对于疾病的防控特别是基层具有重大意义。

综上所述，对绵羊肺炎支原体感染的诊断方法分为三类：第一，病原分离鉴定，这是传统的诊断方法，也可认为是“金标准”，但由于受到一些抗生素的影响，而且支原体生长速度缓慢，对营养要求苛刻，培养周期长，导致分离培养十分困难，难作为检测方法；第二，虽然目前已建立了相应的特异性PCR技术，荧光定量PCR技术,但PCR方法需要操作人员有较高的技术水平，而且成本较高，相对仍然较为费时，也不适用于常规临床诊断和流行病学调查；第三，国内虽然有采用全菌抗原建立ELISA方法及HA技术的报道，但国外有研究表明，支原体以及副猪嗜血杆菌的全菌抗原与其他感染动物的相应病原之间有明显的交叉反应。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法，该方法通过克隆表达绵羊肺炎支原体黏附素基因p113的C端重组蛋白，并以该蛋白作为抗原致敏健康绵羊红细胞，通过筛选抗原的最佳致敏浓度，以及最适的反应条件，建立特异性强，敏感性好，符合率高的绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法；该方法将操作简单不借助特殊设备，可以实现基层工作的快速检测，为疫病防控提供有力工具。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法，包括以下步骤：

1)制备绵羊肺炎支原体抗原；

2)制备绵羊红细胞并进行致敏处理；

3)使用不同重组蛋白稀释浓度的绵羊肺炎支原体抗原致敏红细胞测定同一批血清的IHA血清效价，并确定最高血清效价所对应的抗原稀释度；

4)利用步骤3)中稀释度确定间接血凝检测方法的反应条件和反应体系，建立绵羊肺炎支原体的间接血凝检测方法。

可选地，步骤1)中的制备绵羊肺炎支原体抗原具体为：诱导表达纯化绵羊肺炎支原体黏附素基因p113的C端重组蛋白工程菌，作为抗原，所述抗原的蛋白浓度为164μg/ml。

可选地，所述步骤2)中的制备绵羊红细胞具体为：无菌采取健康绵羊颈静脉血等体积加入灭菌的阿氏液，置于4℃冰箱静置，之后用纱布过滤，3000rmp\min离心10imn，弃去上清，反复洗涤5次，配制成5％的红细胞悬液；将5％红细胞悬液于磁力搅拌器上以低转速进行搅拌，并且逐滴加入1/5体积的2.5％的戊二醛,醛化5个小时。取1：20 000鞣酸加入到等体积的5％的醛化红细胞悬液中震荡混匀，37℃孵育30min，用pH6.4的PBS洗涤3次，洗涤完毕后，用PH7.2的PBS恢复到原体积，制备得到浓度为5％的绵羊红细胞。

可选地，对绵羊红细胞进行致敏处理具体为：以1:20、1:40、1:80、1:160、1:320共5个稀释度用来稀释抗原,让其分别与等量5％醛化鞣酸化红细胞混合，37℃水浴致敏60min,用含1％BSA的0.15mol/L pH7.2的PBS洗2次后，再用此稀释液配成1％的致敏红细胞悬液，用此五个浓度抗原致敏的红细胞分别检测绵羊肺炎支原体的阳性血清。

可选地，致敏浓度为4.1μg/ml。

可选地，所述步骤3)中的抗原稀释度为1:40。

可选地，步骤4)中的反应体系为50μL体系。

可选地，步骤4)中的反应条件是在室温条件下反应30min。

本发明还公开了一种由上述的方法建立的绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法在绵羊肺炎支原体检测中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本方法特异性强，敏感性好，符合率高。

2)本方法操作简单，不需要特殊设备，能检测快速，适合在基层工作中推广。

3)本方法结果判断直观，肉眼可观。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明诱导表达蛋白电泳图；其中，M代表蛋白Marker，I代表诱导表达产物；

图2是本发明蛋白浓度测定标准曲线。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1绵羊肺炎支原体抗体间接血清检测方法的建立

1.材料

(1)血清和菌株：绵羊肺炎支原体的阳性血清和绵羊肺炎支原体阴性血清、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血曼氏杆菌阳性血清以及丝状支原体山羊亚种血清、猪肺炎支原体阳性血清、丝状支原体丝状亚种血清均为现有材料，由西南民族大学动物医学实验室-20℃保存；大肠杆菌、沙门氏菌因子血清购自四川省生物制品研究所；绵羊肺炎支原体黏附素基因p113的C端重组工程菌(杨发龙,张贤宇,汤承,等.绵羊肺炎支原体P113蛋白C端重复区的表达及其免疫原性[J].中国兽医科学,2013(7):733-737.)由西南民族大学动物医学实验室-20℃保存。

(2)绵羊红细胞：采自成都某屠宰场健康绵羊。

(3)主要试剂

50％戊二醛、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、KCl、柠檬酸、葡萄糖、柠檬酸钠、鞣酸购自成都市科龙化工试剂厂；96孔微量反应板购自上海都宜生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉由购自OXOID公司；牛血清白蛋白(BSA)购自roche公司；蛋白Marker，购自TaKaRa公司；BCA改良型蛋白定量试剂盒，购自生工生物工程有限公司；PVDF电泳膜，购自碧云天生物技术研究所。

(4)主要仪器

96孔微量反应板(上海都宜生物科技有限公司)；恒温水浴器(中国江苏国华电器)；凝胶成像***VerSa Doc2000(美国Bio-Rad公司)。

2.方法

(1)抗原的制备

①绵羊肺炎支原体粘附素基因p113的C端的诱导表达

挑取冻干保存的绵羊肺炎支原体黏附素基因p113的重组蛋白表达工程菌，接种于LB液体培养基中，37℃摇床160rmp/min振荡培养过夜。将该悬液均匀涂布于含100mg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基上，37℃温箱培养12～18h。挑取固体培养基上的单菌落，接种于1ml LB液体培养基中，37℃摇床160rmp/min振荡培养约8h做为种子液。将种子液按1:100的比例接种于含Amp的100mL LB液体培养基，37℃摇床160rmp/min振荡培养7-8h，此时肉眼应可见浑浊。按1:1000的比例加1moL/L的IPTG，16℃摇床160rmp/min振荡培养约24h，加入3％～4％的丙酮160rmp/min振荡培养约12h。收集菌液，10000rmp离心5min，倒掉上清液，按1:10的比例加入PBS重悬混匀，如此反复三次。将10mL细菌重悬液置冰盒中超声破碎，破碎1h后10000rmp/min离心5min。弃上清，10mLPBS重悬，取100ul重悬液加入5×SDS上样缓冲液25ul，100℃水浴5min，SDS-PAGE电泳，观察目的蛋白的表达情况。

将表达绵羊肺炎支原体黏附素基因p113的C端重组蛋白的工程菌超声波破碎后，SDS-PAGE电泳，在44KD处有目的条带，和p113蛋白大小一致，如图1所示。

②绵羊肺炎支原体黏附素基因p113的C端重组蛋白的纯化

将破碎菌体重悬液进行SDS-PAGE电泳，电泳完成后取下凝胶放入干净的平皿中，用0.25mol/L的KCl溶液染色30min，切下染色后呈白色的目的条带，用PBS冲洗干净后将其研磨成糊状，加入等体积的PBS混匀，10000rmp\min离心10min，上清液即为纯化的重组蛋白，经SDS-PAGE电泳检测其纯度。

③重组蛋白浓度的测定

收集纯化后的p113重组蛋白，用改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒分别测定标准蛋白和重组蛋白的OD值，利用标准蛋白的OD值制作的标准曲线，计算线性回归方程，将重组蛋白的OD值代入方程计算重组蛋白浓度。测定浓度后重组蛋白于-80℃保存。

利用标准蛋白的OD值制作的标准曲线相关系数为R²＝0.9993，回归方程为y＝0.0337x+0.1078，见图2。纯化重组蛋白p113样品的OD562nm值为0.218，代入方程计算出其含量为164μg/ml。

(2)致敏绵羊红细胞的制备

①绵羊红细胞的采集与洗涤

无菌采取健康绵羊颈静脉血等体积加入灭菌的阿氏液，置于4℃冰箱静置，之后用纱布过滤，3000rmp\min离心10imn，弃去上清，用pH7.2的PBS重悬再离心，如此反复洗涤5次，配制成5％的红细胞悬液，4℃保存，1周内使用。

②红细胞的醛化和鞣酸化

将5％红细胞悬液于磁力搅拌器上以低转速进行搅拌，并加入1/5体积的2.5％的戊二醛，搅拌10min，然后于30℃，150rmp/min恒温振荡器中振荡醛化5个小时。醛化后红细胞悬液以3000rmp\min离心5min，弃上清液，用pH7.2的PBS重悬洗涤3次，并恢复到原体积。然后取1：20 000鞣酸加入到等体积的质量浓度为5％的醛化红细胞悬液中震荡混匀，37℃水浴锅中孵育30min，用pH6.4的PBS洗涤3次，洗涤完毕后，用PH7.2的PBS恢复到原体积。

③醛化红细胞的自凝检测

取少量醛化的5％的红细胞稀释至1％，在96孔V型血凝板上任选一排,稀释液、阴性血清各4孔，每孔各滴入25μL，每孔滴加25μL，置振荡器上混匀，室温下放置30min～1h，观察红细胞是否凝集。

醛化后的红细胞从外观上看为巧克力色，状态稳定，静置后液体分为上下两层，上层为无色透明的液体，下层为绵羊红细胞泥，轻轻震摇形成均匀的红细胞悬液。在加入阴性血清的96孔V型板孔中没有出现自凝现象。

④绵羊红细胞的致敏：

将0.15mol/L pH7.2的PBS倍比稀释为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320共5个稀释度用来稀释抗原，让其分别与等量5％醛化鞣酸化红细胞混合，37℃水浴致敏60min,其间3～5min振荡一次，致敏后3 000rmp/min离心3min，弃上清，用含1％BSA的0.15mol/L pH7.2的PBS洗2次后,再用此稀释液配成1％的致敏红细胞悬液,用此五个浓度抗原致敏的红细胞分别检测进过2倍倍比稀释的绵羊肺炎支原体的阳性血清，观察IHA凝集现象，判断凝集结果(表1)。选择绵羊肺炎支原体阳性血清效价最高的作为最佳致敏浓度抗原建立间接血凝检测方法。

表1结果判定标准

实施例2筛选该方法的最佳反应体系以及条件

①筛选最佳反应体系

在96孔V型板上任选两排，在第一排每孔加入10μL稀释液，并在第一孔加入10μL绵羊肺炎支原体阳性血清，然后对阳性血清进行倍比稀释，最后每孔加入以最佳致敏浓度致敏后的抗原10μL。第二排每孔加入25μL稀释液，第一孔加入25μL绵阳肺炎支原体阳性血清，然后对阳性血清进行倍比稀释，稀释后每孔加入以最佳致敏浓度致敏后的抗原25μL。将96孔V型反应板置于振荡器上震荡1至2min后，室温反应30min至1h，分别记录两组实验阳性血清反应结果。

以五个浓度梯度p113重组蛋白致敏的醛化红细胞悬液分别检测标准阳性血清，结果显示40倍(4.1μg/ml)稀释的p113重组蛋白致敏的醛化红细胞检测阳性血清凝集价可达到2⁸，各抗原稀释倍数的凝集价见表1。

由表2可见，按照最佳致敏浓度的判定标准，4.1μg/ml作为本研究的最佳致敏浓度用于后续建立绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法。

表2

分别以20μl、50μl反应体系进行间接血凝试验结果见表3。

由表3可以看出20μL和50μL体系所测的效价虽然一样，但是由于20μL体系在凝集时产物较少，现象不明显，凝集颜色较浅，甚至有个别孔低出现微小的空斑，整体的凝集反应相比50μL体系更难以观察。所以，50μL体系为最适反应体系。

表3

②筛选最佳反应条件

取两块96孔V型反应板，每块反应板上任选两排按照筛选出的反应体系进行间接血凝试验，待震荡混匀后，每块板均用塑料薄膜封住防止水分蒸发。第一块反应板置于室温，第二块反应板置于37℃恒温培养箱中，每隔10min观察一次，直到加有阳性血清的孔不再发生凝集反应，空白孔完全沉于孔底，记录反应时间。

对反应条件的筛选主要是对反应温度和反应时间的确定，针对这两个条件，将两组96孔V型板分别放在室温以及37℃下得出如表4、表5、表6结果。

置于室温下的间接血凝试验组10min时无明显细胞凝集现象。20min时有部分孔出现了红细胞凝集，但此时空白组的红细胞并没有完全沉降与孔底。30min时空白组红细胞完全沉降于孔底，阳性组凝集现象明显，并且凝集产物不增加，此时可读得血清效价为2⁸。

置于37℃下的间接血凝实验组10min时就已经出现了红细胞凝集现象，但空白组红细胞没有完全沉降在孔底。20min时空白组的红细胞完全沉降于孔底，但是此时已经错过了对阳性组观察的最佳时间，部分阳性孔孔底已经出现微小圆孔，此时读得血清效价为2⁶。

总上所述，间接血凝的最佳反应温度为室温，最佳反应时间为30min。

表4

表5

表6

实施例3对建立的方法特异性、敏感性以及符合率的性能评价

①特异性评价

以最适致敏浓度，优化后的反应条件分别对大肠杆菌(E.Coli)多因子血清、沙门氏菌(SE)多因子血清及多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(SA)和丝状支原体山羊亚种血清、溶血曼氏杆菌血清及猪肺炎支原体血清进行检测，当出现“++”及以上凝集强度时判断为阳性，记录反应结果。

对大肠杆菌(E.Coli)多因子血清、沙门氏菌(SE)多因子血清及多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(SA)和丝状支原体丝状亚种、丝状支原体山羊亚种血清、溶血曼氏杆菌血清及猪肺炎支原体血清进行检测的结果如下表4。

表7

②敏感性评价

以最适致敏浓度，优化后的反应条件利用该间接血凝方法对本实验室收集整理的58份血清进行检测，当出现“++”及以上凝集强度时判断为阳性，记录其结果并与实验室自己建立的全菌蛋白包被间接ELISA方法检测结果做对比。进行统计学计算。

③符合率评价

同时，以最适致敏浓度，优化后的反应，用该间接血凝技术对免疫后7d、14d、28d以及42d的20份血清进行了检测，当出现“++”及以上凝集强度时判断为阳性，并且记录结果，统计阳性率。

使用间接血凝与绵羊肺炎支原体全菌蛋白包被间接ELISA方法检测结果做对比时，在对8份健康未感染血清进行检测时，间接血凝检出0份阳性，ELISA方法检出0份阳性；对50份感染阳性血清进行检测时，间接血凝方法检出49份阳性，ELISA方法检出46份阳性；对比两种方法其敏感性为93.88％，诊断符合率为91.66％，假阳性率为18.18％，假阴性率为6.12％。同时，对免疫后7d、14d、28d以及42d的20份羊血清进行了检测，结果如下表5。

表8

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备绵羊肺炎支原体抗原；

2)制备绵羊红细胞并进行致敏处理；

3)使用不同重组蛋白稀释浓度的绵羊肺炎支原体抗原致敏红细胞测定同一批血清的IHA血清效价，并确定最高血清效价所对应的抗原稀释度；

4)利用步骤3)中稀释度确定间接血凝检测方法的反应条件和反应体系，建立绵羊肺炎支原体的间接血凝检测方法。

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤1)中的制备绵羊肺炎支原体抗原具体为：诱导表达纯化绵羊肺炎支原体黏附素基因p113的C端重组蛋白工程菌，作为抗原，所述抗原的蛋白浓度为164μg/ml。

3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤2)中的制备绵羊红细胞具体为：无菌采取健康绵羊颈静脉血等体积加入灭菌的阿氏液，置于4℃冰箱静置，之后用纱布过滤，3000rmp\min离心10imn，弃去上清，反复洗涤5次，配制成5％的红细胞悬液；将5％红细胞悬液于磁力搅拌器上以低转速进行搅拌，并且逐滴加入1/5体积的2.5％的戊二醛,醛化5个小时。取1：20 000鞣酸加入到等体积的5％的醛化红细胞悬液中震荡混匀，37℃孵育30min，用pH6.4的PBS洗涤3次，洗涤完毕后，用PH7.2的PBS恢复到原体积，制备得到浓度为5％的绵羊红细胞。

4.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，对绵羊红细胞进行致敏处理具体为：以1:20、1:40、1:80、1:160、1:320共5个稀释度用来稀释抗原,让其分别与等量5％醛化鞣酸化红细胞混合，37℃水浴致敏60min,用含1％BSA的0.15mol/L pH7.2的PBS洗2次后，再用此稀释液配成1％的致敏红细胞悬液，用此五个浓度抗原致敏的红细胞分别检测绵羊肺炎支原体的阳性血清。

5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，致敏浓度为4.1μg/ml。

6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤3)中的抗原稀释度为1:40。

7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤4)中的反应体系为50μL体系。

8.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤4)中的反应条件是在室温条件下反应30min。

9.一种权利要求1-8中任一权利要求所述的方法建立的绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法在绵羊肺炎支原体检测中的应用。

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